新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)亞洲璃眼蜱攜帶病原菌研究

包子豪，張 琳，侯學(xué)霞，段立科,2，王遠(yuǎn)志，郝 琴

蜱屬于節(jié)肢動(dòng)物門(mén)(Arthropoda)蛛形綱(Arachida)寄螨目(Parasitiformes)蜱總科(Ixodoidea)，下設(shè)硬蜱科(Ixodidae)、軟蜱科(Argasidae)和僅有一種存在于非洲南部的納蜱科(Nuttalliellidae)[1]。目前，中國(guó)發(fā)現(xiàn)蜱類(lèi)有硬蜱科和軟蜱科兩大類(lèi)，共包含9屬129種，約占全球蜱類(lèi)總數(shù)的13%[2]。據(jù)報(bào)道，中國(guó)大陸地區(qū)自1982年起，已發(fā)現(xiàn)33種蜱類(lèi)相關(guān)病原體，主要包括病毒、細(xì)菌、原生動(dòng)物等[3]。新疆維吾爾自治區(qū)位于中國(guó)西北地區(qū)，地域廣闊且地質(zhì)地貌復(fù)雜多樣，是中國(guó)各類(lèi)蜱傳疾病的重要自然疫源地。自20世紀(jì)50年代起，新疆地區(qū)已發(fā)現(xiàn)或記載的蜱類(lèi)共2科9屬45種，其中亞洲璃眼蜱(Hyalommaasiaticumasiaticum)分布廣泛，準(zhǔn)噶爾盆地、塔里木盆地、東疆盆地等地均有報(bào)道[4]?？κ驳貐^(qū)位于新疆西南端，與5個(gè)國(guó)家接壤，并有6個(gè)國(guó)家一類(lèi)口岸對(duì)外開(kāi)放，人流與物流來(lái)往頻繁，十分適宜各種蜱傳疾病的傳播，且大多數(shù)蜱傳疾病臨床癥狀缺乏特異性，鑒別診斷有一定困難。本次研究涉及6種常見(jiàn)蜱傳病原菌，包括伯氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferisensulato)、米氏疏螺旋體(Borreliamiyamotoi)、嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體(Anaplasmaphagocytophilum)、貝納柯克斯體(Coxiellaburnetii)、斑點(diǎn)熱群立克次體(Spottedfevergrouprickettsia)、查菲埃立克體(Ehrlichiachaffeensis)，分別可引起萊姆病(Lyme disease)、回歸熱(relapsing fever)、人粒細(xì)胞無(wú)形體病(Human granulocytic anaplasmosis,HGA)、Q熱(Q fever)、斑點(diǎn)熱(spotted fever)、人單核細(xì)胞埃立克體病(Human monocytic ehrlichiosis,HME)[5]。鑒于許多蜱傳疾病的非特異性癥狀，了解喀什地區(qū)亞洲璃眼蜱所攜帶病原菌種類(lèi)及感染狀況對(duì)當(dāng)?shù)仳鐐骷膊〉姆揽鼐哂惺种匾囊饬x。本研究基于高通量測(cè)序和PCR法就新疆喀什地區(qū)亞洲璃眼蜱及其攜帶細(xì)菌開(kāi)展初步調(diào)查研究，為喀什地區(qū)蜱傳病原體監(jiān)測(cè)及蜱傳疾病防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣本采集 在新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)巴楚縣選用布旗法收集游離蜱，置于通氣、濕潤(rùn)的瓶中帶回實(shí)驗(yàn)室，于解剖鏡2～4倍視野下對(duì)蜱種分類(lèi)鑒定后進(jìn)行DNA的提取。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 DNeasy Blood &Tissue Kit，凱杰企業(yè)管理(上海)有限公司產(chǎn)品；2×Taq PCR Master Mix(Dye,CW0682L)，江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖，法國(guó)Biowest公司產(chǎn)品；5×TBE緩沖液，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；GoldenView，北京艾德萊生物科技有限公司產(chǎn)品；100 bp Ladder DNA Marker，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 組織研磨器G20/G50，北京金銀杏生物科技有限公司產(chǎn)品；PCR儀LabCycler Standard P，德國(guó)Sensoquest公司產(chǎn)品；電泳儀、電泳槽EPS301/HE33，美國(guó)GE公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)Centrifuge 5424 R，德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；恒溫水浴箱TW8，德國(guó)JULABO公司產(chǎn)品；凝膠成像儀Geldoc XR+，美國(guó)Bio-rad公司產(chǎn)品。

1.2 方 法

1.2.1 蜱種鑒定 根據(jù)蜱的形態(tài)學(xué)特征對(duì)蜱種進(jìn)行初步鑒定，再對(duì)蜱的線粒體 16S rDNA進(jìn)行檢測(cè)[6]，通過(guò)測(cè)序分析準(zhǔn)確鑒定蜱種。蜱的線粒體 16S rDNA引物及反應(yīng)條件見(jiàn)表1。陽(yáng)性PCR產(chǎn)物送交奧科鼎盛生物科技有限公司測(cè)序。序列使用NCBI的BLAST工具與GenBank中的參考序列進(jìn)行比對(duì)分析。綜合形態(tài)學(xué)特征，判斷蜱的種類(lèi)。

表1 蜱線粒體16S rDNA檢測(cè)所用引物Tab.1 Target primers and PCR conditions of tick mitochondrial 16S rDNA

1.2.2 蜱基因組DNA提取 從342只蜱中隨機(jī)選取114只蜱提取DNA，所有蜱標(biāo)本用75%酒精浸泡3～5 min并充分洗滌后，再用超純水漂洗3次，每管1只分裝于1.5 mL EP管中，使用組織研磨器逐一對(duì)蜱分裝樣本進(jìn)行研磨，采用DNeasy Blood &Tissue Kit 試劑盒提取基因組DNA，提取步驟參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。提取產(chǎn)物分裝為兩部分，一部分用于PCR檢測(cè)，每管僅有單只蜱DNA，共114個(gè)樣本，記為XK(新疆喀什)組，即單只組；另一部分用于高通量測(cè)序，每管混有3～4只蜱的DNA，共37個(gè)樣本，記為K(喀什)組，即混合組。分裝樣本于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 16S rDNA V3-V4高變區(qū)的高通量測(cè)序及分析 將混合組(K組)送至百邁客生物科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。測(cè)序基于 Illumina Novaseq 測(cè)序平臺(tái)，使用雙末端測(cè)序(Paired-End)法構(gòu)建小片段文庫(kù)。對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控，包括低質(zhì)量過(guò)濾、長(zhǎng)度過(guò)濾，得到高質(zhì)量序列。將高質(zhì)量序列進(jìn)行聚類(lèi)/去噪，將相似度97%以上的序列劃分為一個(gè)操作分類(lèi)單元(operational taxonomic unit,OTU)，并根據(jù)OTU的序列組成得到其物種分類(lèi)。通過(guò)Alpha多樣性分析研究單個(gè)樣品內(nèi)部的物種多樣性，統(tǒng)計(jì)了各樣品的Shannon及Simpson指數(shù)，利用 Mothur 軟件和R語(yǔ)言工具依據(jù)各樣品的測(cè)序量在不同測(cè)序深度時(shí)的Shannon指數(shù)(反映樣品中微生物多樣性的指數(shù))繪制Shannon多樣性指數(shù)稀釋曲線，利用R語(yǔ)言工具依據(jù)各樣本OTU數(shù)及注釋到的物種數(shù)量繪制物種累積曲線圖?；贠TU分析結(jié)果，對(duì)樣品在各個(gè)分類(lèi)水平上進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析，獲得各樣品在門(mén)、綱、目、科、屬、種分類(lèi)學(xué)水平上的物種相對(duì)豐度水平并繪制物種豐度柱狀圖，確定喀什地區(qū)蜱攜帶的微生物種類(lèi)及病原菌的感染狀況。

1.2.4 常見(jiàn)蜱傳病原菌的PCR檢測(cè) 結(jié)合高通量測(cè)序結(jié)果，針對(duì)蜱種帶菌特征及新疆常見(jiàn)蜱媒病原菌分布情況[3,6-9]，采用分子檢測(cè)方法對(duì)單只組(XK組)進(jìn)行6種病原菌檢測(cè)(表2)。

表2 病原菌檢測(cè)靶基因、引物及PCR反應(yīng)條件Tab.2 Target genes,primers and PCR conditions of pathogens

1.2.5 PCR產(chǎn)物檢測(cè)及一代測(cè)序分析 取5 μL PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。陽(yáng)性產(chǎn)物送交奧科鼎盛生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)得堿基序列使用NCBI的BLAST工具進(jìn)行同源性比對(duì)分析，下載GenBank中目的基因相關(guān)的參考序列，與測(cè)得堿基序列共同進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

使用MEGA 11.0軟件，采用clustalW法對(duì)核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，采用bootstrap=1 000的鄰接算法(neighbor joining,NJ)對(duì)比對(duì)后序列進(jìn)行聚類(lèi)分析。

2 結(jié) 果

2.1 蜱的種類(lèi) 本次實(shí)驗(yàn)共采集蜱342只，形態(tài)學(xué)鑒定如圖1。所有蜱形態(tài)高度相似，初步鑒定均為璃眼蜱屬。隨機(jī)選取5只蜱進(jìn)行16S rDNA序列分析比對(duì)，本次實(shí)驗(yàn)所采得蜱均為璃眼蜱屬的亞洲璃眼蜱，詳見(jiàn)圖2。

1：雌蜱全身(背部)；2：雌蜱頭部(背部)；3：雌蜱全身(腹部)；4：雌蜱頭部(腹部)；5：雄蜱全身(背部)；6：雄蜱頭部(背部)；7：雄蜱全身(腹部)；8：雄蜱頭部(腹部) 圖1 喀什地區(qū)亞洲璃眼蜱的形態(tài) Fig.1 Morphology of Hyalomma asiaticum asiaticum from Kashgar Prefecture

圖2 喀什地區(qū)亞洲璃眼蜱16S rDNA序列聚類(lèi)分析Fig.2 Cluster analysis of Hyalomma asiaticum asiaticum 16S rDNA from Kashgar Prefecture

2.2 亞洲璃眼蜱病原菌群落分析

2.2.1 16S rDNA V3-V4區(qū)測(cè)序結(jié)果及Alpha多樣性分析 37個(gè)混合樣本測(cè)序共得到高質(zhì)量的clean reads 2 949 126條，每個(gè)樣本的平均高質(zhì)量clean reads數(shù)為79 706條；37個(gè)樣本的細(xì)菌總OTU數(shù)為1 439個(gè)，平均每個(gè)樣本OTU數(shù)為1 243個(gè)。樣本Alpha多樣性反映的是單個(gè)樣品物種豐度及物種多樣性，其中Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)用于衡量物種多樣性。除K1外，其余樣本多樣性均較高(Simpson指數(shù)>0.80)，所有樣本coverage指數(shù)均大于0.99，說(shuō)明蜱樣本文庫(kù)中序列未被檢出的概率低。Shannon多樣性指數(shù)稀釋曲線如圖3，當(dāng)曲線趨向平坦時(shí)，提示測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，特征種類(lèi)不會(huì)再隨測(cè)序量增加而增長(zhǎng)。屬水平物種累積曲線圖如圖4，紅色箱型組成累積曲線，綠色箱型組成共有曲線，在一定范圍內(nèi)，當(dāng)曲線趨于平緩，提示抽樣充分，適合進(jìn)行分析。

圖3 喀什地區(qū)37個(gè)混合蜱樣本的Shannon Index曲線Fig.3 Shannon index rarefaction curves of 37 mixed tick specimens from Kashgar Prefecture

圖4 喀什地區(qū)37個(gè)混合蜱樣本的屬水平物種累積曲線圖Fig.4 Genus level species accumulation curve of 37 mixed tick specimens from Kashgar Prefecture

2.2.2 樣本群落結(jié)構(gòu)分析 對(duì)37個(gè)混合樣本攜帶的物種數(shù)量和豐度進(jìn)行分析，基于OTU分析結(jié)果作門(mén)、綱、目、科、屬、種水平下的物種豐度柱狀圖(圖5)。37個(gè)樣本在門(mén)水平下分析，至少含有29個(gè)門(mén)的微生物，其中變形菌門(mén)(Proteobacteria)在所有樣本均有檢出且含量最高，物種豐度為42.8%～83.1%。在綱水平下分析，至少含有73個(gè)綱的微生物，γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)在所有樣本中均有檢出且含量最高，物種豐度為38.7%～81.5%。α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)和螺旋體綱(Spirochaetia)在所有樣本中也均有檢出。在目水平下分析，至少含有173個(gè)目的微生物，立克次體目(Rickettsiales)和螺旋體目(Spirochaetales)在所有樣本中均有檢出，立克次體目物種豐度為0.5%～6.7%，螺旋體目物種豐度均較低，為0.02%～0.13%。有31個(gè)樣本檢出軍團(tuán)菌目(Legionellales)。在科水平下分析，至少含有306個(gè)科的微生物，螺旋體科(Spirochaetaceae)和立克次體科(Rickettsiaceae)在所有樣本中均有檢出，螺旋體科物種豐度與螺旋體目保持一致，立克次體科物種豐度為0.001%～0.046%，16個(gè)樣本檢出無(wú)形體科(Anaplasmataceae)，10個(gè)樣本檢出柯克斯體科(Coxiellaceae)。在屬水平下分析，至少含有506個(gè)屬的物種，無(wú)形體屬(Anaplasma)、立克次體屬(Rickettsia)、柯克斯體屬(Coxiella)檢出情況與其對(duì)應(yīng)科水平一致，埃立克體屬(Ehrlichia)和疏螺旋體屬(Borrelia)未被檢出。在種水平下分析，6種關(guān)注的病原菌中僅有1個(gè)樣本檢出貝納柯克斯體，其余均未檢出。

A：門(mén)水平物種豐度柱狀圖；B：綱水平物種豐度柱狀圖；C：目水平物種豐度柱狀圖；D：科水平物種豐度柱狀圖；E：屬水平物種豐度柱狀圖；F：種水平物種豐度柱狀圖圖5 喀什地區(qū)37個(gè)混合蜱樣本的物種豐度柱狀圖Fig.5 Histogram of species abundance of 37 mixed tick specimens from Kashgar Prefecture

2.3 PCR檢測(cè)結(jié)果 對(duì)XK組114只亞洲璃眼蜱樣本DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，其中14只蜱檢出伯氏疏螺旋體目的基因片段，7只蜱檢出米氏疏螺旋體目的基因片段，3只蜱檢出嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體目的基因片段，2只蜱檢出貝納柯克斯體目的基因片段，查菲埃立克體基因與斑點(diǎn)熱群立克次體基因檢測(cè)均為陰性。各蜱樣本均不存在混合感染。詳見(jiàn)圖6。

A：伯氏疏螺旋體5S-23S基因間隔區(qū)；B：米氏疏螺旋體glpQ基因；C：嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體16S rDNA；D：貝納柯克斯體IS1111基因；1-22為不同蜱樣本；M為DNA marker；P為陽(yáng)性對(duì)照；N為陰性對(duì)照。圖6 喀什地區(qū)蜱樣本PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.6 PCR results of tick samples from Kashgar Prefecture

2.3.1 伯氏疏螺旋體5S-23S基因間隔區(qū)序列分析 喀什地區(qū)亞洲璃眼蜱中伯氏疏螺旋體5S-23S基因間隔區(qū)序列通過(guò)BLAST比對(duì)分析，XK1與Genbank中Borreliellaafzelii同源性為100%；XK4與Borreliagarinii同源性為100%；XK20、XK21、XK28、XK29、XK36、XK37、XK40、XK44、XK45、XK47、XK56、XK60與Borreliavalaisiana同源性較高(99%～100%)。詳見(jiàn)圖7。

圖7 喀什地區(qū)亞洲璃眼蜱中伯氏疏螺旋體5S-23S基因間隔區(qū)序列聚類(lèi)分析Fig.7 Cluster analysis of the Borrelia burgdorferi sensu lato 5S-23S rDNA intergenic spacer in Hyalomma asiaticum asiaticum from Kashgar Prefecture

2.3.2 米氏疏螺旋體glpQ基因序列分析 喀什地區(qū)亞洲璃眼蜱中米氏疏螺旋體glpQ基因序列通過(guò)BLAST比對(duì)分析，XK6、XK7、XK22、XK41、XK59、XK65、XK67與中國(guó)和俄羅斯的全溝硬蜱中米氏疏螺旋體的同源性較高。詳見(jiàn)圖8。

圖8 喀什地區(qū)亞洲璃眼蜱中米氏疏螺旋體glpQ基因序列聚類(lèi)分析Fig.8 Cluster analysis of the Borrelia miyamotoi glpQ gene in Hyalomma asiaticum asiaticum from Kashgar Prefecture

2.3.3 嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體16S rDNA序列分析 喀什地區(qū)亞洲璃眼蜱中嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體16S rDNA序列通過(guò)BLAST比對(duì)分析，XK85與新疆的圖蘭扇頭蜱中嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體的同源性較高，XK50、XK66與新疆的狗和璃眼蜱中嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體的同源性較高。詳見(jiàn)圖9。

圖9 喀什地區(qū)亞洲璃眼蜱中嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體16S rDNA序列聚類(lèi)分析Fig.9 Cluster analysis of Anaplasma phagocytophilum 16S rDNA in Hyalomma asiaticum asiaticum from Kashgar Prefecture

2.3.4 貝納柯克斯體IS1111基因序列分析 喀什地區(qū)亞洲璃眼蜱中貝納柯克斯體IS1111基因序列通過(guò)BLAST比對(duì)分析，XK34、XK51與新疆的鼠、新疆和澳大利亞的人血中的貝納柯克斯體同源性較高。詳見(jiàn)圖10。

圖10 喀什地區(qū)亞洲璃眼蜱中貝納柯克斯體IS1111基因序列聚類(lèi)分析Fig.10 Cluster analysis of the Coxiella burnetii IS1111 gene in Hyalomma asiaticum asiaticum from Kashgar Prefecture

3 討 論

喀什地區(qū)位于新疆西南端，地處塔里木盆地西側(cè)，東臨塔克拉瑪干沙漠，蜱分布十分廣泛，璃眼蜱屬、扇頭蜱屬、鈍緣蜱屬、革蜱屬、盲花蜱屬等蜱類(lèi)均有分布，且其中璃眼蜱屬和扇頭蜱屬分布較為優(yōu)勢(shì)[16-18]。本次研究選取新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)巴楚縣采用布旗法所采得游離蜱342只，經(jīng)形態(tài)學(xué)及16S rDNA鑒定均為亞洲璃眼蜱。該蜱為三宿主蜱，成蟲(chóng)的主要宿主為大中型有蹄類(lèi)動(dòng)物如駱駝和羊，小型哺乳動(dòng)物如嚙齒類(lèi)動(dòng)物及鳥(niǎo)類(lèi)則為其中間宿主或機(jī)會(huì)宿主[19]。亞洲璃眼蜱在新疆乃至中國(guó)分布廣泛，目前已從該蜱種中檢出多種病原體，如新疆出血熱病毒(Xinjiang hemorrhagic fever virus)、立克次體、嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體、查菲埃立克體、伯氏疏螺旋體、巴貝斯蟲(chóng)(Babesiamicroti)等[20]。

伯氏疏螺旋體作為萊姆病的病原體，目前已經(jīng)于中國(guó)23個(gè)省(直轄市、自治區(qū))的蜱或宿主動(dòng)物中分離獲得，且不同地區(qū)的基因型分布具有明顯差異[21]。米氏疏螺旋體在進(jìn)化上更接近回歸熱螺旋體(Borreliarecurrentis)，但與伯氏疏螺旋體有著相同的宿主和傳播媒介[22]。本次研究通過(guò)PCR法檢出14只蜱攜帶伯氏疏螺旋體，包括B.garinii、B.afzelii和B.valaisiana基因型，其中B.garinii和B.afzelii均為致病基因型，B.valaisiana基因型為新疆首次報(bào)道，其致病性目前尚未明確。7只蜱攜帶米氏疏螺旋體，據(jù)報(bào)道目前我國(guó)僅在黑龍江和山西發(fā)現(xiàn)米氏疏螺旋體[23-24]，米氏疏螺旋體在新疆喀什地區(qū)為首次發(fā)現(xiàn)，提示喀什地區(qū)應(yīng)進(jìn)一步開(kāi)展對(duì)伯氏疏螺旋體和米氏疏螺旋體的媒介、宿主及人群感染情況的調(diào)查研究。

無(wú)形體屬與埃立克體屬同屬于無(wú)形體科，無(wú)形體屬中嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體為其主要致病種，可引起人粒細(xì)胞無(wú)形體病[25]，埃立克體屬中查菲埃立克體為其主要致病種，可引起人單核細(xì)胞埃立克體病[9]。本次研究中查菲埃立克體在16S rDNA V3-V4區(qū)高通量測(cè)序及PCR檢測(cè)中均未檢出，嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體在16S rDNA V3-V4區(qū)高通量測(cè)序中只能鑒定到屬一級(jí)水平，缺少進(jìn)一步數(shù)據(jù)，而PCR檢測(cè)檢出3只蜱攜帶該病原體。嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體因棲息地及貯存宿主不同，在致病性及16S rDNA多樣性上均有所差異[12]。對(duì)該病原體陽(yáng)性樣本擴(kuò)增序列進(jìn)行聚類(lèi)分析表明，喀什地區(qū)嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體與中國(guó)山羊及犬體內(nèi)病原體具有較高的同源性。

斑點(diǎn)熱群立克次體屬于立克次體屬，可引起人斑點(diǎn)熱，常由蜱或螨叮咬傳播[26]。結(jié)合16S rDNA V3-V4區(qū)高通量測(cè)序及PCR擴(kuò)增結(jié)果，所有樣本均為陰性。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，弗朗西斯菌屬內(nèi)共生體(Francisella-like endosymbionts)與斑點(diǎn)熱群立克次體數(shù)量水平成反比，提示弗朗西斯菌屬內(nèi)共生體可能會(huì)抑制斑點(diǎn)熱群立克次體在蜱體內(nèi)的定植[27]。本次研究中所有樣本均含有高豐度的弗朗西斯菌屬內(nèi)共生體，因此斑點(diǎn)熱群立克次體的陰性結(jié)果可能與此相關(guān)。

16S rDNA V3-V4區(qū)高通量測(cè)序分析表明，有1個(gè)樣本含有貝納柯克斯體，有9個(gè)樣本含有柯克斯體屬(類(lèi))內(nèi)共生體(Coxiella-like endosymbionts),PCR方法擴(kuò)增 IS1111基因片段檢出2只蜱陽(yáng)性，經(jīng)BLAST比對(duì)與貝納柯克斯體同源性為99%～100%。貝納柯克斯體與柯克斯體屬內(nèi)共生體同屬于柯克斯體屬，貝納柯克斯體為人類(lèi)Q熱的病原體，而柯克斯體屬內(nèi)共生體在蜱體內(nèi)多作為維生素供主存在，缺少毒力基因，不存在致病性[28]。Duron等對(duì)柯克斯體的全基因組測(cè)序表明，貝納柯克斯體由柯克斯體屬內(nèi)共生體進(jìn)化而來(lái)，由于16S rDNA的高度保守性，16S rDNA測(cè)序難以闡明兩者間的進(jìn)化關(guān)系[29]。Smith等基于柯克斯體161個(gè)直系同源基因的進(jìn)化分析表明兩者為近親關(guān)系，而非進(jìn)化關(guān)系[28]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)柯克斯體屬的研究大部分集中于貝納柯克斯體，而對(duì)柯克斯體屬內(nèi)共生體的了解尚不充分，這對(duì)今后的研究方向有所提示。

16S rDNA高通量測(cè)序具有檢測(cè)速度快、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于蚊、蜱等多種媒介生物的微生物種群研究[30]。該方法能夠檢出難以培養(yǎng)的菌種，且可以同時(shí)對(duì)大量菌種進(jìn)行檢測(cè)。但其局限性也較為明顯。由于二代測(cè)序的讀長(zhǎng)限制，16S rDNA高通量測(cè)序通常只能選取1～3個(gè)可變區(qū)進(jìn)行檢測(cè)，分類(lèi)結(jié)果難以覆蓋所有菌種，部分菌種只能分辨到屬一級(jí)水平[27]。某些細(xì)菌在屬水平下16S rDNA高變區(qū)高度保守，導(dǎo)致種水平下難以區(qū)分，比如立克次體屬，尤其是斑點(diǎn)熱群立克次體[31]。而PCR法可以對(duì)病原體特異性基因進(jìn)行檢測(cè)，有靈敏度高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)。但每次檢測(cè)菌株種類(lèi)有限，效率較低。因此，對(duì)以上2種檢測(cè)方法進(jìn)行綜合運(yùn)用，能夠使蜱媒病原生物攜帶情況的檢測(cè)結(jié)果更加高效、全面、可信。

利益沖突：無(wú)