miR-30a-5p調(diào)控ECM-受體作用信號(hào)通路相關(guān)蛋白抑制肺腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移

夏建洪 周立慶 嚴(yán)研 馬婷婷 蘇欣宇

肺腺癌是最常見(jiàn)的肺癌類型。盡管學(xué)者在肺腺癌的診斷和治療策略上已經(jīng)取得了進(jìn)展，但肺腺癌的死亡率依然很高。因此，闡明肺腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，尋找早期檢測(cè)的新方法和新的分子治療靶點(diǎn)非常必要。微小RNA（microRNA，miRNA）是一種小的、高度保守的非編碼RNA分子，是一種有前途的生物標(biāo)志物，可用于早期癌癥的檢測(cè)和準(zhǔn)確的預(yù)后，并可作為癌癥治療的靶點(diǎn)[1-2]。miRNA的表達(dá)水平與肺腺癌細(xì)胞的生物學(xué)功能息息相關(guān)[3-4]。miR-30家族包括 miR-30a、miR-30b、miR-30c-1、miR-30c-2、miR-30d、miR-30e，這些基因在不同腫瘤中也起著重要的作用[5-7]。作為miR-30家族的一員，miR-30a-5p也被大家廣泛研究。盡管miR-30a-5p已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)其可以調(diào)控乳腺癌[8]、膽囊癌[9]、肝癌[10]、腎細(xì)胞癌[11]和口腔癌[12]等腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展，但其在肺腺癌細(xì)胞中的功能和機(jī)制還鮮有研究。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析、分子實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)探究miR-30a-5p與細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）-受體作用信號(hào)通路相關(guān)蛋白對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的調(diào)節(jié)作用，為尋找肺腺癌新的靶向治療方法提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料 肺腺癌細(xì)胞系SPC-A1（批號(hào)：BNCC100120）、Calu-3（批號(hào)：BNCC338514）、HCC827（批號(hào)：BNCC342007）、PC14（批號(hào)：BNCC341851）以及人正常支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B（批號(hào)：BNCC338205）均購(gòu)自中國(guó)北納生物科技公司。miR-30a-5p模擬物及其陰性對(duì)照（批號(hào)：miR10000087-1-5）、miR-30a-5p抑制劑及其陰性對(duì)照（批號(hào)：miR20000087-1-5）均購(gòu)自中國(guó)銳博生物公司；Trizol試劑（批號(hào)：10296010）、PBS（批號(hào)：10010072）、免疫沉淀分析裂解緩沖液（批號(hào)：FNN0011），BCA試劑盒（批號(hào)：23227）、聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（批號(hào)：B1000B）均購(gòu)自美國(guó) Thermo Fisher公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒M-MLV reverse transcriptase（批號(hào)：18057018）、Lipofectamine 2000試劑（批號(hào)：11668019）均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；7500 real-time PCR system（批號(hào)：4351107）購(gòu)自德國(guó)Applied Biosystems公司；含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)：PM150210B）購(gòu)自武漢普諾賽賽生命科技有限公司；TBST溶液（批號(hào)：28360）購(gòu)自中國(guó)Solarbio公司；二抗山羊抗兔IgG（1∶2 000，批號(hào)：ab205718）、一抗為兔抗纖維連接蛋白（Fibronectin）（1∶1 000，批號(hào)：ab32419）、兔抗磷酸化纖維連接蛋白（p-Fibronectin）（1∶1 000，批號(hào)：ab3349826）、兔抗 E-鈣黏蛋白（E-Cadherin）（1∶500，批號(hào)：ab15148）、兔抗磷酸化E-鈣黏蛋白（p-ECadherin）（1∶5 000，批號(hào)：ab226779），兔抗 β-actin（1∶200，批號(hào)：ab115777）均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；EC試劑盒（批號(hào)：P0018S）購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（批號(hào)：D5879-100 ml）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；分光光度計(jì)（型號(hào)：N50 Touch）購(gòu)自德國(guó)Implen公司；ECM-受體作用信號(hào)通路通道相關(guān)蛋白抑制劑（ML327，HY-103038）購(gòu)自美國(guó)Medchemexpress公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將4種肺腺癌細(xì)胞及上皮BEAS-2B細(xì)胞放在含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 將Calu-3細(xì)胞接種于24孔板（1×105個(gè)細(xì)胞/孔）中，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到70%～80%時(shí)，根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)使用Lipofectamine 2000 Reagent將miR-30a-5p模擬物及其陰性對(duì)照（設(shè)為miR-30a-5p模擬物組、模擬物對(duì)照組）、miR-30a-5p抑制劑及其陰性對(duì)照（設(shè)為miR-30a-5p抑制劑組、抑制劑對(duì)照組）轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)，隨后，將細(xì)胞放置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞行進(jìn)一步分析。在miR-30a-5p抑制劑組的細(xì)胞中加入ECM-受體相互作用通路相關(guān)蛋白抑制劑，設(shè)為miR-30a-5p抑制劑+ECM-受體相互作用抑制劑組。

1.2.3 miR-30a-5p的mRNA水平檢測(cè) 采用qRTPCR法。使用Trizol試劑從細(xì)胞中提取總RNA，并使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將miRNA轉(zhuǎn)化為cDNA。然后使用7500 real-time PCR system進(jìn)行qRT-PCR。以U6為miR-30a-5p的標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參，miR-30a-5p上游引物：5'-TACGGATCCCCTTCATCTTACTTTTTTCCCCCAA-3'，下游引物：5'-ATCGCTAGCGAAACTAGAAGCTCGGTGATGAATA-3'；U6 上 游 引 物 ：5'-GGTCGGGCAGGAAAGAGGGC-3'；下游引物：5'-GCTAATCTTCTCTGTATCGTTCC-3'。采用 2-ΔΔCt法計(jì)算不同處理組細(xì)胞中miR-30a-5p相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 ECM-受體作用信號(hào)通路相關(guān)蛋白（Fibronectin和E-cadherin）的表達(dá)水平及磷酸化水平檢測(cè) 采用Western blot法。將細(xì)胞用冷PBS洗滌3次，加入免疫沉淀分析裂解緩沖液后在冰上裂解10 min，采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白水平。4℃12 000 r/min離心20 min，提取蛋白。將蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用含5%脫脂牛奶的PBS孵育過(guò)夜，加入一抗，4℃孵育過(guò)夜，一抗孵育結(jié)束后，用TBST溶液室溫下?lián)u床搖動(dòng)洗膜3次，5 min/次。結(jié)束后加入二抗山羊抗兔IgG進(jìn)行孵育，同樣用TBST溶液洗膜3次，5 min/次。用ECL試劑盒拍照觀察蛋白印記，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 采用噻唑藍(lán)[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT]實(shí)驗(yàn)。將上述1.2.2部分轉(zhuǎn)染的肺腺癌細(xì)胞Calu-3以每孔4 000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中。分別培養(yǎng)0、24、48、72 h后，每孔中添加20 μl MTT溶液（0.5 mg/ml），在37℃下孵育4 h，丟棄上層液，加入200 μl DMSO溶解細(xì)胞。在490 nm波長(zhǎng)處用分光光度計(jì)測(cè)量吸光度值。

1.2.6 細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 采用細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，密度為每孔2×105個(gè)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%的融合度時(shí)，用100 μl無(wú)菌移液管輕輕刮擦穿過(guò)孔中心的單層。細(xì)胞用PBS洗滌后，在含有2%FBS的DMEM中孵育24 h，用顯微鏡觀察細(xì)胞遷移情況并拍照。

1.2.7 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。Transwell過(guò)濾器的上表面涂有Matrigel。取上述1.2.2部分轉(zhuǎn)染后的肺腺癌細(xì)胞Calu-3進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（即融合度達(dá)到70%-80%時(shí)），將細(xì)胞添加于Transwell的上室，下室加入200 μl含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。37℃孵育24 h后，輕輕取出濾膜和培養(yǎng)基，用棉簽刮除過(guò)濾器上表面未被侵入的細(xì)胞，然后用4%甲醛溶液固定膜下細(xì)胞20 min，細(xì)胞用0.1%結(jié)晶紫染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察入侵細(xì)胞并拍照。

1.2.8 生物信息學(xué)方法 通過(guò)癌癥基因組圖譜（the Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)（https://portal.gdc.cancer.gov/）下載表達(dá)量數(shù)據(jù)，利用“edgeR包”進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化分析，以miR-30a-5p表達(dá)量中位數(shù)進(jìn)行分組，利用基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）軟 件（http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp）對(duì)miR-30a-5p進(jìn)行通路富集分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌細(xì)胞系和人正常支氣管上皮細(xì)胞中miR-30a-5p表達(dá)水平比較 與人正常支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B比較，肺腺癌細(xì)胞系SPC-A1、Calu-3、HCC827、PC14中miR-30a-5p表達(dá)水平均下調(diào)（均P＜0.05），其中Calu-3細(xì)胞系miR-30a-5p表達(dá)水平相對(duì)較低，故采用Calu-3細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)的功能實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)圖1。

圖1 肺腺癌細(xì)胞系和人正常支氣管上皮細(xì)胞中miR-30a-5p表達(dá)水平比較

2.2 miR-30a-5p模擬物對(duì)Calu-3細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 miR-30a-5p模擬物組Calu-3細(xì)胞中miR-30a-5p表達(dá)水平高于模擬物對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)圖2A。培養(yǎng)0、24、48和72 h后，miR-30a-5p模擬物組Calu-3細(xì)胞的增殖能力低于模擬物對(duì)照組（均P＜0.05），見(jiàn)圖2B。miR-30a-5p模擬物組Calu-3細(xì)胞的遷移能力低于模擬物對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)圖2C。miR-30a-5p模擬物組Calu-3細(xì)胞的侵襲能力也低于模擬物對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)圖2D。這些結(jié)果顯示上調(diào)miR-30a-5p可以抑制肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

圖2 miR-30a-5p 模擬物對(duì)Calu-3 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響（A：miR-30a-5p 模擬物組和模擬物對(duì)照組Calu-3 細(xì)胞中miR-30a-5p 的表達(dá)水平比較；B：miR-30a-5p 模擬物組和模擬物對(duì)照組Calu-3 細(xì)胞的增殖水平比較；C：miR-30a-5p 模擬物組和模擬物 對(duì)照組Calu-3 細(xì)胞的遷移變化比較，×40；D：miR-30a-5p 模擬物組和模擬物對(duì)照組Calu-3 細(xì)胞的侵襲能力比較，0.1%結(jié)晶紫染 色，×100）

2.3 miR-30a-5p通過(guò)調(diào)控ECM-受體作用信號(hào)通路相關(guān)蛋白抑制Calu-3細(xì)胞的侵襲和遷移 GSEA通路富集分析結(jié)果顯示，在Calu-3細(xì)胞中，miR-30a-5p顯著富集在ECM-受體作用信號(hào)通路上，見(jiàn)圖3A。與抑制劑對(duì)照組相比，miR-30a-5p抑制劑組中Fibronectin和E-cadherin的磷酸化水平均上調(diào)（均P＜0.05），miR-30a-5p抑制劑+ECM-受體相互作用抑制劑組Fibronectin和E-cadherin的磷酸化水平得到恢復(fù)，見(jiàn)圖3B。與抑制劑對(duì)照組相比，miR-30a-5p抑制劑組Calu-3細(xì)胞的增殖能力提高（P＜0.05），miR-30a-5p抑制劑+ECM-受體相互作用抑制劑組Calu-3細(xì)胞的增殖能力得到恢復(fù)，見(jiàn)圖3C。還發(fā)現(xiàn)，與抑制劑對(duì)照組相比，miR-30a-5p抑制劑組Calu-3細(xì)胞的遷移能力上調(diào)（P＜0.05），miR-30a-5p抑制劑+ECM-受體相互作用抑制劑組Calu-3細(xì)胞的遷移能力得到恢復(fù)，見(jiàn)圖3D。同樣，與抑制劑對(duì)照組相比，miR-30a-5p抑制劑組Calu-3細(xì)胞的侵襲能力上調(diào)（P＜0.05），miR-30a-5p抑制劑+ECM-受體相互作用抑制劑組Calu-3細(xì)胞的侵襲能力得到恢復(fù)，見(jiàn)圖3E。這些結(jié)果表明miR-30a-5p是通過(guò)調(diào)控ECM-受體作用信號(hào)通路相關(guān)蛋白的磷酸化水平抑制肺Calu-3細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

圖3 miR-30a-5p通過(guò)調(diào)控ECM-受體作用信號(hào)通路相關(guān)蛋白抑制Calu-3細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲（A：miR-30a-5p的GSEA富集通路；B：各處理組細(xì)胞ECM-受體作用信號(hào)通路相關(guān)蛋白磷酸化水平及蛋白表達(dá)水平比較；C：各處理細(xì)胞組處理后的增殖水平比較；D：各處理組細(xì)胞處理后的遷移能力比較，×40；E：各處理組細(xì)胞處理后的侵襲能力比較，0.1%結(jié)晶紫染色，×100）

3 討論

肺腺癌是最常見(jiàn)的肺癌類型，嚴(yán)重危害著人類的生存。雖然肺腺癌的治療已經(jīng)取得了相當(dāng)大的進(jìn)展，包括手術(shù)切除、化療、放療或這些方法的結(jié)合，但患者的5年生存率仍然處于較低水平[13]。研究證明，miRNA作為致癌或抑癌基因調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能，包括細(xì)胞分化、侵襲、增殖、凋亡等功能[14-15]。作為miR-30a家族中的一員，miR-30a-5p已經(jīng)被證實(shí)與腫瘤的生長(zhǎng)有著必要的關(guān)系[16-18]。本研究證實(shí)miR-30a-5p在肺腺癌細(xì)胞中低表達(dá)，而后的功能實(shí)驗(yàn)也證明了在肺腺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-30a-5p明顯抑制了細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，因此miR-30a-5p在肺腺癌細(xì)胞中很可能是一個(gè)抑癌因子，這與先前許多的研究相一致。例如，miR-30a-5p能夠通過(guò)阻斷F-盒蛋白45（F-box protein 45，F(xiàn)BXO45）的表達(dá)抑制肺鱗狀細(xì)胞癌增殖[19]；還能夠通過(guò)靶向核苷酸 2（nucleobindin 2，NUCB2）來(lái)抑制鼻咽癌的進(jìn)展[20]。

ECM-受體相作用信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，其在腫瘤的脫落、黏附、降解、運(yùn)動(dòng)和增生過(guò)程中都起著重要的作用[21]。Yan等[22]發(fā)現(xiàn)ECM參與了胃癌腫瘤細(xì)胞的侵襲過(guò)程。姜黃素能夠通過(guò)抑制致癌轉(zhuǎn)錄因子 AP-2 α（transcription factor AP-2 alpha，TFAP2A）介導(dǎo)的ECM途徑抑制LGR5（+）結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的增殖[23]。同樣的，本研究對(duì)miR-30a-5p的GSEA通路富集結(jié)果顯示miR-30a-5p明顯富集在ECM-受體作用信號(hào)通路上。因此，本研究通過(guò)Western blot法檢測(cè)了ECM-受體作用信號(hào)通路相關(guān)蛋白磷酸化水平，實(shí)驗(yàn)證明在肺腺癌細(xì)胞中下調(diào)miR-30a-5p顯著促進(jìn)了ECM-受體作用信號(hào)通路相關(guān)蛋白的磷酸化水平。最后的功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-30a-5p通過(guò)調(diào)控ECM-受體作用信號(hào)通路促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，本研究表明miR-30a-5p在肺腺癌細(xì)胞中顯著下調(diào)，miR-30a-5p對(duì)肺腺癌細(xì)胞有負(fù)調(diào)節(jié)作用，過(guò)表達(dá)miR-30a-5p能抑制肺腺癌細(xì)胞的生物學(xué)功能。而且miR-30a-5p對(duì)肺腺癌細(xì)胞的影響有部分是通過(guò)調(diào)控ECM-受體作用信號(hào)通路相關(guān)蛋白達(dá)到的。本研究結(jié)果有助于深入了解miR-30a-5p在肺腺癌中的作用，miR-30a-5p也有望成為肺腺癌早期診斷和臨床治療的分子靶向。