苦參的指紋圖譜建立及差異性成分含量測定 Δ

董曉龍 ，沈佳捷 ，朱佳鈺 ，王夢嬌 ，鄒立思 ，潘林梅 ， ， （1.南京中醫(yī)藥大學藥學院，南京 100；.江蘇省植物藥深加工工程研究中心，南京 100；.江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協同創(chuàng)新中心，南京 100；.江蘇省經典名方工程研究中心，南京 100）

苦參為豆科植物苦參Sophora flavescens Ait.的干燥根，主產于我國河南、山東、安徽等地，始記于《神農本草經》。苦參性寒、味苦，具有鎮(zhèn)痛、抗菌、抗腫瘤等多種功效[1]?，F代研究發(fā)現，苦參主要活性成分為生物堿類和黃酮類化合物。其中，生物堿類物質包括氧化苦參堿、氧化槐果堿和苦參堿等，均有較好的鎮(zhèn)痛、抗腫瘤作用，尤以苦參堿的作用最為顯著；黃酮類物質包括三葉豆紫檀苷、苦參酮和降苦參酮等，其中三葉豆紫檀苷具有較好的抗菌活性，苦參酮和降苦參酮均具有較好的抗腫瘤作用[2―3]?？梢?，這些成分可能是苦參的主要活性成分。

隨著中藥事業(yè)的飛速發(fā)展，中藥質量參差不齊等一系列問題也日益突顯。藥材質量對臨床用藥的安全性和有效性有著直接影響。中藥指紋圖譜可以反映出各種化學成分的整體狀態(tài)，對評估藥材質量優(yōu)劣、真?zhèn)渭氨ＷC其質量的一致性、穩(wěn)定性具有突出貢獻。中藥指紋圖譜與化學模式識別分析相結合，可從多個方面評價藥材質量。常用的化學模式識別分析方法有聚類分析、主成分分析、正交偏最小二乘法-判別分析等[4―6]?；诖耍狙芯坎捎酶咝б合嗌V（HPLC）法建立12批苦參藥材的指紋圖譜，同時，結合3種化學模式識別分析方法對影響苦參藥材質量的差異性成分進行含量測定，以期為苦參藥材質量控制提供依據。

1 材料

1.1 主要儀器

Waters e2695型HPLC儀及配套的Waters 2998檢測器均購自美國Waters公司；BBA224S-CW型電子天平購自賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；TGL-16C型離心機購自上海安亭科學儀器廠；ARIUM-COMFOT-Ⅰ型超純水一體機購自南京易普易達科技發(fā)展有限公司；AP-01P型真空泵購自天津奧特賽恩斯儀器有限公司；KH-500V型超聲波清洗器購自昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

降苦參酮（批號DSTDK003001，純度≥95%）、苦參酮對照品（批號DST200303-020，純度≥98%）均購自成都德思特生物技術有限公司；三葉豆紫檀苷、氧化槐果堿、苦參堿、氧化苦參堿對照品（批號分別為Y11J11H10-8216、P07M10S82334、T03F9F54046、Y30S6Y17043，純度均不低于98%）均購自上海源葉生物科技有限公司。本研究所用苦參藥材共12個批次（編號為S1～S12，其中S1～S7產自陜西商州區(qū)、S8～S10產自河南伊川縣、S11～S12產自內蒙古赤峰市），經南京中醫(yī)藥大學藥學院劉圣金教授鑒定均為豆科植物苦參S. flavescens Ait.的干燥根。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

以 Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱；以乙腈（A）-20 mmol/L磷酸二氫鉀溶液（pH7.5）（B）為流動相進行梯度洗脫（0～13 min，10%A→23%A；13～23 min，23%A→29%A；23～42 min，29%A→48%A；42～50 min，48%A→52%A；50～60 min，52%A→60%A；60～65 min，60%A→10%A）；檢測波長為 260 nm；流速為0.8 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL。

2.2 混合對照品溶液的制備

取降苦參酮、苦參酮、三葉豆紫檀苷、氧化槐果堿、苦參堿、氧化苦參堿對照品各適量，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，即得各對照品貯備液。分別取適量上述6種對照品貯備液，置于同一10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容，制得上述成分質量濃度分別為81.6、55.2、67.2、72.3、108.3、84.9 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取苦參藥材粉末（過三號篩）0.5 g，精密稱定，放入100 mL錐形瓶中，加入20 mL甲醇，稱質量；超聲（功率250 W，頻率40 kHz）提取30 min，用甲醇補足減失的質量，搖勻，離心（8 000 r/min，10 min）；取上清液，于70 ℃水浴條件下蒸干，用甲醇復溶至1 mL，搖勻，以0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4 苦參藥材HPLC指紋圖譜的建立

2.4.1 精密度試驗 取“2.3”項下供試品溶液（編號S1）適量，再按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次。以10號峰為參照（該峰分離度較好、峰面積較大，下同），計算得各共有峰相對保留時間的RSD＜0.28%、相對峰面積的RSD＜5%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取“2.3”項下供試品溶液（編號S1）適量，于室溫放置0、4、8、12、16、20、24 h時，再按“2.1”項下色譜條件進樣分析。以10號峰為參照，計算得各共有峰相對保留時間的RSD＜0.24%、相對峰面積的RSD＜5%（n＝7），表明該供試品溶液在室溫放置24 h內穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復性試驗 精密稱取苦參藥材（編號S1）粉末（過三號篩）6份，按“2.3”項下方法平行制備供試品溶液6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣分析。以10號峰為參照，計算得各共有峰相對保留時間的RSD＜0.14%、相對峰面積的RSD＜4%（n＝6），表明該方法重復性較好。

2.4.4 指紋圖譜的建立與相似度分析 將12批苦參藥材按“2.3”項下方法制備成供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。將圖譜輸入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012A版）》，設置編號S1的樣品圖譜為參照，采取中位數法，將時間窗寬度設置為0.2，進行多點校正[7]，建立苦參藥材的HPLC指紋圖譜和對照指紋圖譜R（見圖1）。結果顯示，12批苦參藥材共有17個共有峰，與各單一對照品溶液圖譜（見圖2）比較，指認出峰1為氧化苦參堿、峰2為氧化槐果堿、峰10為苦參堿、峰14為三葉豆紫檀苷、峰16為苦參酮、峰17為降苦參酮。

圖1 12批苦參藥材的HPLC指紋圖譜和對照指紋圖譜R

圖2 各單一對照品溶液的HPLC圖

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》對12批苦參藥材進行相似度評價。結果顯示，12批苦參藥材和對照指紋圖譜R之間的相似度均大于0.96，這表明各批次苦參藥材的相似性較好，整體質量差異不大。以分離度較好、峰面積較大的苦參堿為參照峰，得到12批苦參藥材17個共有峰相對保留時間的RSD為0.01%～0.43%（n＝17），提示各批次苦參藥材共有峰的保留時間較穩(wěn)定；17個共有峰相對峰面積的RSD為5.16%～46.79%（n＝17），提示各批次苦參藥材在部分成分的含量上可能存在差異。

2.5 苦參藥材的化學模式識別分析

2.5.1 聚類分析 以12批苦參藥材的17個共有峰峰面積為變量，將其輸入SPSS 23.0軟件中，采取組間連接法，選擇平方歐氏距離為測度進行聚類分析[8]。結果顯示，當平方歐氏距離為15時，12批苦參藥材可聚為3類：S1～S7（陜西商州區(qū)）聚為一類，S8～S10（河南伊川縣）聚為一類，S11～S12（內蒙古赤峰市）聚為一類。結果見圖3。

圖3 12批苦參藥材的聚類分析結果

2.5.2 主成分分析 采用主成分分析法[9]，將12批苦參藥材的17個共有峰峰面積導入SIMCA 14.1軟件中，繪制主成分得分圖（圖4）。結果顯示，S1～S7（陜西商州區(qū)）聚為一類，S8～S10（河南伊川縣）聚為一類，S11～S12（內蒙古赤峰市）聚為一類，與聚類分析結果一致。

圖4 12批苦參藥材的主成分得分圖

進一步利用SPSS 23.0軟件，以特征值（λi）＞1為標準[10]，共提取3個主成分，方差貢獻率分別為53.934%、23.249%、9.189%，累計方差貢獻率達86.372%，這表明所提取的3個主成分可代表苦參藥材指紋圖譜中17個共有峰的主要信息，可用于反映不同產地苦參藥材的整體質量。由因子載荷矩陣及權重系數可知，第1主成分主要體現了3～6、8～16號峰，第2主成分主要體現了1、2、7號峰，第3主成分主要體現了17號峰。對各因子進行標準化處理，結合上述特征值及因子矩陣，得到反映苦參藥材質量的主成分得分（Y1～Y3）表達式[11]：

Y1＝0.039X1+0.069X2+0.321X3+0.318X4+0.298X5+0.289X6+0.189X7+0.194X8+0.308X9+0.323X10+0.267X11+0.294X12+0.298X13+0.302X14+0.024X15+0.051X16+0.064X17

Y2＝0.408X1+0.374X2－0.025X3－0.040X4－0.192X5－0.104X6+0.302X7+0.179X8+0.049X9+0.036X10+0.222X11－0.083X12－0.110X13－0.079X14－0.456X15－0.479X16+0.074X17

Y3＝0.024X1－0.098X2+0.132X3－0.095X4－0.046X5－0.235X6－0.362X7+0.209X8+0.258X9+0.123X10－0.088X11－0.235X12－0.108X13+0.200X14－0.102X15+0.098X16+0.717X17

根據上述方程式，與相匹配的3個主成分的方差貢獻率做內積并與累計方差貢獻率相除，可獲得苦參藥材質量的綜合得分（Y）：Y＝（Y1×53.934%+Y2×23.249%+Y3×9.189%）/86.372%，根據該公式計算不同產地苦參藥材的Y值，并進行排序；Y值越高說明該批次藥材整體質量越好[12]，結果見表1。由表1可知，來自內蒙古赤峰市的S12、S11批次的苦參藥材質量較好。

表1 主成分綜合得分及排名

2.5.3 正交偏最小二乘法-判別分析 本研究采用SIMCA 14.1軟件，以17個共有峰峰面積為數據陣，對12批苦參藥材進行正交偏最小二乘法-判別分析。結果顯示，模型X矩陣的解釋參數（R2X）、穩(wěn)定性參數（R2Y）及預測能力參數（Q2）分別為0.854、0.883、0.718，均大于0.7，表明建立的模型擬合較好，具有較高的穩(wěn)定性和預測性，可用于分析不同產地苦參藥材間的質量差異[13]。正交偏最小二乘法-判別分析得分圖（圖5）顯示，12批苦參藥材可分為3類，與聚類分析、主成分分析結果一致。

圖5 12批苦參藥材的正交偏最小二乘法-判別分析得分圖

變量重要性投影（variable importance in the projec‐tion，VIP）值能夠表示變量對模型的整體貢獻程度，以VIP值大于1篩選影響苦參藥材質量的差異性成分[14]。結果顯示，影響苦參藥材質量的差異性成分依次為峰10（苦參堿，VIP＝2.024）、峰17（降苦參酮，VIP＝1.695）、峰16（苦參酮，VIP＝1.681）、峰2（氧化槐果堿，VIP＝1.157）、峰 11（VIP＝1.112）、峰9（VIP＝1.074）。

2.6 苦參藥材4種差異性成分的含量測定

根據上述結果，選擇VIP值排名前4位的差異性成分——苦參堿、降苦參酮、苦參酮和氧化槐果堿進行含量測定。

2.6.1 色譜條件 色譜條件同“2.1”項。

2.6.2 對照品溶液的制備 取苦參堿、降苦參酮、苦參酮、氧化槐果堿對照品各適量，分別置于1 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制得上述成分質量濃度分別為3.6、2.7、1.8、2.4 mg/mL的對照品溶液。

2.6.3 供試品溶液的制備 制備方法同“2.3”項。

2.6.4 專屬性試驗 取“2.6.2”“2.6.3”項下對照品溶液及供試品溶液，按照“2.6.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖（圖略）。結果顯示，各成分色譜峰分離良好，提示該方法專屬性良好。

2.6.5 線性關系考察 取“2.6.2”項下對照品溶液，逐級稀釋0、2、4、8、16、32倍，按照“2.6.1”項下色譜條件進行測定。以各差異性成分的質量濃度為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線。另外，以信噪比3∶1、10∶1計算檢測限和定量限。結果見表2。

表2 4種差異性成分的線性關系和靈敏度考察結果

2.6.6 精密度試驗 取“2.6.3”項下供試品溶液（S1），按“2.6.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄各差異性成分的峰面積。結果顯示，苦參堿、降苦參酮、苦參酮、氧化槐果堿峰面積的RSD分別為2.06%、2.98%、0.97%、1.29%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6.7 穩(wěn)定性試驗 取“2.6.3”項下供試品溶液（S1），于室溫放置0、4、8、12、16、20、24 h時，按“2.6.1”項下色譜條件進樣分析，記錄各差異性成分的峰面積。結果顯示，苦參堿、降苦參酮、苦參酮、氧化槐果堿峰面積的RSD分別為2.62%、1.41%、2.77%、0.79%（n＝7），表明各差異性成分在室溫放置24 h內穩(wěn)定性較好。

2.6.8 重復性試驗 精密稱取苦參藥材（S1）粉末6份，按“2.6.3”項下方法平行制備供試品溶液6份，再按“2.6.1”項下色譜條件進樣分析，記錄各差異性成分的峰面積，并根據標準曲線計算含量。結果顯示，苦參堿、降苦參酮、苦參酮、氧化槐果堿含量的RSD分別為3.06%、2.82%、1.45%、2.67%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.6.9 加樣回收率試驗 精密稱取苦參藥材（S1）粉末0.25 g，平行稱取6份，分別加入含有氧化槐果堿1.4 mg、苦參堿0.7 mg、苦參酮3.1 mg、降苦參酮0.6 mg的對照品溶液20 mL，按“2.6.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.6.1”項下色譜條件進樣分析，記錄各差異性成分的峰面積，并計算平均加樣回收率。結果顯示，苦參堿、降苦參酮、苦參酮、氧化槐果堿的平均加樣回收率分別為101.4%、98.5%、99.4%、102.0%，RSD 分別為 1.75%、1.70%、1.85%、2.69%（n＝6），表明該方法準確度良好。

2.6.10 含量測定 取12批不同產地的苦參藥材粉末0.5 g，精密稱定，按照“2.6.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.6.1”項下條件進樣分析，記錄各差異性成分的峰面積，并根據標準曲線計算苦參堿、降苦參酮、苦參酮、氧化槐果堿的含量。平行測定3次，取平均值。結果見表3。

表3 12批苦參藥材中4種差異性成分的含量測定結果（n＝3，mg/g）

3 討論

3.1 提取方法及提取條件的考察

本研究在前期研究中分別考察了回流提取法與超聲提取法對主要色譜峰的影響。結果顯示，2種提取方法對主要色譜峰的影響差別不顯著。為提高效率，本研究選擇了超聲提取法。同時，本研究還分別考察了不同提取時間（15、30、45、60、90 min）、不同提取溶劑（水、25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、甲醇）對供試品溶液色譜峰的數量及響應值的影響。結果顯示，以甲醇超聲提取30 min所得供試品溶液的色譜峰數量較多且響應較強。

3.2 色譜條件優(yōu)化

本研究在210～440 nm進行了全波長掃描，結果發(fā)現在260 nm波長下，待測樣品所得色譜信息較為全面，特征峰響應較強，因此設置檢測波長為260 nm。另外，本研究還考察了6種不同流動相[乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%氨水、甲醇-0.1%氨水、乙腈-20 mmol/L磷酸二氫鉀溶液（pH7.5）、甲醇-20 mmol/L磷酸二氫鉀溶液（pH 7.5）]對色譜峰分離的影響。結果顯示，選用乙腈-20 mmol/L磷酸二氫鉀溶液（pH7.5）作為流動相可較好地分離各色譜峰，且基線平穩(wěn)。

3.3 HPLC指紋圖譜及化學模式識別分析

12批苦參藥材共有17個共有峰，與對照指紋圖譜R的相似度均大于0.96，表明不同產地苦參藥材質量趨于一致。聚類分析、主成分分析、正交偏最小二乘法-判別分析結果均顯示，陜西商州區(qū)樣品S1～S7聚為一類，河南伊川縣樣品S8～S10聚為一類，內蒙古赤峰市樣品S11～S12聚為一類。進一步分析發(fā)現，內蒙古赤峰市產苦參藥材質量較好。

3.4 差異性成分的篩選及含量分析

本研究共篩選出苦參堿、降苦參酮、苦參酮、氧化槐果堿以及峰11、峰9代表的化學成分共6種差異性成分，對苦參堿、降苦參酮、苦參酮、氧化槐果堿4個差異性成分進行含量測定發(fā)現，苦參堿含量為2.65～4.93 mg/g、降苦參酮含量為1.54～3.44 mg/g、苦參酮含量為9.63～12.94 mg/g、氧化槐果堿含量為5.08～6.10 mg/g。其中，苦參堿及降苦參酮均以內蒙古赤峰市樣品最高，苦參酮含量以河南伊川縣樣品最高，氧化槐果堿含量以陜西商州區(qū)樣品最高。由此可知，這些差異性成分可用于區(qū)分不同產地的苦參藥材，可為該藥材質量控制提供參考。

綜上所述，本研究成功建立了苦參藥材的HPLC指紋圖譜，并結合化學模式識別分析篩選出6種差異性成分，可為該藥材的質量控制提供參考。