兩類大戟二萜的高分辨ESI－MS/MS質(zhì)譜裂解規(guī)律及診斷離子解析

王天山，付子卓，蔣方龍

（1.熱帶藥用資源化學(xué)教育部重點實驗室，海南 海口 571199；2.海南省熱帶藥用植物化學(xué)重點實驗室，海南 海口 571199；3.海南師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，海南 ?？?571199）

大戟二萜是大戟屬植物的主要化學(xué)成分，通常擁有比較豐富的二萜骨架和大環(huán)結(jié)構(gòu)［1］。它們在植物化學(xué)、有機化學(xué)、藥學(xué)和分子生物學(xué)方面都有非常重要的作用，但是曼西烷型（Myrsinane）和前曼西烷型（Premyrsinane）二萜等在植物中的含量較少，并已成為制約諸多相關(guān)研究發(fā)展的瓶頸。曼西烷型和前曼西烷型二萜主要存在于大戟科大戟屬（Euphorbia）植物中，其基本化學(xué)結(jié)構(gòu)是具有5/7/6/3和5/7/6多環(huán)駢合體系。根據(jù)該類物質(zhì)的骨架轉(zhuǎn)化和生源分析，前曼西烷型和曼西烷型二萜有直接的生源關(guān)系［2］。藥理活性研究發(fā)現(xiàn)，此類二萜類化合物擁有非常廣泛的生物活性，比如細(xì)胞毒性和抗腫瘤活性、抑菌活性、抗炎活性等，這為從大戟二萜中尋找藥物先導(dǎo)物提供了數(shù)據(jù)依據(jù)［1，3］。隨著一系列新的、高效的色譜技術(shù)與波譜技術(shù)的不斷融合發(fā)展，新化合物和結(jié)構(gòu)新穎的骨架不斷被發(fā)現(xiàn)，豐富了大戟二萜的數(shù)據(jù)庫。Yazdiniapour等［4］從伊朗產(chǎn)的E. gedrosiaca中發(fā)現(xiàn)兩種新的曼西烷型二萜多酯化合物，并以紫杉醇作為陽性對照，研究了這些化合物在體外對小鼠黑色素瘤高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系B16F10和A375的增殖抑制活性。Flores－Giubi等［5］從大戟（E. boetica）全草的乙醇提取物中發(fā)現(xiàn)4類大戟二萜，其中3種是新的前曼西烷型二萜，2種是新的曼西烷型二萜，還有大環(huán)續(xù)隨子二萜。這些大環(huán)續(xù)隨子二萜可以促進小鼠體內(nèi)的神經(jīng)祖細(xì)胞（NPCs）增殖，具有修復(fù)受損腦細(xì)胞的意義。Laura等［6］采用高壓液相色譜方法從意大利產(chǎn)的地衣大戟（E. myrsinites）中分離純化制備出1種新的阿替生烷型、4種曼西烷型和3種巨大戟烷型大戟二萜，發(fā)現(xiàn)部分二萜對小鼠體外單核巨噬細(xì)胞J774A.1表現(xiàn)出一定的消炎活性。Huang等［7］從續(xù)隨子（E. lathyrism）種子的95%乙醇提取物中發(fā)現(xiàn)兩種高度重排的續(xù)隨子烷型二萜Euphohyrismoinds A和B，兩者分別具有獨特的四環(huán)［10.2.2.01，10.03，7］十六烷和三環(huán)［8.4.1.03，7］十五烷型二萜骨架。Wang等［8］采用生源合成的方法發(fā)現(xiàn)，在室溫下用三氟化硼－乙醚－乙酸乙酯體系催化大戟因子L1（續(xù)隨子烷型二萜）可以合成曼西烷型二萜，闡明了這兩類二萜可能的生物轉(zhuǎn)化問題，并給出了合成曼西烷型二萜的化學(xué)方法，為其生物活性、構(gòu)效關(guān)系和藥理研究等提供了物質(zhì)保障。

新化合物和新骨架的發(fā)現(xiàn)依托于研究方法的不斷創(chuàng)新。近幾年，有很多研究工作者借助GNPS（Global Natural Product Social Molecular Networking）數(shù)據(jù)庫平臺研究天然產(chǎn)物化學(xué)，主要是基于各種類型對照品的二級質(zhì)譜（MS/MS）數(shù)據(jù)分析其二級質(zhì)譜裂解規(guī)律和診斷離子，建立特定類型化合物的分子網(wǎng)絡(luò)。通過此類分子網(wǎng)絡(luò)不僅可以快速且大通量地鑒定中藥的化學(xué)成分，挖掘新化合物，還可以為定向獲取活性化合物提供重要的線索，為藥物代謝研究提供新的方法［9－12］。宋少江課題組基于MS/MS的分子網(wǎng)絡(luò)策略，從地膽草（ElephantopusscaberL.）中分離得到6種新吉瑪烷型倍半萜內(nèi)酯，分別命名為Scaberxones A－F；并發(fā)現(xiàn)Scaberxones F在10μmol/L時對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞（BV－2）釋放一氧化氮（NO）的水平具有很強的抑制活性，并以此評估了其抗神經(jīng)炎癥活性［13］。張翠仙課題組采用超高效液相色譜－四極桿飛行時間質(zhì)譜結(jié)合GNPS分子網(wǎng)絡(luò)平臺，對中藥炮附片中二萜類生物堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)進行了快速表征，以13種附子對照品的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)建立GNPS網(wǎng)絡(luò)，并結(jié)合這些對照品的質(zhì)譜裂解規(guī)律成功鑒定了123個二萜類生物堿化合物，其中有34個化合物為潛在的新化合物［14］。

本研究采用高分辨電噴霧二級質(zhì)譜技術(shù)（HR－ESI－MS/MS）分析兩類15種大戟二萜的質(zhì)譜裂解規(guī)律，闡述這些化合物的診斷離子，以期為此類二萜的質(zhì)譜鑒定提供科學(xué)數(shù)據(jù)，并為利用分子網(wǎng)絡(luò)技術(shù)定向分離此類物質(zhì)提供必要的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)和化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定思路。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

Q Exactive Focus型四極桿高分辨質(zhì)譜儀（美國Thermo Scientific有限公司），F(xiàn)A1604型電子天平（上海良平儀器儀表有限公司），XO－5200DB型超聲波清洗儀（南京先歐儀器制造有限公司），MPC－5V406型醫(yī)用藥品冷藏箱（安徽中科都菱股份有限公司）；0.45 μm有機相過濾膜（天津津騰科技有限公司），色譜級甲醇（Marcon Fine Chemicals?有限公司），25%色譜級氨水（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），99.9%純度液氮和99.99%純度液氦（?？诮鸷裉胤N氣體有限公司）。

15種大戟二萜樣品的化學(xué)名稱分別為：Euphorprolitherin B（1），Euphordraculoin M（2），Euphordraculoin R（3），Proliferin A（4），Euphordracunculin A（5），Euphordracunculin B（6），Euphorbialoid F（7），Proliferin C（8），14-Deoxo-3β-O-prorionyl-5α，15β-di-O-acetyl-7β-O-nicotinoylmyrsinol-14β-acetate（9），Euphorbialoid C（10），Euphorbialoid D（11），3-Propanoate-5-benzoate-7，13，17-triacetate-premyrsinol（12），Euphorbialoid A（13），F(xiàn)alcatin S（14），Euphordraculoin K（15），由中國科學(xué)院昆明植物研究所王莉博士提供，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1［15－18］。

圖1 15種曼西烷型和前曼西烷型二萜的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of fifteen myrsinane-type and premyrsinane-type diterpenes

1.2 質(zhì)譜條件

Q Exactive Focus型質(zhì)譜儀采用電噴霧離子源（ESI）結(jié)合TraceFinder數(shù)據(jù)分析軟件（version 4.1）進行正/負(fù)離子模式掃描。掃描模式：Full MS/dd-MS2；Full MS分辨率70 000，dd-MS2分辨率70 000，正離子模式噴霧電壓：4.2 kV，負(fù)離子模式噴霧電壓：4 kV，蠕動泵半自動進樣速度：5 μL/min。離子傳輸管溫度：350 ℃；鞘氣壓力：34.5 kPa；霧化溫度：常溫；MS/MS模式碰撞能量：10 ~ 50 eV（對各種測試樣品進行手動優(yōu)化，以獲得豐富的子離子信號）。

1.3 待測樣品溶液的配制

用天平稱取各對照品1.0 mg，分別加入1 mL甲醇中超聲溶解，再用0.45 μm微孔濾膜過濾，制備單一對照品儲備液，置于藥品儲藏柜中4 ℃保存。測試時將1 mg/mL的儲備溶液稀釋至0.1 mg/mL。

2 結(jié)果與討論

本研究選擇的15種大戟二萜化合物，有9種曼西烷型二萜（1 ~ 9）和6種前曼西烷型二萜（10 ~ 15）。電噴霧質(zhì)譜測試時發(fā)現(xiàn)部分樣品的甲醇溶液未能檢出［M + H］+的準(zhǔn)分子離子峰，因此向未質(zhì)子化的樣品滴加1滴25%氨水進行氨化處理以獲得［M + NH4］+的準(zhǔn)分子離子峰，此準(zhǔn)分子離子丟失中性NH3分子后與［M + H］+的ESI二級質(zhì)譜裂解行為相同［19］。除［M + H］+/［M + NH4］+準(zhǔn)分子離子峰外，實驗中還觀測到［M + Na］+和［M + K］+的準(zhǔn)分子離子峰。在進行一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜掃描時，根據(jù)各化合物的分子量大小選擇合適的掃描范圍。本研究重點分析上述兩類大戟二萜［M + H］+/［M + NH4］+準(zhǔn)分子離子的質(zhì)譜裂解規(guī)律，并結(jié)合各自的化學(xué)結(jié)構(gòu)特點闡述其診斷離子。研究結(jié)果表明這些診斷離子主要集中在m/z200 ~ 320區(qū)間。

曼西烷型和前曼西烷型大戟二萜含有多個酰氧基，通過分析各化合物相同位置不同酰氧基的差異及其裂解順序發(fā)現(xiàn)，酰氧基所受到的斥力大小以及是否含有β-H均會影響其質(zhì)譜裂解順序，一般斥力大的酰氧基更容易脫離，有β-H的酰氧基優(yōu)先裂解。借助此類化合物的晶體結(jié)構(gòu)或NOE（Nuclear overhauser enhancement spectroscopy）二維核磁共振實驗數(shù)據(jù)更有利于理解各個酰氧基之間的相對位置和基團間的距離［5，8］。另外，通過分析這些化合物的［M + Na］+/［M + K］+的二級質(zhì)譜還發(fā)現(xiàn)，最后一個酰氧基或羥基會與加合離子（Na+或K+）結(jié)合以羧酸鹽或堿的方式脫離，且同一化合物不同形式的準(zhǔn)分子離子在m/z200 ~ 320區(qū)間的裂解模式相同（表1）。

表1 4種代表性大戟二萜化合物的串聯(lián)質(zhì)譜碎片離子Table 1 Fragment ions of tandem mass spectrometry for four candidate Euphorbia diterpenoid compounds

（續(xù)表1）

2.1 曼西烷型二萜的二級質(zhì)譜裂解

2.1.1 13，17-環(huán)氧-10，18-二氫曼西烷型化合物1 ~ 8的化學(xué)結(jié)構(gòu)特點是擁有5/7/6/5四環(huán)體系，C-13和C-17通過氧橋鍵合形成一個四氫呋喃環(huán)，該四氫呋喃環(huán)表現(xiàn)出其裂解特點?；衔? ~ 6在C-2的氧化位點為羥基或酰氧基，其它的氧化位點均為酰氧基?；衔顴uphorprolitherin B（1）的氨化準(zhǔn)分子離子m/z788 ［M + NH4］+受到轟擊（10 eV）丟失一個中性NH3分子后，從C-2、C-5、C-7和C-15位連續(xù)丟失4個乙酸分子，隨后C-3位（無β-H）的丙酰氧基與加合質(zhì)子相結(jié)合斷掉丙酸分子生成離子m/z457；而m/z353是比m/z457少104 Da的離子，歸屬為C-14位（無H+，無β-H）的苯甲?；ㄟ^苯環(huán)2位氫的重排發(fā)生酰基裂解生成的醇式離子，繼而其在C-10位丟失最后一個乙酸分子生成醇式二萜骨架離子m/z293。m/z293既可脫水生成m/z275離子，還可依次從四氫呋喃環(huán)和C-14位的羥亞甲基結(jié)構(gòu)裂解掉兩個中性小分子HCHO后生成m/z263和m/z233的離子對。相似的，經(jīng)過C-10位丟失乙烯酮后得到的二醇式骨架離子m/z311相繼裂解掉兩分子甲醛得到另外一對離子m/z281和m/z251；實驗還觀察到離子m/z311從C-11位裂解掉一個丙酮分子生成m/z253。在碎片離子中m/z263→223相差40 Da，這歸屬為從C-11位丟掉一個丙炔分子（圖2）。m/z311、281、251、293、263、233、275、253和223可視為是含有7個氧化位點且沒有羰基的13，17-環(huán)氧-10，18-二氫曼西烷型二萜的診斷離子。

圖2 化合物Euphorprolitherin B（1）氨化離子的質(zhì)譜裂解途徑Fig.2 Proposed fragmentation pathways of ammoniated euphorprolitherin B（1）

化合物Euphorbialoid F（7）只有6個氧化位點，比1 ~ 6在C-2少一個氧化位點，其中C-7被氧化成羰基，其它均為酰氧基。其二級質(zhì)譜裂解表現(xiàn)為先丟失5分子羧酸，分別為丟失C-5、C-10和C-15位3分子乙酸生成m/z490，接著斷裂C-3位丙酸得到m/z416，最后從C-14位經(jīng)芳環(huán)上的氫重排斷掉煙?；纱纪蕉乒羌躮/z311離子，或者直接脫掉煙酸得到m/z293酮式二萜骨架離子。若m/z416離子先從四氫呋喃環(huán)裂解掉甲醛分子將得到一個僅次于基峰的強離子信號m/z386，此離子也可斷掉煙酰基或者煙酸生成m/z281和m/z263離子。酮式二萜骨架離子m/z293從C-7位丟失一個中性CO分子，再從C-11處斷裂一分子丙烯分別得到m/z265和m/z223。m/z311-281-251離子簇的裂解模式與化合物1相同，均為丟失兩個甲醛分子。離子m/z233的化學(xué)組成為C14H17O+3，根據(jù)其含有3個氧原子的特點推測可能是醇酮式二萜骨架離子m/z311的7元環(huán)開裂后產(chǎn)生的（圖3紅色箭頭）。

圖3 化合物Euphorbialoid F（7）質(zhì)子化離子的質(zhì)譜裂解途徑Fig.3 Proposed fragmentation pathways of protonated euphorbialoid F（7）red arrow：m/z 233 ion obtained by seven-membered ring cleavage（紅色箭頭：七元環(huán)裂解生成m/z 233離子）

m/z293→265→223展示的是二萜骨架離子脫羰基和丙烯的過程，基本上能夠反映該類物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)特點。m/z311、293、281、265、263、251、233和223離子反映了化合物7的四氫呋喃環(huán)、C-7羰基和C-11異丙烯基的裂解特點，可認(rèn)為是此類化合物的診斷離子。

化合物7與1的骨架離子m/z293的化學(xué)組成相同，但其化學(xué)結(jié)構(gòu)并不相同，主要區(qū)別在于7可以脫去CO分子（m/z293→265），而1則是脫水（m/z293→275）。還有一個很有意義的鑒別信息是，這兩種化合物都含有m/z233的碎片離子，但是高分辨質(zhì)譜提示其化學(xué)組成并不相同，前者為C14H17O3，后者為C18H17。這兩組碎片離子的差異可以區(qū)分這些化合物在C-7位是否含有羰基。

2.1.2 5/7/6/5四環(huán)曼西烷型化合物9也是擁有5/7/6/5四環(huán)體系的曼西烷型二萜，與1 ~ 8的不同之處是其C-11位為異丙烯基結(jié)構(gòu)。該化合物m/z654［M + H］+的二級質(zhì)譜裂解是從C-3、C-5、C-7和C-15位脫酸后生成m/z337離子；該離子（m/z337）先從C-14位脫酸再從四氫呋喃環(huán)裂解掉甲醛即生成m/z277和m/z247的離子對，反之則生成m/z307和m/z247離子對；若從C-14位經(jīng)過?；系臍渲嘏琶撊ヒ蚁┩–H2CO）則生成醇式二萜骨架m/z295離子。該m/z295離子具有與化合物1的醇式二萜骨架m/z293離子相似的裂解方式，既可脫水得到m/z277，也可從四氫呋喃環(huán)和C-14位的羥亞甲基依次裂解掉兩個甲醛分子而生成m/z265和m/z235的離子對（圖4）。由此可見，此類化合物的診斷離子為m/z295、277、265、247和235。

圖4 化合物14-deoxo-3β-O-prorionyl-5α，15β-di-O-acetyl-7β-O-nicotinoyl-myrsinol-14β-acetate（9）質(zhì)子化離子的質(zhì)譜裂解途徑Fig.4 Proposed fragmentation pathways of protonated 14-deoxo-3β-O-prorionyl-5α，15β-di-O-acetyl-7β-O-nicotinoyl-myrsinol-14β-acetate（9）

2.2 5/7/6/3四環(huán)前曼西烷型二萜的二級質(zhì)譜裂解

前曼西烷型二萜的結(jié)構(gòu)特點是比曼西烷型二萜在C環(huán)多一個偕二甲基環(huán)丙烷單元，形成5/7/6/3四環(huán)體系，其各個氧化位點的基團多為羥基、羰基和酰氧基。

以化合物Euphorbialoid C（10）為例對該類型化合物的質(zhì)譜裂解途徑進行分析，選擇20 eV的碰撞能撞擊［M + H］+可以得到比較豐富的二級質(zhì)譜碎片離子。二級質(zhì)譜圖顯示化合物10優(yōu)先丟失5分子的羧酸：分別從C-7和C-13丟失兩分子乙酸，從C-5丟失一分子苯甲酸，接著從C-3丟失一分子丙酸，最后從C-17（無β-H）經(jīng)過H-9參與的裂解反應(yīng)丟失一分子煙酸同時形成一個環(huán)丙烷單元，繼而得到二萜骨架的醇酮式m/z295碎片離子（圖5紫色箭頭），若有一個酰氧基開裂即生成m/z313的骨架離子。這兩個骨架離子既有常見的脫水和脫CO的特點，例如m/z295→277→249或者m/z295→267→249，也存在與曼西烷型二萜不同的裂解模式，即關(guān)于偕二甲基環(huán)丙烷單元的裂解。

通過分析相關(guān)碎片離子之間化學(xué)組成的變化發(fā)現(xiàn)，前曼西烷型二萜存在裂解掉丙烯的中性分子，這是由于經(jīng)過前幾步脫酸裂解后，偕二甲基環(huán)丙烷單元與碳碳雙鍵相連致使三元環(huán)的張力進一步增大。離子m/z235和m/z225均比各自的前體離子減少42 Da，所對應(yīng)的化學(xué)組成均為減少C3H6，裂解機理可能是三元環(huán)在C10－C11處開裂的同時一個H-20遷移至C-10，并在C-9處裂解掉一個C3H6丙烯分子（如圖5紅色箭頭所示）。離子m/z253比m/z267少14 Da，從離子m/z267的結(jié)構(gòu)看很可能是C-17處的三元環(huán)裂解掉CH2后生成雙鍵，此雙鍵可以與其它原有的雙鍵形成更大的共軛體系；m/z253離子的存在說明H-9參與C-17處煙酰氧基的裂解并形成三元環(huán)（m/z418→295）的機理是合理的。

圖5 化合物Euphorbialoid C（10）質(zhì)子化離子的質(zhì)譜裂解途徑Fig.5 Proposed fragmentation pathways of protonated euphorbialoid C（10）red arrow： C3H6 loss； purple arrow： NicOH loss（紅色箭頭：丟失丙烯；紫色箭頭：丟失煙酸）

碎片離子m/z313、295、277、267、253、249和225反映的是前曼西烷型二萜醇酮式骨架的裂解特征，而碎片離子m/z235和m/z225則反映了偕二甲基環(huán)丙烷單元的裂解特征。由于這些離子可反映該類型化合物的基本骨架，因此將其視為前曼西烷型二萜的診斷離子。

2.3 診斷離子解析

本文的15種大戟二萜均為多酯類化合物，含有多個氧化位點；酰氧基和羥基裂解后均可生成C= = C雙鍵，所得到的子離子可相應(yīng)地增加一個不飽和度。根據(jù)各類化合物潛在C= = C雙鍵（pRDB值）和母核骨架不飽和度（bRDB值）的總數(shù)可以推測二萜骨架離子的質(zhì)荷比；從裂解規(guī)律看，可以將酰氧基和羥基視為一個潛在的不飽和度，羰基有兩個不飽和度（一個潛在不飽和度和一個雙鍵不飽和度），而C= = C雙鍵擁有一個不飽和度（見表2）。

表2 化合物1 ~ 15的潛在RDB值、骨架RDB值以及診斷離子Table 2 The potential RDB，backbone RDB values and diagnostic ions for 1－15

3 結(jié) 論

采用高分辨電噴霧質(zhì)譜研究了大戟二萜中曼西烷型和前曼西烷型二萜的二級質(zhì)譜裂解行為，并闡述了其診斷離子。通過研究15種樣品的質(zhì)譜裂解行為發(fā)現(xiàn)，在所有的氧化位點上酰氧基最容易脫酸，接下來是羥基脫水和羰基脫去CO分子。當(dāng)化合物脫去所有的酰氧基后即可生成具有該二萜骨架的離子，以該離子作為母離子所生成的子離子可反映其化學(xué)結(jié)構(gòu)特征，因此將這些二萜骨架離子視為診斷離子。對于10，18-二氫曼西烷型化合物（1 ~ 8），借助其診斷離子和碎片離子可以區(qū)分C-2位是否存在氧化位點以及是否存在羰基。這些診斷離子信息可為采用質(zhì)譜技術(shù)快速鑒定同類型化合物提供可靠的數(shù)據(jù)參考，為建立大戟二萜的質(zhì)譜分子網(wǎng)絡(luò)提供必要的數(shù)據(jù)依據(jù)和研究思路。

由于所選擇的樣品種類和數(shù)量有限，此研究結(jié)果不一定代表所有曼西烷型和前曼西烷型二萜的質(zhì)譜裂解行為。各個位點氧化態(tài)的不同、?；g斥力的不同或者存在其它橋環(huán)結(jié)構(gòu)等因素都可能影響其質(zhì)譜裂解方式。