烏梅炭炮制過(guò)程中顏色與內(nèi)在質(zhì)量的相關(guān)性及其炮制終點(diǎn)研究 Δ

楊琳琳，辛潔萍，李千，張海霞，安錦漪，陳思羽，馮春蘭，王天舒，徐新房，李向日 （北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院/北京市中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102488）

烏梅為薔薇科植物梅Prunus mume（Sieb.）Sieb. et Zucc.的干燥近成熟果實(shí)，具有斂肺、澀腸、生津、安蛔的功效[1]。烏梅炒炭后具有止血祛瘀的作用[2]，可治療便血、便次增多的潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病等[3]，在半夏湯、補(bǔ)氣和中湯、補(bǔ)氣止崩湯、補(bǔ)中歸脾湯等方劑中均有應(yīng)用。烏梅的化學(xué)成分包括枸櫞酸等有機(jī)酸類成分，以及氨基酸、核苷、揮發(fā)性、無(wú)機(jī)元素等其他成分。在炒炭過(guò)程中，其成分含量隨炮制時(shí)間的延長(zhǎng)而發(fā)生變化[4]，而烏梅炭成分含量的變化可在一定程度上影響其臨床治療效果。烏梅炭炮制的關(guān)鍵在于把握其炮制程度：2020年版《中國(guó)藥典》烏梅炭項(xiàng)下僅描述為“皮肉鼓起”[1]，《北京市中藥飲片炮制規(guī)范》描述為“皮肉鼓起，表面焦黑色”[5]?？梢?，烏梅炭的炮制終點(diǎn)多依靠主觀判斷，缺乏客觀參數(shù)，在實(shí)際生產(chǎn)中容易導(dǎo)致烏梅炭的質(zhì)量不穩(wěn)定，難以對(duì)烏梅炭質(zhì)量進(jìn)行控制。

色差分析技術(shù)可以對(duì)中藥粉末顏色進(jìn)行客觀量化，在中藥飲片炮制工藝和質(zhì)量控制研究中已有應(yīng)用[6―9]。本研究首先通過(guò)色差儀對(duì)不同炮制時(shí)間的烏梅炭粉末顏色進(jìn)行色度值測(cè)定，選擇水分、水溶性浸出物、枸櫞酸和鞣質(zhì)含量對(duì)烏梅炭進(jìn)行內(nèi)在質(zhì)量測(cè)定，分析不同炮制時(shí)間下烏梅炭色度值、水分、水溶性浸出物、枸櫞酸和鞣質(zhì)含量的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)，對(duì)顏色和內(nèi)在質(zhì)量進(jìn)行相關(guān)性分析，同時(shí)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)方法來(lái)分析烏梅炭不同炮制時(shí)間的差異，以確定其炮制終點(diǎn)，以期為烏梅炭飲片的炮制提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)烏梅炭飲片質(zhì)量進(jìn)行客觀、全面的控制，保證其臨床用藥安全、有效。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器：P7型雙光束紫外-可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司），CM-5型分光測(cè)色儀（日本Konica Minolta公司），e2695型高效液相色譜儀（包括Waters2695系統(tǒng)、Waters2489紫外檢測(cè)器、Em‐power色譜工作站，美國(guó)Waters公司），F(xiàn)W100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司），BS110S型十萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)Sartorius公司），Scout型電子天平[奧豪斯儀器（常州）有限公司]，DHG-9070A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（常州諾基儀器有限公司），SB25-12DTDN型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用主要藥品：3批烏梅飲片經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院李向日教授鑒定為薔薇科植物梅P. mume（Sieb.）Sieb. et Zucc.的干燥近成熟果實(shí)，飲片信息見表1。本研究所用主要試劑：枸櫞酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100396-202104，純度100%），沒(méi)食子酸對(duì)照品（成都普思生物科技股份有限公司，批號(hào)PS000688，純度＞98%），磷酸二氫銨（北京化工廠有限責(zé)任公司，分析純），干酪素（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，生物試劑），磷鉬鎢酸試液（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，化學(xué)純），乙腈、磷酸（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，色譜級(jí)），純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

表1 3批烏梅飲片信息

2 方法與結(jié)果

2.1 烏梅炭樣品的制備

分別取3批烏梅飲片各200 g，置于預(yù)熱的炒鍋中，將溫度控制在150～180 ℃，分別炮制0、10、20、30、40、50、60 min，取出，放涼，即得不同炒制時(shí)間的烏梅炭樣品。炮制樣品粉碎，過(guò)二號(hào)篩，即得不同炒制時(shí)間的烏梅炭樣品粉末。炒制時(shí)間在0～10 min時(shí)，烏梅開始膨脹，體積逐漸變大，外表皮為灰黑色；炒制10～20 min時(shí)，烏梅膨脹至最大體積，不再變化，同時(shí)顏色開始變暗；炒制20～30 min時(shí)，烏梅顏色逐漸加深，質(zhì)地變輕；炒制30～40 min時(shí)，烏梅顏色變黑，質(zhì)地變輕；炒制40～50 min時(shí)，烏梅顏色、質(zhì)地?zé)o明顯變化；炒制50～60 min時(shí)，烏梅顏色、質(zhì)地?zé)o明顯變化，個(gè)別果核開始發(fā)黑。不同炒制時(shí)間烏梅炭樣品見圖1。

圖1 不同炒制時(shí)間烏梅炭樣品圖

2.2 烏梅炭炒制過(guò)程中樣品粉末色度值測(cè)定

2.2.1 色度值測(cè)定條件 采用分光測(cè)色儀，選擇D65光源，視場(chǎng)選擇10°視角，儀器測(cè)量口徑8 mm，儀器誤差ΔE*≤0.04（E*代表顏色的總色差值），數(shù)據(jù)處理軟件為SpectraMagic NX。對(duì)儀器進(jìn)行黑白板校正后，進(jìn)行樣品測(cè)定，測(cè)得樣品的色度值為L(zhǎng)*、a*、b*。其中，L*代表亮度，L*越大，亮度越大；a*代表紅綠相，正值表示紅色，負(fù)值表示綠色；b*代表黃藍(lán)相，正值表示黃色，負(fù)值表示藍(lán)色。

2.2.2 方法學(xué)考察 （1）精密度：取炒制40 min的烏梅炭粉末（編號(hào)WM0101），裝入測(cè)色皿中，裝入量為測(cè)色皿的2/3體積，按“2.2.1”項(xiàng)下色度值測(cè)定條件連續(xù)測(cè)量6次，記錄L*、a*、b*。結(jié)果顯示，其RSD均小于2.0%（n＝6），表明儀器精密度良好。（2）重復(fù)性：取炒制40 min的烏梅炭粉末（編號(hào)WM0101）6份，分別裝入測(cè)色皿中，裝入量為測(cè)色皿的2/3體積，按“2.2.1”項(xiàng)下色度值測(cè)定條件進(jìn)行顏色測(cè)定，記錄L*、a*、b*值。結(jié)果顯示，其RSD均小于3.0%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。（3）穩(wěn)定性：取炒制40 min的烏梅炭粉末（編號(hào)WM0101），分別于0、2、4、6、8 h按“2.2.1”項(xiàng)下色度值測(cè)定條件進(jìn)行樣品顏色測(cè)定，記錄 L*、a*、b*。結(jié)果顯示，其 RSD 均小于 3.0%（n＝5），表明樣品在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.3 顏色測(cè)定 采用分光測(cè)色儀對(duì)烏梅炭粉末顏色進(jìn)行客觀評(píng)價(jià)，量化顏色指標(biāo)。每批樣品重復(fù)測(cè)量3次，以平均值為各樣品測(cè)定結(jié)果，計(jì)算出各樣品的總色值（E*）＝（a*2+b*2+L*2）1/2，總色差（ΔE*）＝（ΔL*2+Δa*2+Δb*2）1/2，ΔL*、Δa*、Δb*分別表示不同炮制時(shí)間烏梅炭與同批次烏梅數(shù)據(jù)的差值，計(jì)算同一炮制時(shí)間3批樣品批間均值，結(jié)果見圖2。由圖2可知，隨著炮制時(shí)間的延長(zhǎng)，烏梅炭色度值L*與E*先升高后下降，色度值a*與b*逐漸下降，最終均趨于穩(wěn)定。在炒制40～60 min時(shí)，烏梅炭色度值趨于穩(wěn)定，L*、a*、b*與 E*的均值分別為29.60、10.34、15.58 和35.02，ΔL*、Δa*、Δb*與 ΔE*均值分別為－9.89、－4.48、－8.71和13.91，與生品色度值具有明顯差異。

圖2 烏梅炭粉末色度隨炒制時(shí)間的變化趨勢(shì)圖

2.3 烏梅炭炒制過(guò)程中樣品內(nèi)在質(zhì)量測(cè)定

2.3.1 水分測(cè)定 按照2020年版《中國(guó)藥典》（四部）通則0832水分測(cè)定法第二法測(cè)定不同炒制時(shí)間烏梅炭的水分含量[10]，計(jì)算不同炮制時(shí)間3批樣品的批間均值，結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著炮制時(shí)間的延長(zhǎng)，烏梅炭水分持續(xù)下降，在炒制40～60 min時(shí)趨于穩(wěn)定，此時(shí)水分含量范圍為1.8%～4.6%。

圖3 烏梅炭水分、水溶性浸出物、枸櫞酸及鞣質(zhì)含量隨炒制時(shí)間變化趨勢(shì)圖（±s，n＝3）

2.3.2 水溶性浸出物測(cè)定 按照2020年版《中國(guó)藥典》（四部）通則2201水溶性浸出物測(cè)定法項(xiàng)下的熱浸法測(cè)定不同炒制時(shí)間烏梅炭的水溶性浸出物含量[10]，計(jì)算不同炮制時(shí)間3批樣品的批間均值，結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著炮制時(shí)間的延長(zhǎng)，烏梅炭水溶性浸出物含量先升高后下降，炒制40～60 min時(shí)水溶性浸出物含量范圍為20.4%～30.1%。

2.3.3 枸櫞酸含量測(cè)定 按照2020年版《中國(guó)藥典》（一部）烏梅含量測(cè)定項(xiàng)下HPLC法測(cè)定不同炒制時(shí)間烏梅炭的枸櫞酸含量[1]，計(jì)算不同炮制時(shí)間3批樣品的批間均值，結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著炮制時(shí)間的延長(zhǎng)，烏梅炭的枸櫞酸含量先升高后下降，炒制40～60 min時(shí)枸櫞酸含量范圍為6.7%～14.1%。

2.3.4 鞣質(zhì)含量測(cè)定 按照2020年版《中國(guó)藥典》（四部）通則2202鞣質(zhì)含量測(cè)定法測(cè)定不同炒制時(shí)間烏梅炭的鞣質(zhì)含量[10]，計(jì)算不同炮制時(shí)間3批樣品的批間均值，結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著炮制時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品鞣質(zhì)含量先升高后下降，炒制40～60 min時(shí)鞣質(zhì)含量范圍為0.38%～0.63%。

2.4 烏梅炭顏色與內(nèi)在質(zhì)量相關(guān)性分析

2.4.1 色度值與內(nèi)在質(zhì)量的相關(guān)性分析 采用SPSS 19.0軟件對(duì)烏梅炭的L*、a*、b*、E*與水分、水溶性浸出物、枸櫞酸及鞣質(zhì)含量進(jìn)行相關(guān)性分析，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布時(shí)采用Pearson相關(guān)性分析，不符合正態(tài)分布時(shí)采用Spear‐man相關(guān)性分析，結(jié)果見表2。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，烏梅炭樣品粉末的水分、水溶性浸出物、枸櫞酸、鞣質(zhì)含量與L*、a*、b*、E*均呈顯著正相關(guān)（P＜0.001）。

表2 色度值與內(nèi)在質(zhì)量的相關(guān)性分析結(jié)果

2.4.2 內(nèi)在質(zhì)量-色度值回歸分析 以色度值L*、a*、b*為自變量，以烏梅炭的水分、水溶性浸出物、枸櫞酸、鞣質(zhì)為因變量，利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，烏梅炭中水溶性浸出物和鞣質(zhì)含量均有82.5%是受外觀顏色指標(biāo)L*、a*、b*控制的。因b*是樣品色度值中的關(guān)鍵成分，故進(jìn)一步以顏色指標(biāo)b*為自變量，以烏梅炭的水分、水溶性浸出物、枸櫞酸、鞣質(zhì)含量為因變量，利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行回歸分析，建立內(nèi)在質(zhì)量（Y）-b*的回歸方程，結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，烏梅炭的水分、水溶性浸出物含量與b*成顯著的線性關(guān)系（P＜0.05）。因水溶性浸出物在一定程度上是受外觀顏色指標(biāo)值控制的，故可通過(guò)烏梅炭顏色快速預(yù)測(cè)烏梅炭中的水分與水溶性浸出物含量。

表3 內(nèi)在質(zhì)量-色度值的回歸分析結(jié)果

表4 內(nèi)在質(zhì)量-b＊的回歸分析結(jié)果

2.5 烏梅炭顏色與內(nèi)在質(zhì)量的多元統(tǒng)計(jì)分析

本研究以烏梅炭炮制過(guò)程中樣品的L*、a*、b*、E*和水分、水溶性浸出物、枸櫞酸及鞣質(zhì)含量8個(gè)變量為指標(biāo)，采用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。

2.5.1 主成分分析和層次聚類分析 對(duì)烏梅炭不同炮制時(shí)間樣品進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），2個(gè)主成分參數(shù)R2為0.918、Q2為0.807，均大于0.5，表明此模型為優(yōu)質(zhì)模型，PCA得分圖見圖4。由圖4可知，2個(gè)主成分的作用顯著，可用于反映烏梅炭不同炮制時(shí)間樣品90%以上的特征信息。以平方歐氏距離為測(cè)度，進(jìn)行層次聚類分析（hierarchical clustering analy‐sis，HCA），結(jié)果見圖5。由圖5可知，烏梅炭炮制過(guò)程樣品可聚為2類：炮制0～30 min的樣品聚為一類，炮制40～60 min的樣品聚為另一類。

圖4 烏梅炭炮制過(guò)程樣品的PCA得分圖

圖5 烏梅炭炮制過(guò)程樣品的HCA圖

2.5.2 偏最小二乘法判別分析 對(duì)烏梅炭炮制過(guò)程樣品進(jìn)行偏最小二乘法判別分析（partial least squares dis‐criminant analysis，PLS-DA），結(jié)果見圖6。由圖6可知，烏梅炭炮制過(guò)程樣品可聚為2類，聚類結(jié)果與HCA結(jié)果一致。進(jìn)一步對(duì)該模型中8個(gè)指標(biāo)的變量投影重要性（variable importance of projection，VIP）進(jìn)行分析，結(jié)果見圖7。選擇VIP＞1的指標(biāo)作為烏梅炭炮制過(guò)程中的重要質(zhì)量指標(biāo)[11]，本研究選擇VIP＞1且排名前2位的指標(biāo)。結(jié)果顯示，得到水溶性浸出物和水分是烏梅炭炮制過(guò)程中的重要質(zhì)量指標(biāo)；b*是烏梅炭炮制過(guò)程中的重要顏色指標(biāo)。

圖6 烏梅炭炮制不同時(shí)間樣品的PLS-DA圖

圖7 烏梅炭炮制不同時(shí)間樣品中各指標(biāo)的VIP值

3 討論

3.1 烏梅炭炮制過(guò)程中顏色的變化

炒制時(shí)間在0～10 min時(shí)，烏梅炭L*與E*升高，a*、b*下降，推測(cè)是由于在鍋內(nèi)受熱飲片顏色偏亮；炒制10～60 min時(shí)，L*、a*、b*與E*均呈下降趨勢(shì)，且在炒制40～60 min時(shí)趨于穩(wěn)定，表明隨著炮制時(shí)間延長(zhǎng)，烏梅炭樣品顏色逐漸加深，與肉眼所見一致。通過(guò)PLS-DA發(fā)現(xiàn)，b*是烏梅炭炮制過(guò)程中的重要顏色指標(biāo)，表明色度值b*可以客觀準(zhǔn)確地表征傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)的外觀火候。

3.2 烏梅炭炮制過(guò)程中內(nèi)在質(zhì)量的變化

隨著炒制時(shí)間的延長(zhǎng)，烏梅炭中水溶性浸出物、枸櫞酸與鞣質(zhì)含量均呈先升高后下降的趨勢(shì)，“先升高”是由于烏梅藥材受熱膨脹，有利于成分的溶出；“后下降”是由于高溫受熱，使得成分逐漸開始分解，在炒制40～60 min時(shí)各時(shí)間點(diǎn)指標(biāo)均符合2020年版《中國(guó)藥典》（一部）烏梅炭各項(xiàng)指標(biāo)要求。通過(guò)PLS-DA發(fā)現(xiàn)，水分和水溶性浸出物是烏梅炭炮制過(guò)程中的重要質(zhì)量指標(biāo)，表明二者可作為指示烏梅炭炮制終點(diǎn)的重要依據(jù)。

3.3 顏色與內(nèi)在質(zhì)量的相關(guān)性

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，烏梅炭的水分、水溶性浸出物、枸櫞酸、鞣質(zhì)含量與 L*、a*、b*、E*均呈顯著正相關(guān)（P＜0.001）。在烏梅炭炮制過(guò)程中，隨著L*、a*、b*、E*的降低，其水分、水溶性浸出物、枸櫞酸、鞣質(zhì)含量也呈下降趨勢(shì)。內(nèi)在質(zhì)量-色度值回歸分析結(jié)果顯示，烏梅炭中水溶性浸出物和鞣質(zhì)含量均有82.5%是受外觀顏色指標(biāo)L*、a*、b*控制的。這表明烏梅炭的水分、水溶性浸出物含量與b*呈線性關(guān)系，且水溶性浸出物在一定程度上是受外觀顏色指標(biāo)值控制的，并通過(guò)相關(guān)因素回歸方程得知可通過(guò)烏梅炭的顏色快速預(yù)測(cè)水分與水溶性浸出物含量。

3.4 烏梅炭炮制終點(diǎn)的判定

將外觀顏色通過(guò)色差儀量化，與4種內(nèi)在質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行PCA及HCA發(fā)現(xiàn)，炒制時(shí)間為40～60 min時(shí)烏梅炭樣品在PCA得分圖上基本重合，HCA時(shí)也明顯聚為一類，即炒制時(shí)間40～60 min時(shí)炮制樣品聚為一類，烏梅炭色度值在炒制40～60 min范圍內(nèi)趨于穩(wěn)定，變化很小。在炒制40～60 min 時(shí)，L*、a*、b*與E*的均值分別為29.60、10.34、15.58和35.02，ΔL*、Δa*、Δb*與ΔEab*的均值分別為－9.89、－4.48、－8.71和13.91，與生品的色度值具有明顯差異。且不同批次的生品之間色度值有一定波動(dòng)，但炒制40～60 min時(shí)不同批次炮制樣品色度值波動(dòng)減小，樣品外觀性狀趨于一致。炒制40～60 min時(shí)烏梅炭水分含量范圍為1.8%～4.6%，水溶性浸出物含量范圍為20.4%～30.1%，枸櫞酸含量范圍為6.7%～14.1%，鞣質(zhì)含量范圍為0.38%～0.63%，均符合2020年版《中國(guó)藥典》（一部）烏梅炭各項(xiàng)指標(biāo)要求[1]。炮制50 min和60 min樣品的色度值無(wú)明顯差別，炮制60 min樣品的水分、水溶性浸出物、枸櫞酸與鞣質(zhì)含量小于炮制50 min的樣品。根據(jù)炮制適度理論——“凡藥制造，貴在適中，不及則功效難求，太過(guò)則氣味反失”[12]，筆者認(rèn)為烏梅炭的炒制應(yīng)以40～50 min為宜，但后續(xù)還需要結(jié)合藥效實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步合理解釋烏梅炭的炮制終點(diǎn)。

綜上所述，烏梅炭顏色與內(nèi)在質(zhì)量具有一定相關(guān)性，烏梅炭的炒制應(yīng)以40～50 min為宜。