P300介導(dǎo)VEGF下調(diào)致孕期酒精暴露模型子代小鼠宮內(nèi)生長(zhǎng)受限*

倪美艷 王一清 付虎 向龍 周瑜

(1.成都市第一人民醫(yī)院新生兒科,四川 成都 610016;2.成都市第一人民醫(yī)院產(chǎn)科，四川 成都 610016；3.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院兒童重癥醫(yī)學(xué)科,四川 成都 610041)

孕期酒精攝入可引起胎兒酒精綜合征(Fetal alcohol syndrome,FAS)，其主要以宮內(nèi)發(fā)育遲緩、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育遲滯、心臟及顱面發(fā)育畸形為主要臨床特征[1-3]。目前存在飲酒習(xí)慣的女性人數(shù)日趨上升，有研究[4]證實(shí)，即使在孕早期聚會(huì)飲酒也可導(dǎo)致FAS發(fā)生。因此FAS發(fā)生機(jī)制的探討仍然十分重要。在FAS眾多并發(fā)癥中，出生低體重常被忽視，因?yàn)閶雰荷蠖鄶?shù)會(huì)出現(xiàn)體重追趕。但出生低體重提示胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限，目前肥胖、糖尿病、高血壓等代謝性疾病與宮內(nèi)發(fā)育相關(guān)的學(xué)說(shuō)已被學(xué)者所接受，出生低體重與成年后代謝性疾病發(fā)生密切相關(guān)[5-8]。已有研究[9]發(fā)現(xiàn)孕期酒精暴露可致子代心臟發(fā)育過(guò)程中組蛋白乙?；揎椢蓙y，而P300是介導(dǎo)組蛋白乙?；揎椀年P(guān)鍵酶之一，其對(duì)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用已為學(xué)者所公認(rèn)[10]，因此p300介導(dǎo)的組蛋白修飾為FAS的病理機(jī)理研究提供新方向。孕期酒精攝入可致后代宮內(nèi)發(fā)育遲緩而出現(xiàn)出生低體重，因此本研究構(gòu)建了FAS模型小鼠，以組蛋白乙?；揎棡檠芯壳腥朦c(diǎn)，探討孕期酒精暴露致子代宮內(nèi)生長(zhǎng)受限的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型構(gòu)建 選取SPF級(jí)c57小鼠(購(gòu)于四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心)60只。按照雌雄2：1合籠，次日清晨觀察雌鼠陰栓，有陰栓者即為妊娠成功(妊娠成功30只)，記妊娠0.5 d，即胎鼠胎齡E 0.5 d。此時(shí)開(kāi)始給予孕鼠50%酒精灌胃，劑量為5 μL/g/d，連續(xù)灌胃14 d，設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，酒精灌胃劑量參照文獻(xiàn)設(shè)定[10-11]，灌胃14 d后小鼠處于胚胎14.5 d，此時(shí)期四腔心結(jié)構(gòu)已形成；另設(shè)對(duì)照組，予生理鹽水(0.9% NaCl)灌胃。實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組每組各12只(6只雌鼠灌胃失敗未納入實(shí)驗(yàn))。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)(E 19.5 d)利用二氧化碳(CO2)處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，隨即取出胎盤(pán)組織。本研究符合動(dòng)物倫理要求，通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：2020028)。

1.2 主要試劑和儀器 100%乙醇(Sigma試劑，上海)；抗VEGF小鼠抗體(Abcam，ab46154)；抗β-actin小鼠抗體(Abcam，ab8227 )；ChIP級(jí)抗p300小鼠抗體(Abcam，ab54984)、染色質(zhì)免疫功共沉淀試劑盒(Abcam，ab500)；HDAC酶及HAT酶活性檢測(cè)試劑盒(Biovision);二抗IgG(Abcam190475)；全蛋白提取試劑盒(凱基生物，KGP250)；RNA提取試劑盒(Solabio，R1200)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Qiagen 205111)；熒光定量PCR試劑盒(賽默飛 A25741)。

1.3 方法

1.3.1 檢測(cè)E19.5 d胎鼠重量 孕鼠分娩期為妊娠后20～21 d，故在妊娠19.5 d，剖宮產(chǎn)獲取胎鼠及胎盤(pán)組織。對(duì)E19.5 d胎鼠進(jìn)行體重稱(chēng)量，小鼠生后每周稱(chēng)量體重至4周。本次研究中無(wú)早產(chǎn)小鼠。

1.3.2 化學(xué)比色法及熒光檢測(cè)法 獲取新鮮胎盤(pán)組織后隨即予以勻漿，勻漿后按照HDACs和HATs活性測(cè)定試劑盒指示，對(duì)胎盤(pán)組織中HATs和 HDACs活性進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn) 按照RNA提取試劑盒說(shuō)明提取組織中總RNA，定量1ug，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，進(jìn)行后續(xù)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。各基因引物序列：p300上游5′-GAGACGCATAGGAATTTGC-3′ 下游5′-AGAGGCCTGGG TCTGACAT-3′，產(chǎn)物136 bp；PCAF的上游5′-ATACCTTCTCGGATGTCTGAT-3′，下游5′-TGGAGCTAACGATAAGTACCA-3′，產(chǎn)物133bp；VEGF上游5′-CGTGAATCAGTACACTAGT-3′ 下游5′-ACTGCTTAAGTCGTGCTCATG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為125 bp；β-actin作為內(nèi)參基因。Bio-Rad-CFX96 熒光定量PCR 儀器“gene expression”模塊(基于Pfaffl 原理)對(duì)各基因相對(duì)β-actin表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、分析。

1.3.4 Western blot實(shí)驗(yàn) 利用前文所及全蛋白提取試劑盒對(duì)組織中總蛋白，利用BCA法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制，并計(jì)算各組蛋白濃度。SDS-聚丙酰胺凝膠選擇濃度未10%，蛋白上樣量為30 μg，90v電泳30 min后換電壓至120 v電泳至溴酚藍(lán)接近膠底部。250mA濕轉(zhuǎn)1.5 h至0.22 μm的PVDF膜上。封閉液(5%脫脂奶粉)1 h后孵育一抗，4 ℃ 16 h；洗膜后孵育 二 抗(1∶3000)1.5 h(室溫)，PBST洗膜后發(fā)光成像。統(tǒng)計(jì)各組條帶灰度值，β-actin為內(nèi)參，計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)量(利用Quantity one軟件)。

1.3.5 染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation，ChIP)實(shí)驗(yàn) 按試劑盒指示進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)：①稱(chēng)取胎盤(pán)組織100 mg，充分勻漿，棄上清后加入1%的甲醛進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)。②利用超聲將大片段DNA進(jìn)行切割，片段長(zhǎng)度介于200～1000 bp為宜。③加入p300 ChIP 級(jí)抗體，在4 ℃下沉淀目的DNA。④65 ℃條件下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，并進(jìn)行DNA純化，所得DNA進(jìn)行后續(xù)PCR實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn) 針對(duì)VEGF基因啟動(dòng)子區(qū)域利用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。引物blast比對(duì)無(wú)誤后送公司合成。VEGF的上游序列：5′-GCCGTAATTACGCTGGCTTACCA-3′，下游序列：5′-CGCATATGACGCGATGACATGGT-3′，產(chǎn)物大小為169 bp。

2 結(jié)果

2.1 子代小鼠出生重量及生后體重 新生小鼠生后當(dāng)天即進(jìn)行稱(chēng)重，實(shí)驗(yàn)組小鼠E19.5 d體重(0.93±0.12)g，較對(duì)照組(1.33±0.13)g明顯降低(P<0.01)。小鼠生后每周稱(chēng)量體重至4周，生后1周、2周實(shí)驗(yàn)組小鼠體重仍落后于對(duì)照組(P<0.05)，提示生長(zhǎng)發(fā)育落后。見(jiàn)表1。

表1 子代小鼠體重Table 1 F1 birth weight

2.2 胎盤(pán)組織中HATs及HDACs酶活性 胎盤(pán)組織中HATs酶活性實(shí)驗(yàn)組明顯低于對(duì)照組(P<0.01)；總HDACs酶活性?xún)山M比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖1。

圖1 兩組HATs及HDACs活性檢測(cè)Figure 1 HATs and HDACs activities in different groups注：與對(duì)照組比較，①P<0.05

2.3 VEGF、p300和PCAF 基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平 VEGF在實(shí)驗(yàn)組胎盤(pán)組織中mRNA水平較對(duì)照組顯著降低(P<0.01)；與對(duì)照組相比，p300在實(shí)驗(yàn)組胎盤(pán)中表達(dá)顯著降低(P<0.05)；而PCAF表達(dá)在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 p300、PCAF和VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量Figure 2 mRNA expression levels in different groups注：A.VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量在實(shí)驗(yàn)組中明顯下降；B.p300 mRNA相對(duì)表達(dá)量在實(shí)驗(yàn)組中明顯下降；C.PCAF mRNA相對(duì)表達(dá)量在兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與對(duì)照組比較，①P<0.05

2.4 VEGF蛋白在各組間表達(dá)水平 實(shí)驗(yàn)組中VEGF蛋白較對(duì)照組顯著降低(P<0.01)，見(jiàn)圖3。

圖3 VEGF蛋白表達(dá)量水平Figure 3 VEGF protein levels in trial and control group注：與對(duì)照組比較，①P<0.05

2.5 p300與VEGF啟動(dòng)子結(jié)合水平 P300與VEGF啟動(dòng)子結(jié)合區(qū)域水平實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

圖4 p300與VEGF啟動(dòng)子結(jié)合水平Figure 4 Binding level of p300 with promoter of VEGF注：與對(duì)照組比較，①P<0.05

3 討論

隨著科學(xué)研究的不斷深入，諸多代謝性疾病宮內(nèi)發(fā)育起源的學(xué)說(shuō)逐漸為學(xué)者所認(rèn)可，目前人群及動(dòng)物研究均已證實(shí)宮內(nèi)發(fā)育遲緩與成年期諸多代謝性性疾病相關(guān)，如高血壓、肥胖、II型糖尿病、高脂血癥等[11]。孕期酒精暴露是導(dǎo)致宮內(nèi)生長(zhǎng)受限的重要原因，本研究成功構(gòu)建胎兒酒精綜合征動(dòng)物模型，子代小鼠體重顯著降低。這與以往FAS研究[12-13]報(bào)道相符。

胎盤(pán)是維系子代宮內(nèi)發(fā)育的重要紐帶，其宮內(nèi)的正常維系是子代發(fā)育的決定性因素之一。有報(bào)道[14-16]顯示饑餓、孕期藥物濫用等等孕期不良因素暴露均可引起胎盤(pán)損傷。而胎盤(pán)損傷是胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩(IUGR)發(fā)生的關(guān)鍵因素之一[17-18]。數(shù)據(jù)首次提示孕期酒精干預(yù)可致胎盤(pán)組織中VEGF表達(dá)明顯降低，而VEGF在血管發(fā)生中的關(guān)鍵作用已得到公認(rèn)[19-21]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)VEGF的下降存在于mRNA和蛋白質(zhì)層面，這提示其降低是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄層面的。近10年陸續(xù)有研究[22-23]提示胎兒酒精綜合征動(dòng)物模型中肝臟、心臟組織中組蛋白乙酰化失衡，進(jìn)而引起發(fā)育異常。組蛋白乙?；诨蜣D(zhuǎn)錄調(diào)控影響重大，通過(guò)影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定而動(dòng)態(tài)且可逆的調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄[24-25]。組蛋白乙?；蹾AT酶及HDAC酶動(dòng)態(tài)調(diào)控。所以同時(shí)檢測(cè)了胎盤(pán)組織中HATs和HDACs的總體活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HATs酶活性顯著下降，而HDACs酶活性無(wú)明顯改變，這提示孕期酒精暴露可能通過(guò)HATs酶而影響胎盤(pán)中基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，我們分別檢測(cè)了HATs酶的重要亞型--p300及PCAF的表達(dá)情況，其在胎兒FAS模型小鼠心臟中均出現(xiàn)表達(dá)異常[23]。數(shù)據(jù)提示僅有p300在酒精暴露組及對(duì)照組之間存在差異，這提示HATs酶的重要亞型p300很有可能介導(dǎo)了胎盤(pán)組織的組蛋白乙?；Ш狻300作為重要HAT酶，可通過(guò)直接調(diào)控靶基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白乙?；接绊懺摶虮磉_(dá)[26]，因此實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)了p300與VEGF啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合水平，數(shù)據(jù)證實(shí)孕期酒精暴露導(dǎo)致胎盤(pán)組織中p300活性降低，其可能介導(dǎo)了重要血管發(fā)生因子VEGF的低表達(dá)，引起胎盤(pán)受損而帶著胚胎宮內(nèi)生長(zhǎng)受限。

胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限受多因素影響[27]，胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限會(huì)引起圍生兒發(fā)生不良妊娠結(jié)局,應(yīng)加強(qiáng)胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限的早期篩查,解除高危因素,改善妊娠結(jié)局。本研究從表觀遺傳角度探討了宮內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育遲緩的可能機(jī)理，組蛋白乙?；竝300可能在此病理發(fā)生中扮演重要角色。鑒于組蛋白乙?；揎椌哂锌赡娴奶攸c(diǎn)，因此這為孕期酒精暴露的早期干預(yù)提供了可能理論靶點(diǎn)。然而在這一病理過(guò)程中，是否存在其他胎盤(pán)受損，如凋亡等因素存在以及能否利用p300為切入點(diǎn)改善宮內(nèi)生長(zhǎng)受限，這些問(wèn)題仍需擴(kuò)大樣本量要進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果提示，孕期酒精暴露通過(guò)p300介導(dǎo)組蛋白乙?；揎椣抡{(diào)胎盤(pán)組織中VEGF表達(dá)，進(jìn)而引起子代宮內(nèi)發(fā)育受限。目前妊娠后發(fā)現(xiàn)有飲酒史的婦女逐漸增多，因此本研究有望對(duì)備孕家庭咨詢(xún)以及誤飲酒孕婦咨詢(xún)提供一定借鑒，同時(shí)有望為胎兒酒精綜合征的臨床治療轉(zhuǎn)化提供可能靶點(diǎn)。