超高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測法同時測定重樓消瘤方中5種皂苷類成分含量

胥愛麗，曹穎男，張素中，邱錦燕，謝燦輝，畢曉黎，肖觀林

（1.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東 廣州 510095；2.廣州新華學院 藥學院，廣東 廣州 510520；3.廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室，廣東 廣州 510095；4.廣州中醫(yī)藥大學 第五臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510405）

重樓消瘤方由重樓、柴胡、雞血藤、莪術(shù)等中藥組成，為臨床上應(yīng)用多年、具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗腫瘤中藥驗方。研究發(fā)現(xiàn)其對人肺癌A549細胞在體外具有較高的抑制效果（抑制率> 90%），且能抑制小鼠Lewis肺癌荷瘤模型的腫瘤生長，抗腫瘤效果明顯，對于開發(fā)高效低價的抗腫瘤傳統(tǒng)中藥制劑具有重要的意義和價值［1－2］。

中藥的療效與其制劑的質(zhì)量密切相關(guān)，而評價制劑的質(zhì)量優(yōu)劣可通過化學成分的含量測定來實現(xiàn)，因此，建立重樓消瘤方與抗腫瘤相關(guān)的多成分含量的同時測定方法從而控制制劑質(zhì)量顯得尤為重要。方中君藥重樓為百合科植物云南重樓的干燥根莖，具有清熱解毒、消腫止痛的功效［3］，其主要活性成分為甾體皂苷類，包括重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ等。研究表明，重樓皂苷在直腸癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、鼻咽癌、肝癌等多種惡性腫瘤中均表現(xiàn)出良好的抗腫瘤作用［4－5］。臣藥柴胡為傘形科植物柴胡的干燥根，主要含有揮發(fā)油、皂苷、黃酮等成分［3］。柴胡皂苷是柴胡的主要生物活性成分之一，具有抗腫瘤、抗氧化損傷、抗纖維化和免疫調(diào)節(jié)等作用［6］。柴胡皂苷a和柴胡皂苷d均具有較好的抗腫瘤效果，對于肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等多種癌癥均有抑制作用［7－8］。重樓和柴胡的活性成分均為皂苷類，《中國藥典》中重樓以重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅶ為含量測定指標成分，柴胡以柴胡皂苷a、柴胡皂苷d為指標成分，均采用紫外檢測器，但該類成分只在紫外的末端有吸收，故檢測波長分別設(shè)定為203 nm和210 nm。經(jīng)實驗驗證存在明顯的末端吸收，基線不穩(wěn)定，且中藥復(fù)方制劑的化學成分復(fù)雜，在該波長下干擾測定的雜質(zhì)較多，不適用于復(fù)方中皂苷類成分的測定，而蒸發(fā)光散射檢測器可彌補這些不足［9］。目前，采用二極管陣列檢測器或液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)同時測定重樓藥材中的皂苷類成分已有文獻報道［10－11］，同時測定柴胡藥材中多種皂苷類成分的研究亦有報道［12－13］，但尚無采用超高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測器（UPLC－ELSD）同時測定重樓皂苷和柴胡皂苷的報道。蒸發(fā)光散射檢測器在實際應(yīng)用和操作中比質(zhì)譜更易于推廣，操作和維護更簡便［14－15］。本文采用蒸發(fā)光散射檢測器對復(fù)方制劑中5種皂苷類成分進行同時測定，提高了皂苷類成分含量測定的準確性和檢測效率，為重樓消瘤方的質(zhì)量評價提供了技術(shù)支持，為其進一步的深入開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 儀 器

Agilent 1290超高效液相色譜儀、1260蒸發(fā)光散射檢測器（美國Agilent公司）；KQ700－DE型數(shù)控超聲波清洗機（江蘇昆山超聲儀器有限公司）；XS205DU電子分析天平（瑞士梅特勒公司）。

1.2 材料與試劑

重樓皂苷Ⅰ（批號：111590－201103，純度92.1%）、重樓皂苷Ⅱ（批號：111591－201103，純度93.4%）、重樓皂苷Ⅶ（批號：11593－201303，純度92.5%）、柴胡皂苷a（批號：110777－201108，純度90.5%）、柴胡皂苷d（批號：11590－201103，純度96.0%）均購自中國食品藥品檢定研究院。

乙腈（色譜純，德國Merck公司）；甲醇（分析純，廣州化學試劑廠）；實驗用水為超純水。

10批重樓消瘤方提取物為自制，分別編號為S1 ~ S10。

1.3 標準溶液的配制

標準儲備溶液：分別取柴胡皂苷a、重樓皂苷Ⅶ、柴胡皂苷d、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅰ對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度為374.31、443.63、488.06、470.36、355.87 μg/mL的混合標準儲備溶液。

標準工作溶液：吸取重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅶ、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d標準儲備溶液0.2、0.5、1、3、5 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，混勻，配制成含重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅶ、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d分別為7.117 4 ~ 177.94 μg/mL、9.407 2 ~ 235.18 μg/mL、8.872 6 ~ 221.82 μg/mL、7.486 2 ~ 187.15 μg/mL、9.761 3 ~ 244.03 μg/mL的混合標準工作溶液。

1.4 供試品溶液的制備

取重樓消瘤方提取物約1.0 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入10 mL甲醇，稱定質(zhì)量，超聲（700 W，50 kHz）處理30 min，放冷，用甲醇補足減失的質(zhì)量，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.5 UPLC－ELSD色譜條件

色譜柱為Waters Cortecs UPLC C18（150 mm × 2.1 mm，1.6 μm）；流動相：乙腈（A）－水（B），梯度洗脫：0 ~ 3 min，30% ~ 35% A；3 ~ 9 min，35% ~ 37% A；9 ~ 12 min，37% A；12 ~ 15 min，37% ~ 57%A；15 ~ 20 min，57% ~ 60% A；20 ~ 25 min，60% A；25 ~ 26 min，60% ~ 100% A；26 ~ 31 min，100%A；31 ~ 32 min，100% ~ 30% A；32 ~ 37 min，30% A。流速：0.2 mL/min；柱溫：20 ℃；漂移管溫度：60 ℃；氣體流速：1.5 L/min；增益：2；進樣量：2 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理條件的優(yōu)化

不同種類、不同極性的有機溶劑對待測組分的提取率影響較大，重樓皂苷和柴胡皂苷均易溶于水、甲醇等溶劑，因此考察了水、甲醇、乙醇、70%甲醇、70%乙醇作為提取溶劑時的提取效果（見表1）。結(jié)果表明，乙醇、70%乙醇對待測成分的提取率較低，70%甲醇次之，水和甲醇的提取率差異較小，但以水為溶劑時待測成分的峰形欠佳，且雜峰較多，因此選擇甲醇作為提取溶劑。

表1 不同提取溶劑下5種成分的含量測定結(jié)果Table 1 Determination results of 5 constituents in different extract solvents w/（mg·g?1）

提取時間對該復(fù)方提取物中5種成分的提取亦有影響。分別考察了超聲提取15、30、60 min對5種成分的提取效果，結(jié)果顯示，提取15 min時5種成分的提取率較低，提取時間為30 min和60 min的提取率無顯著差異，即超聲提取30 min可將待測組分提取完全。實驗選擇超聲提取時間為30 min。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 檢測器的選擇本實驗曾嘗試采用《中國藥典》中柴胡、重樓項下收載的含量測定方法的色譜條件進行實驗，采用二極管陣列檢測器，檢測波長分別為210 nm和203 nm，發(fā)現(xiàn)存在明顯的末端吸收，雜峰較多，嚴重干擾待測組分的分離測定（見圖1）?？紤]到柴胡和重樓中的主要有效成分均為皂苷類，故改用蒸發(fā)光散射檢測器進行測定，獲得了滿意的分離效果，去除了雜峰干擾，保證了測定結(jié)果的準確性。

5種皂苷類成分標準溶液和代表性樣品（S1）的色譜圖見圖2。對比圖1和圖2可見，紫外檢測器在低波長下雜峰較多，除了有流動相的本底吸收，還有一些幾乎無發(fā)色團的物質(zhì)的末端吸收，且吸收較低，干擾較大。而采用蒸發(fā)光散射檢測器，流動相已在漂移管中被蒸發(fā)，因此基線平穩(wěn)，留下的揮發(fā)性較小的粒子在光的折射下才會被檢出，ELSD可用于檢測不能被紫外吸收的物質(zhì)，但對于有紫外吸收的組分的檢測靈敏度相對較低，故含量較低的有紫外吸收的雜質(zhì)可能在圖譜中未能顯示，且一些揮發(fā)性高于流動相的物質(zhì)同樣會被蒸發(fā)而檢測不到。因此，對于同樣的樣品，蒸發(fā)光散射檢測器的色譜圖（圖2）與紫外檢測器的色譜圖（圖1）峰數(shù)有差異，是由于復(fù)方制劑中所含復(fù)雜成分的結(jié)構(gòu)性質(zhì)不同所致。

圖1 重樓消瘤方的UPLC－DAD色譜圖Fig.1 UPLC－DAD spectra of Chonglou Xiaolou Formula

圖2 重樓消瘤方的UPLC－ELSD色譜圖Fig.2 UPLC－ELSD spectra of Chonglou Xiaolou Formula

2.2.2 UPLC－ELSD條件的優(yōu)化蒸發(fā)光散射檢測器以不含鹽、易揮發(fā)的溶劑為流動相，故實驗采用C18色譜柱，以乙腈－水為流動相即能對5種皂苷類成分進行較好的分離，經(jīng)過反復(fù)多次實驗，在“1.5”所述的流動相比例下可將雜質(zhì)和待測成分較好分離。對ELSD的漂移管溫度、噴霧氣體流速、增益系數(shù)等參數(shù)進行優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在漂移管溫度為60 ℃，噴霧氣體流速為1.5 L/min，增益系數(shù)為2，加熱模式下，可獲得高的靈敏度和響應(yīng)值。優(yōu)化的色譜檢測條件如“1.5”所示。

2.3 線性關(guān)系、檢出限與定量下限

將“1.3”配制的混合標準工作溶液分別按照上述色譜條件進行測定，以待測成分質(zhì)量濃度的自然對數(shù)為橫坐標（X），對應(yīng)峰面積的自然對數(shù)為縱坐標（Y），繪制標準曲線。由表2可知，重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅶ、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）為0.999 2 ~ 0.999 8，線性范圍分別為7.117 4 ~ 177.94 μg/mL、9.407 2 ~ 235.18 μg/mL、8.872 6 ~ 221.82 μg/mL、7.486 2 ~187.15 μg/mL、9.761 3 ~ 244.03 μg/mL。分別以信噪比S/N= 3及S/N= 10計算該方法的檢出限（LOD）和定量下限（LOQ），得到5種成分的檢出限為0.7 ~ 1.0 μg/mL，定量下限為1.8 ~ 2.4 μg/mL，表明本方法的靈敏度良好。

表2 5種成分的線性關(guān)系、檢出限及定量下限Table 2 Linear relationships，limits of detection and limits of quantitation of 5 components

2.4 精密度

精密吸取供試品溶液（S1）2 μL，注入液相色譜儀中，按“1.5”色譜條件連續(xù)進樣6次，計算得到重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅶ、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d峰面積的相對標準偏差（RSD）分別為1.3%、1.5%、1.3%、0.50%、1.8%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性

取同一批提取物（S1），分別于0、2、4、8、12、18 h進樣測定，計算得到上述5種成分峰面積的RSD分別為0.78%、1.2%、1.9%、0.25%、1.8%，表明供試品溶液在18 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性

取同一批提取物（S1），按“1.3”制備6份供試品，按“1.5”色譜條件依次進樣測定，計算得到上述5種成分峰面積的RSD分別為0.98%、1.7%、1.0%、1.6%、2.1%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.7 回收率與相對標準偏差

取同一批提取物（S1）約0.5 g，平行處理9份，分別精密加入3個質(zhì)量濃度的混合對照品溶液10 mL，制備供試品溶液并依次測定。計算得到上述5種成分的平均加標回收率分別為93.9%、103%、102%、104%、105%，RSD分別為3.8%、4.0%、4.2%、3.6%、3.2%（見表3）。

表3 樣品中5種成分的加標回收率及相對標準偏差（n = 9）Table 3 Average recoveries and relative standard deviations of 5 components in samples（n = 9）

2.8 實際樣品檢測

取10批重樓消瘤方提取物，按照本方法制備供試品溶液并進行測定，計算樣品中5種待測物的含量（見表4）。由表4可知，10批自制重樓消瘤方提取物中均檢出重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅶ、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d，含量分別約為0.17 ~ 0.19 mg/g、0.10 ~ 0.12 mg/g、0.35 ~ 0.37 mg/g、1.37 ~1.49 mg/g、0.17 ~ 0.18 mg/g。結(jié)果表明該復(fù)方提取物的10批樣品之間差異較小，批次間的質(zhì)量較穩(wěn)定，說明該方原料質(zhì)量控制嚴格，制備工藝穩(wěn)定。

表4 10批樣品中5種成分的含量測定結(jié)果（mg/g，n = 3）Table 4 Determination results of 5 constituents in ten batches of samples（mg/g，n = 3）

3 結(jié) 論

本文采用超高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測器建立了重樓消瘤方提取物中5種皂苷類成分同時測定的分析方法，可消除紫外檢測器末端吸收的干擾，5種成分的平均回收率為93.9% ~ 105%，相對標準偏差為3.2% ~ 4.2%。將本法用于10批復(fù)方制劑樣品的測定，發(fā)現(xiàn)批間差異較小。該方法分析快速、操作簡便、準確可靠、靈敏度高，可同時定量分析復(fù)方制劑中的5種皂苷類成分，對于重樓消瘤方的質(zhì)量評價具有指導(dǎo)意義。