高效液相色譜－電感耦合等離子體質(zhì)譜法分析尿中6種砷形態(tài)

劉 洋，陳紹占，劉麗萍*，李曉玉，李乾玉

（1.北京市疾病預(yù)防控制中心，食物中毒診斷溯源技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100013；2.首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100069；3.中國食品藥品檢定研究院，北京 100162）

砷是一種備受關(guān)注的環(huán)境毒物，人們通過空氣、食品和飲用水而發(fā)生砷暴露。食品、地下水和飲用水的污染威脅著世界各地人類的健康。砷具有不同的形態(tài)，主要有砷甜菜堿（AsB）、砷膽堿（AsC）、砷糖（AsS）、砷酸鹽（As（V））、亞砷酸鹽（As（Ⅲ））、一甲基砷（MMA）和二甲基砷（DMA）等，不同形態(tài)砷的毒性差異較大，無機(jī)砷（包括As（V）和As（Ⅲ））通常被認(rèn)為是毒性較高的砷形態(tài)，而甲基化的有機(jī)砷危害較?。?－2］，AsB、AsC、AsS通常認(rèn)為是無危害的砷形態(tài)。長期接觸無機(jī)砷易患皮膚癌、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和肺癌等［3］，對人體健康造成多種危害，《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》（GB 2762－2022）［4］中規(guī)定了食品中總砷及無機(jī)砷的限量，因此砷形態(tài)分析對于食品安全、人體健康至關(guān)重要。人體暴露不同毒性的砷形態(tài)后對健康的影響差異較大。為了更好評價砷通過食品、環(huán)境暴露途徑對人體健康的影響，有必要開展人體尿液中砷形態(tài)及砷代謝物的分析研究。因此，建立一種分析尿中多種砷形態(tài)的方法用于評估砷暴露后的代謝非常重要。

目前尿中砷形態(tài)的檢測方法主要為高效液相色譜－電感耦合等離子體質(zhì)譜法（HPLC－ICP－MS）［5－6］、液相色譜－原子熒光法（LC－AFS）［7］、氫化物發(fā)生－原子吸收光譜法（LC－HG－AAS）［8］、離子交換色譜－氫化物發(fā)生－原子熒光光譜法（LC－HG－ICP－AFS）［9］等。我國衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)《尿中砷形態(tài)的測定》（WS/T 635－2018）［10］采用LC－AFS法分析尿中砷形態(tài)，但此標(biāo)準(zhǔn)只能測定尿中4種砷形態(tài)（MMA、DMA、As（Ⅲ）、As（V）），且靈敏度相對較低。HPLC－ICP－MS的靈敏度高、分析種類多、分離好，被廣泛應(yīng)用于砷形態(tài)分析。目前采用HPLC－ICP－MS測定尿液中砷形態(tài)的分析方法存在分析時間較長［11］、前處理過程中砷形態(tài)易發(fā)生轉(zhuǎn)化［6］和砷形態(tài)種類覆蓋不全等問題［12］。為了更好地研究砷暴露后在尿液中的代謝轉(zhuǎn)化情況，亟需建立尿中多種砷形態(tài)的分析方法，用于評估砷暴露后的代謝水平，更好地為地方病砷中毒的評價提供有力支持。本文采用HPLC－ICP－MS建立了同時分析尿中6種砷形態(tài)的測定方法，并初步考察了人食用海鮮、食用菌等不同含砷食品后人體尿液中砷的存在形式。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（1260型）及電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（7700x型）（美國Agilent公司）；Dionex IonPac As7陰離子交換色譜柱（250 mm × 4 mm，10 μm）及其保護(hù)柱Dionex IonPac AG7（50 mm × 4 mm，10 μm）（美國賽默飛世爾科技公司）；Milli－Q超純水純化系統(tǒng)（美國Merck公司）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

AsB、DMA、AsC、MMA、As（Ⅲ）、As（V）的標(biāo)準(zhǔn)溶液均購自中國計量科學(xué)研究院；碳酸銨（優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（色譜純，美國Sigma公司）；有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：“冷凍人尿中砷形態(tài)”（NIST SRM 3669）。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件色譜柱：Dionex IonPac As7陰離子交換色譜柱（250 mm × 4 mm，10 μm）和Dionex Ion?Pac AG7保護(hù)柱（50 mm × 4 mm，10 μm）；流速：1.2 mL/min；進(jìn)樣量：25 μL；流動相：A為20 mmol/L碳酸銨（2%甲醇），B為100 mmol/L碳酸銨（2%甲醇）；梯度洗脫條件為：0 ~ 1.6 min，100% A；1.6 ~5.6 min，100% B；5.6 ~ 8.0 min，100% A。

1.2.2 質(zhì)譜條件RF入射功率：1 550 W，載氣（高純氬氣）流速：0.65 L/min，補(bǔ)償氣流速：0.45 L/min，射頻電壓：1.80 V，泵速：0.3 r/s，采樣深度：8.0 mm。

1.3 樣品處理

取1 mL尿樣于15 mL聚丙烯離心管中，加入2 mL超純水稀釋，混合均勻，8 000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm濾膜，上機(jī)測定，同時做空白實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

正常尿液含有95%的水、1.8%的尿素和1.1%的無機(jī)鹽。文獻(xiàn)多采用不同的試劑將尿液稀釋一定倍數(shù)，例如Fukai等［13］將尿樣與流動相（10 mmol/L丁烷磺酸鈉 + 4 mmol/L丙二酸 + 4 mmol/L四甲基氫氧化銨）等比例稀釋后過濾取上清液檢測；Todor等［14］使用1%硝酸稀釋尿液后測定；Nguyen等［6］使用流動相（4 mmol/L碳酸銨 + 0.05% Na2EDTA）和甲醇的混合物稀釋尿樣，但存在As（Ⅲ）向As（V）轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，Verdon等［15］也發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象。為減少其他物質(zhì)的引入，保證尿中砷形態(tài)的穩(wěn)定，目前大多數(shù)研究僅將尿液用超純水稀釋后上機(jī)測定［16］。當(dāng)稀釋倍數(shù)較少，尿液中無機(jī)鹽含量較高時，尿液中的Cl離子會形成ArCl+，從而干擾質(zhì)譜檢測；稀釋倍數(shù)過多，則待測物砷形態(tài)的含量過低，影響檢測的準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)考察了尿液分別稀釋3倍、5倍、10倍的測定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)將尿液稀釋3倍既可避免無機(jī)鹽的干擾，方法靈敏度也能滿足要求。因此，選擇將尿液稀釋3倍后離心處理。

2.2 色譜柱的選擇

對于尿中砷形態(tài)的測定，目前大多數(shù)研究選用Hamilton PRP－X100陰離子交換色譜柱［16－17］，但使用該色譜柱分離6種砷形態(tài)需要準(zhǔn)確調(diào)節(jié)流動相pH值，且分離時間較長?？疾炝薍amilton PRP－X100（250 mm × 4.1 mm，10 μm）、C18反相色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）、Dionex IonPac As19（250 mm ×4 mm）、Dionex IonPac As7（250 mm × 4 mm）等色譜柱的分離效果，在相同的洗脫條件下，前3種色譜柱均無法實(shí)現(xiàn)6種砷形態(tài)的完全分離。本實(shí)驗(yàn)最終選擇Dionex IonPac As7為分析色譜柱，該色譜柱在6 min內(nèi)能使6種砷形態(tài)實(shí)現(xiàn)基線分離，分離周期僅為8 min，且耐鹽能力較強(qiáng)。

2.3 流動相的選擇

由于磷酸鹽［18－19］和碳酸鹽［12，20］體系的洗脫能力強(qiáng)、分析時間短、分離能力好，目前已被廣泛應(yīng)用。但磷酸鹽緩沖液存在會出現(xiàn)峰的共洗脫，長期使用時會在ICP－MS儀器的錐口出現(xiàn)積鹽等問題［19］。近年來的砷形態(tài)研究中也有使用醋酸鹽體系［11］作為流動相，其與碳酸鹽具有一定的相似性，但醋酸鹽的黏度和密度均較低，當(dāng)以20 mmol/L醋酸銨（pH 5，A）和20 mmol/L醋酸銨（pH 9，B）為流動相采用梯度洗脫時，可在30 min完成6種砷形態(tài)的分離，分析時間較長。經(jīng)優(yōu)化選擇，本實(shí)驗(yàn)使用碳酸銨為流動相，操作簡便。

分別考察了30 mmol/L碳酸銨等度洗脫（圖1a）、30 mmol/L碳酸銨（A）和50 mmol/L碳酸銨（B）梯度洗脫（圖1b）、20 mmol/L碳酸銨（A）和100 mmol/L碳酸銨（B）梯度洗脫（圖1c）3種洗脫方式的分離效果，結(jié)果見圖1。與等度洗脫相比，梯度洗脫可以提升As（V）的靈敏度。在梯度洗脫中，B相濃度為50 mmol/L時，雖然各砷形態(tài)的靈敏度有所提高，但分析時間較長；對梯度洗脫進(jìn)一步優(yōu)化，將B相濃度提高至100 mmol/L時，分析時間大大縮短，且各砷形態(tài)的靈敏度較好，8 min內(nèi)可完成6種砷形態(tài)的分離，分離度較好。由于2%甲醇對砷的信號強(qiáng)度具有增敏作用，因此本實(shí)驗(yàn)選用20 mmol/L碳酸銨（2%甲醇）（A）和100 mmol/L碳酸銨（2%甲醇）（B）為流動相進(jìn)行梯度洗脫。

圖1 不同流動相對6種砷形態(tài)（10 μg/L）分離效果的影響Fig.1 Influence of different mobile phase on the separation effect of 6 arsenic speciations（10 μg/L）

2.4 線性范圍與檢出限

分別配制0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100 μg/L的6種砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，采用本方法進(jìn)行測定，以不同砷形態(tài)的色譜峰面積（y）與相應(yīng)質(zhì)量濃度（x，μg/L）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，6種砷形態(tài)在0 ~ 100 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性較好，相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.999（見表1）。采用逐級稀釋法測定檢出限，以3倍基線噪聲（S/N= 3）時的質(zhì)量濃度為檢出限，得到AsB、DMA、AsC、As（Ⅲ）、MMA、As（V）的檢出限分別為0.05、0.05、0.05、0.05、0.05、0.15 μg/L（見表1）。

表1 6種砷形態(tài)的線性關(guān)系及檢出限Table 1 Linear relationships and detection limits of 6 arsenic speciations

2.5 方法的準(zhǔn)確性

通過有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測定和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)考察方法的準(zhǔn)確性。

2.5.1 有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測定測定有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)“冷凍人尿中砷形態(tài)”（NIST SRM 3669），結(jié)果見表2。由結(jié)果可知，有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)“冷凍人尿中砷形態(tài)”中5種砷形態(tài)的測定結(jié)果均在標(biāo)準(zhǔn)參考值范圍內(nèi)。

表2 冷凍人尿中砷形態(tài)（NIST SRM 3669）的測定結(jié)果（n = 6）Table 2 Determination results of arsenic speciations in Frozen Human Urine（NIST SRM 3669）（n = 6）

2.5.2 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選取1份尿樣，分別添加10.0、30.0、70.0 μg/L 3個濃度水平的6種砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)（見表3）。由表3可知，3個加標(biāo)水平下6種砷形態(tài)的回收率為91.8% ~ 108%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.30% ~ 1.9%。

表3 6種砷形態(tài)的加標(biāo)回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n = 6）Table 3 Recoveries and relative standard deviations of six arsenic speciations（n = 6）

2.6 方法的重復(fù)性

以精密度考察方法重復(fù)性，分別進(jìn)行了模擬樣品和實(shí)際樣品的考察。

在尿樣中加入低、中、高3個濃度水平的6種砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備模擬樣品，測定其砷形態(tài)的含量。結(jié)果顯示，6種砷形態(tài)的RSD（n= 6）均小于5.0%。

選取2個含砷的尿樣，測定其砷形態(tài)，分別測定6次。結(jié)果表明，其中1個樣品中主要的砷形態(tài)為AsB、DMA、AsC、As（V），另1個樣品中主要的砷形態(tài)為AsB、DMA、As（Ⅲ）、MMA、As（V），其RSD均小于5.0%。

2.7 實(shí)際樣品的測定

采用所建方法測定近百份尿液樣品，結(jié)果表明尿中砷分別以AsB、As（V）、As（Ⅲ）、AsC、MMA和DMA的形式存在。尿中砷代謝產(chǎn)物AsB、無機(jī)砷（iAs）、MMA、DMA的分布水平反映了人體對砷的代謝情況，食用不同含砷食物后砷的代謝不同，同時有研究報道食用海鮮后尿中各形態(tài)砷化合物的代謝存在性別差異［21］。

2.8 方法對比

與其他文獻(xiàn)方法相比，本方法的靈敏度、分離度和分析時間均有一定優(yōu)勢。Rodríguez等［11］采用醋酸銨為流動相，Hamilton PRP－X100為色譜柱，梯度洗脫，在30 min內(nèi)完成6種砷形態(tài)分離，其中AsC和AsB的分離度較差，不能滿足實(shí)際工作的需要；Nguyen等［6］采用碳酸銨為流動相，選用Hamilton PRPX100色譜柱，梯度洗脫，在20 min內(nèi)僅完成5種砷形態(tài)的分離，且As（Ⅲ）的靈敏度較差；Sen等［17］采用含2%甲醇的5 mmol/L（NH4）2HPO4和5 mmol/L NH4NO3為流動相，Hamilton PRP－X100為色譜柱，其中AsC和AsB的分離度較差，且需15 min完成6種砷形態(tài)分離?？傮w而言，本文采用Dionex IonPac As7為分析色譜柱，在8 min內(nèi)可實(shí)現(xiàn)尿中6種砷形態(tài)的分離，可滿足尿砷形態(tài)的分析要求。

2.9 食用不同含砷食物后尿中砷形態(tài)分析

為探究食用含砷較高的食物后尿中砷形態(tài)的存在形式，研究人體對砷的代謝情況，招募6名志愿者。6名志愿者近3 d均未食用含砷高的食物，其中5名于當(dāng)日晚餐分別食用皮皮蝦、花蛤、海蝦、海魚和松茸，收集第二日晨尿，采用本方法測定尿中砷形態(tài)，測定結(jié)果見表4，分析譜圖見圖2。

表4 攝入不同食品后尿中砷形態(tài)測定結(jié)果（μg/L）Table 4 Determination results of arsenic speciations in urine after ingestion of different foods（μg/L）

圖2 不同尿液樣品中砷形態(tài)的檢測譜圖Fig.2 Detection spectra of different arsenic speciations in urine samples

由表4可知，食用不同含砷食品后，尿中砷形態(tài)的存在形式不同。Y2、Y3號樣品中DMA的質(zhì)量濃度較高，說明食用花蛤和海蝦后，尿樣中DMA顯著增加，該現(xiàn)象與Heinrich－Ramm等［22］的研究結(jié)果相似，然而測定花蛤和海蝦中砷形態(tài)時，主要砷形態(tài)為AsB，只含有少量的DMA，推測可能是海鮮中的AsS在人體內(nèi)代謝為DMA，使得尿液中DMA增加；Y5和Y6號樣品中砷形態(tài)主要為AsB，AsB是魚和松茸中砷的主要形態(tài)，人體攝入后被迅速排出，在人體中轉(zhuǎn)化較少，該現(xiàn)象已被Petrick［23］和Wildfang［24］等證實(shí)。由圖2可知，食用皮皮蝦、松茸和海魚后，尿樣中AsB增加明顯；Y2、Y3、Y4號樣品中存在未知峰，即食用花蛤、海蝦和皮皮蝦后尿液中均存在未知峰X1（保留時間為195 s）和X2（保留時間為200 s），對未知峰砷形態(tài)的具體成分有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 論

本研究建立了尿液中砷形態(tài)的高效液相色譜?電感耦合等離子體質(zhì)譜分析方法，以碳酸銨為流動相，可在8 min內(nèi)完成6種砷形態(tài)分析，操作簡便，不同濃度水平的加標(biāo)回收率為91.8% ~ 108%，RSD均小于5.0%，有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)—冷凍人尿中砷形態(tài)（NIST SRM 3669）的測定值在標(biāo)準(zhǔn)值參考范圍內(nèi)。結(jié)果表明，該方法具有靈敏度高、分析時間短、精密度好、準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)，適用于尿中砷形態(tài)的分析，特別適合大批量尿液樣品的快速分析。通過對攝入不同食物志愿者尿液中的砷形態(tài)進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)攝入不同食物后尿中的砷形態(tài)差異較大。該研究可為機(jī)體砷代謝特征和健康效應(yīng)的研究提供方法支持。