綿羊的胚胎移植技術(shù)要點(diǎn)分析

郭振剛，宋德榮，吳瑛，吳道全，吳萍*

1.貴州省畢節(jié)市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，貴州畢節(jié) 551700；2.貴州新烏蒙生態(tài)牧業(yè)發(fā)展有限公司，貴州赫章 553200；3.貴州省畢節(jié)市老科學(xué)技術(shù)工作者協(xié)會(huì)，貴州畢節(jié) 551700

羊的胚胎移植是指將供體羊進(jìn)行超數(shù)排卵配種后回收早期胚胎，移植到同一品種生理狀況相同的另一只受體體內(nèi)繼續(xù)妊娠產(chǎn)生后代羔羊的技術(shù)。該技術(shù)以“借腹懷胎”的方式，達(dá)到增加良種后代的目的，以胚胎冷凍保存的方式，達(dá)到對(duì)優(yōu)良畜禽遺傳資源的保護(hù)，為遺傳資源保護(hù)和開發(fā)利用提供了技術(shù)支撐。提供胚胎的個(gè)體稱為供體，接受胚胎的個(gè)體稱為受體[1]。胚胎移植最早應(yīng)用于牛的繁育，羊的胚胎移植起步晚、發(fā)展慢。但是近年來，胚胎移植在羊的生產(chǎn)應(yīng)用中研究增多，主要集中在超排處理、移植妊娠率、胚胎冷凍保存等方面，為該技術(shù)的推廣及產(chǎn)業(yè)化夯實(shí)了基礎(chǔ)。本文將從供受體羊的選擇與管理、移植季節(jié)選擇、藥物和器械準(zhǔn)備、手術(shù)方法選擇、沖胚及移植過程、胚胎冷凍保存、影響因素及應(yīng)用前景等方面簡述分析綿羊胚胎移植技術(shù)要點(diǎn)，以期為開展胚胎移植并取得良好效果提供參考。

1 供受體母羊的選擇

1.1 供體母羊的選擇原則

生產(chǎn)中，供體母羊受遺傳價(jià)值、健康狀況、既往繁殖史、年齡和胎次、體質(zhì)體況等方面的影響，一般選擇2～4 周歲的經(jīng)產(chǎn)母羊較為適宜[2]。供體母羊要提前選擇，群體數(shù)量要大，以保證有足夠的數(shù)量來觀察發(fā)情周期，調(diào)整膘情在7 成以上，不宜過肥或過瘦。若供體母羊在喂乳期間，必須斷奶30d 后再選擇，且要加強(qiáng)補(bǔ)飼，恢復(fù)體況。

1.2 受體母羊的選擇原則

選擇受體母羊不需要考慮遺傳性能、種用價(jià)值，而要注重健康狀況、繁殖性能，只要能適應(yīng)當(dāng)?shù)貧夂颦h(huán)境條件，繁殖性能好，母性強(qiáng)，無傳染性疾病和膘情在7 成以上皆可。

2 供受體羊術(shù)前管理

供受體羊，因?yàn)榻邮芘咛ヒ浦?，需要?jīng)歷手術(shù)折磨，所以，做好飼養(yǎng)管理非常必要。一是要保持飼養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定，避免出現(xiàn)應(yīng)激；二是要提供合理的日糧配方及青干草，保持一定的膘情；三是要提供清潔、衛(wèi)生的飲水，保證健康；此外，還要做好羊群的登記，建立胚胎移植數(shù)據(jù)庫，做到科學(xué)、精準(zhǔn)管理供受體羊。

3 胚胎移植季節(jié)的選擇

研究表明，品種、光照、溫度等都能影響羊的發(fā)情周期，大部分綿羊品種表現(xiàn)為明顯的季節(jié)性，少數(shù)為常年發(fā)情[3]。在每年的秋季，母羊的卵巢機(jī)能開始活躍，卵泡發(fā)育成熟，表現(xiàn)出發(fā)情特征；在春夏冬等季節(jié)，母羊的卵巢機(jī)能基本處于靜默狀態(tài)，卵泡不發(fā)育，不表現(xiàn)發(fā)情和排卵[4]。因此，選擇胚胎移植的適宜季節(jié)，要根據(jù)氣候變化、羊的發(fā)情狀況等來選擇，最好是在羊的繁殖季節(jié)開展，效率最高。

4 供體羊輸精的選擇

供體羊撤栓12 h 后將試情公羊放入羊群進(jìn)行試情，將發(fā)情母羊標(biāo)記、隔離。配種可以采用2 種方式，自然交配（人工輔助交配）和人工授精。前者較為簡單，將公母羊合群后，觀察爬跨，登記即可，但要注意，間隔8 h 后，復(fù)配1 次，直到母羊不接受爬跨為止；人工授精可以采用傳統(tǒng)人工授精或腹腔鏡人工授精技術(shù)。借助腹腔鏡授精可以將精液直接送入母羊子宮角內(nèi)，該方法可以克服傳統(tǒng)輸精由于母羊子宮頸管道構(gòu)造特殊、精子不易通過所導(dǎo)致的情期受胎率低的問題，大大提高了受胎率，但最好也間隔12 h 再輸精1 次。

5 藥品及手術(shù)器械的準(zhǔn)備

在胚胎移植工作中使用的藥物，必須廠家可靠，有效成分含量準(zhǔn)確，經(jīng)試驗(yàn)表明性能穩(wěn)定，并且按照藥物運(yùn)輸和保存條件妥善運(yùn)輸和保存[5]。主要藥物和器械如下：收卵器械包括沖卵管、腸鉗套乳注射器、膠管、帶硅膠管的16 號(hào)針頭、集卵杯、燒杯。檢卵設(shè)備包括體視顯微鏡、六孔杯、回收管、二氧化碳?xì)怏w、培養(yǎng)箱、帶硅膠管的7 號(hào)針頭、平底蒸發(fā)皿、顯微操作儀及附件。移植手術(shù)時(shí)還需要注射器、移卵針。手術(shù)器械包括毛剪、外科剪、刀片、外科刀、創(chuàng)巾鉗、活動(dòng)刀柄、手術(shù)鑷、縫合線、止血鉗、持針器、縫合針、創(chuàng)巾若干、手術(shù)保定架、紫外燈、高壓消毒鍋。藥品及試劑包括FSH 和PMSG、普魯卡因、腎上腺素及止血藥品、2%靜松靈、紗布、藥棉、抗生素及其他消毒液、生理鹽水等[6]。

6 超數(shù)排卵與同期發(fā)情

6.1 超數(shù)排卵原理

超數(shù)排卵是指在發(fā)情周期的任一時(shí)間，對(duì)母羊注射外源激素，如FSH 和PMSG 等，增加血液中促性腺激素濃度，使發(fā)育卵泡的閉鎖率降低，增加卵泡發(fā)育成熟的數(shù)量，從而排出比自然發(fā)情情況下多的卵子[7]。

6.2 超數(shù)排卵方法

目前，最常采用的超排處理方法是：陰道孕酮栓+PMSG+FSH 法。如郭振剛等[8]在貴乾半細(xì)毛羊上的研究表明，采取埋置海綿孕酮栓+PMSG 法進(jìn)行同期發(fā)情及遞減法注射FSH 進(jìn)行超數(shù)排卵處理及自然交配后，手術(shù)法子宮角回收供體胚胎，結(jié)果10 只供體共計(jì)獲得胚胎106 枚，可利用胚胎73 枚，平均沖胚達(dá)10.60 枚/只，平均可用胚胎7.30 枚/只，胚胎合格率達(dá)68.87%，試驗(yàn)結(jié)果達(dá)到國內(nèi)同類研究的平均水平。

6.3 受體羊的同期發(fā)情

同期發(fā)情是受體羊處于與供體羊同一生理基礎(chǔ)的先決條件，發(fā)情生理越接近，胚胎移植后的受胎率就越高[9]。如王玉琴等[10]研究表明，采用2～12 h的擴(kuò)展囊胚進(jìn)行移植，妊娠率可達(dá)94.74%。這是由于胚胎只能移植到與之發(fā)育要求相適應(yīng)的受體生殖環(huán)境中，才能繼續(xù)發(fā)育。因此，如采用鮮胚進(jìn)行移植，在供體超排的同時(shí)，必須對(duì)受體進(jìn)行同期發(fā)情處理，使之生殖生理狀態(tài)與供體同步化。

7 供體羊手術(shù)沖胚檢胚以及受體羊的手術(shù)移植

7.1 手術(shù)

術(shù)前準(zhǔn)備。超排前供受體母羊禁食至少24 h，術(shù)前2 h 禁水。

保定。利用胚胎移植手術(shù)架躺臥式保定，將四肢固定在手術(shù)架上，防止手術(shù)中劇烈活動(dòng)。

備皮處理。羊只保定麻醉后，用肥皂水浸濕乳房周邊約10 cm 直徑的肚腹，用刮毛刀或刀片刮凈羊毛，注意不要?jiǎng)潅つw，再使用毛巾擦拭干凈皮膚，最后用酒精噴灑消毒，覆蓋手術(shù)創(chuàng)巾，以創(chuàng)巾鉗固定四角，推進(jìn)手術(shù)室靜待手術(shù)。

手術(shù)。手術(shù)時(shí)，在乳靜脈與腹中線之間，用手術(shù)刀切開皮膚及筋膜，倒過手術(shù)刀，以鈍頭分離腹直肌或前拉腹直肌，顯露腹股溝管處，在腹股溝管處剪開或用手術(shù)刀鈍頭直接剖開以顯露腹腔。切口不宜過大，否則影響縫合和愈合，也不能過小，不方便取出子宮而對(duì)子宮造成刺激或損失，大小1.5～2.0 cm寬。腹腔暴露后，伸進(jìn)食指和中指在骨盆腔、膀胱周圍觸摸子宮，然后輕輕勾住子宮體，將卵巢、子宮拉出，查看黃體位置并記錄。

7.2 沖胚

沖胚方法分為輸卵管法、沖卵管法和子宮法，生產(chǎn)中多采用輸卵管法和子宮法。

輸卵管沖胚法：操作時(shí)，將沖卵管一端從輸卵管傘部喇叭口插入6#、8#頭皮針，進(jìn)入2～3 cm深處，打活結(jié)或用鈍圓夾子固定，另一端接集卵器，用注射器吸取37 ℃沖卵液5～10 mL，在子宮角靠近輸卵管部位，將針頭朝輸卵管方向扎入，一人操作時(shí)，一只手的手指在針頭后方捏緊子宮角，另一只手推注射器，沖卵液由宮管結(jié)合部流入輸卵管，經(jīng)輸卵管流至集卵器。此種方法的優(yōu)點(diǎn)是卵的回收率高、沖卵液用量少、檢卵省時(shí)，缺點(diǎn)是容易造成輸卵管傘部粘連[11]。

子宮角沖胚法：在供體羊發(fā)情后6～7 d 采卵，將子宮暴露后，用套有膠管的腸鉗夾在子宮角分叉處，用注射液吸入沖卵液20～30 mL，將沖卵針頭（套管針）從子宮角尖端插入，確認(rèn)針頭在子宮角宮腔內(nèi)后連接注射器，緩緩注入沖卵液。當(dāng)子宮角出現(xiàn)膨脹時(shí)，立即將回收卵針頭從腸鉗基部的上方迅速插入，引導(dǎo)沖卵液收集于集卵杯內(nèi)。相同方法對(duì)另一側(cè)子宮進(jìn)行沖卵。進(jìn)針時(shí)避免損傷血管。該法的優(yōu)點(diǎn)是子宮角沖卵法對(duì)輸卵管損傷較小，主要用于超排母羊發(fā)情后的5.5～6 d，從子宮可以收集到桑椹胚至擴(kuò)展囊胚，此時(shí)的胚胎可用于移植、冷凍或其他研究等，但該方法的缺點(diǎn)是胚胎的回收率較低。

7.3 檢胚

鑒別可用胚胎和不可用胚胎是進(jìn)行下一步胚胎移植的關(guān)鍵，只有發(fā)育良好的胚胎才能用于移植，否則嚴(yán)重影響移植受胎率。一般來說，可用胚胎是卵裂球輪廓清晰、球體圓滑又飽滿，而不可用胚胎表面不光滑、有毛邊且不圓。卵裂球輪廓清楚、球體飽滿、透明度適中鑒定為1 級(jí)；1/3 卵裂球死亡的可鑒定為2 級(jí)；1/2 卵裂球死亡鑒定為3 級(jí)；其余定為4級(jí)[12]。只有1、2、3 級(jí)胚胎方可用于移植。

7.4 移植

胚胎移植可采用手術(shù)法和腹腔鏡法。

手術(shù)法，在掏出子宮和卵巢后，查看黃體發(fā)育狀況，在黃體側(cè)，用鈍形針頭在子宮角穿孔，將移植管沿子宮角方向插入宮腔，注射胚胎，隨即輕輕復(fù)位子宮，縫合皮膚。胚胎移植時(shí)，原則上來自輸卵管的胚胎移入輸卵管，來自子宮角的胚胎移入子宮角的前1/3 處。

腹腔鏡法，借助腹腔鏡找到子宮，再以胚胎移植針從另一側(cè)進(jìn)入腹腔，將胚胎注射到相應(yīng)位置。該方法操作簡便，但是需要一定的經(jīng)驗(yàn)。

7.5 縫合

創(chuàng)口縫合按照外科手術(shù)操作原則進(jìn)行?？p合過程中不得觸碰其他無關(guān)物品。操作時(shí)要迅速、細(xì)心，不讓子宮體長時(shí)間暴露。切忌多次、用力拉扯子宮。胚胎移植后，仔細(xì)檢查移植器中是否有胚胎遺漏，確認(rèn)無遺漏后方可縫合。手術(shù)創(chuàng)口采用2 層縫合法，內(nèi)肌層縫合和皮膚縫合，縫合肌肉層后撒適量青霉素、鏈霉素粉，以防止創(chuàng)口感染，縫合皮膚后用碘酒消毒處理。

8 術(shù)后受體的飼養(yǎng)管理

胚胎移植后的受體，要精心觀察和護(hù)理，注意返情。若發(fā)現(xiàn)受體發(fā)情，要做進(jìn)一步的觀察和檢查。在移植后45 d 左右，可采用獸用B 超進(jìn)行早期妊娠診斷。對(duì)已妊娠的受體要分群管理，預(yù)防流產(chǎn)，同時(shí)補(bǔ)充營養(yǎng)全面的飼草料，既要保證胎兒的正常發(fā)育，又要避免發(fā)育過度而引起難產(chǎn)。另外，還要根據(jù)當(dāng)?shù)丶膊“l(fā)生情況，及時(shí)接種相應(yīng)疫苗。

9 影響胚胎移植效果的因素

9.1 受體羊品種

受體羊品種的選擇，在胚胎移植中具有至關(guān)重要的作用。研究表明，不同品種用作受體羊移植單胚時(shí)，妊娠率和胚胎成羔率均無差異，但是移植雙胚胎時(shí)，胚胎妊娠率和胚胎成羔率有顯著差異[13]。

9.2 移植胚胎數(shù)量

趙霞[14]研究表明，移植2 枚和3 枚胚胎時(shí)山羊的妊娠率顯著高于1 枚。黃承俊等[15]研究也表明，移植2、3 枚胚胎的妊娠率明顯高于移植1 枚胚胎時(shí)的妊娠率。因此，實(shí)際生產(chǎn)中，應(yīng)根據(jù)羊的品種、體型大小及獲得的有效胚胎數(shù)量等來確定最佳移植數(shù)量。

9.3 采胚方法

研究表明，輸卵管法平均采集可用胚數(shù)高于子宮角法，但是子宮角法采胚更具較高的妊娠率和產(chǎn)羔率，是理想的采胚方法[16]。腹腔鏡技術(shù)可縮短單次移植時(shí)間，減少手術(shù)損傷，利于動(dòng)物健康，在加速胚胎移植的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用中則更為廣泛。

10 胚胎移植技術(shù)的應(yīng)用前景

作為最實(shí)用的高效繁育技術(shù)，胚胎移植可以結(jié)合優(yōu)良公羊和母羊的品種優(yōu)勢(shì)，同時(shí)作為人工授精技術(shù)的延伸，將在家畜品種培育和改良中得到廣泛應(yīng)用。一方面，通過人工授精充分發(fā)揮良種公羊的覆蓋率，另一方面，胚胎移植還可以充分發(fā)揮優(yōu)良母羊的生產(chǎn)性能，這對(duì)羊的高效繁育具有重要的意義。而隨著整個(gè)胚胎移植技術(shù)體系的不斷優(yōu)化，其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用也將進(jìn)一步得到提高。