云南安寧醬菜中的細(xì)菌多樣性和致病菌組成分析

楊振光，劉秉珍，曹建新，李莉蓉

（昆明理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 昆明 650500）

醬菜歷史悠久，是一種經(jīng)鹽腌、微生物發(fā)酵和醬漬而成的特色加工品[1]。 醬菜采用開(kāi)放式生產(chǎn)，利用附著在原料表面上的乳酸菌發(fā)酵形成了其獨(dú)特的風(fēng)味[2-3]。由于醬菜特殊的制作方式，使其最終形成了復(fù)雜的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)[4]。 研究表明，乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸、 醇和酯等物質(zhì)是醬菜的主要風(fēng)味來(lái)源[5-7]。葛菁萍等[8]在黃豆醬中檢測(cè)到嗜鹽片球菌（Pediococcus halophilus）、 醬油片球菌（Pediococcus sojae） 和醬油四聯(lián)球菌（Tetragenococcus sojae）等乳酸菌。 辛星等[9]從黑龍江醬菜中分離得到乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）等7 株乳酸菌。 除乳酸菌外，在醬菜的制作、運(yùn)輸和銷售環(huán)節(jié)中可能帶入食源性致病菌在內(nèi)的各種污染微生物[10]，輕則造成醬菜中營(yíng)養(yǎng)成分的流失和風(fēng)味發(fā)生變化等不良影響，重則導(dǎo)致食源性疾病的發(fā)生，不僅對(duì)食品本身的安全性、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等產(chǎn)生影響，而且對(duì)人體健康造成不同程度的危害[11-12]。

近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù) （High-throughput sequencing）飛速發(fā)展，代替了傳統(tǒng)微生物分析所采用的分離培養(yǎng)方法，檢測(cè)過(guò)程可一次性對(duì)樣品中的幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA 分子進(jìn)行序列測(cè)定，較傳統(tǒng)的分離、純化、鑒定方法，可快速確定其中微生物的種類和豐度，不僅可以檢測(cè)到普通的可培養(yǎng)物種，而且能全面反映樣品的菌群結(jié)構(gòu)[13-14]。目前高通量測(cè)序已被廣泛應(yīng)用于分析各種環(huán)境中的微生物群落結(jié)構(gòu)。

本研究以云南省安寧市的9 種醬菜樣品為研究對(duì)象，采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)其細(xì)菌多樣性進(jìn)行解析，并通過(guò)傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法分析醬菜中的食源性致病菌組成，探究樣品可能存在的食源性致病菌污染情況，為后續(xù)云南特色醬菜的微生物多樣性研究和制作方法的改良提供一定的數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒 （DP1301），北京百泰克生物技術(shù)有限公司。

食源性致病菌選擇培養(yǎng)基： 沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基、李斯特菌顯色培養(yǎng)基、O157 顯色培養(yǎng)基、蠟樣芽孢桿菌顯色培養(yǎng)基、坂崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基、金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基、孤菌顯色培養(yǎng)基、志賀氏菌顯色培養(yǎng)基、彎曲菌顯色培養(yǎng)基，上海欣中生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XR+PCR 儀，美國(guó)BIO-RAD 公司；凝膠成像分析系統(tǒng)，美國(guó)BIO-RAD 公司；水平電泳儀，北京市六一儀器廠；LDZX－40AI 型立式電熱壓力滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；TGL-16aR 高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；YJ－875 型醫(yī)用超凈工作臺(tái)，吳江市生化凈化設(shè)備廠。

1.3 樣品處理

從云南省昆明市安寧市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的3 個(gè)攤位采集到9 種醬菜樣品。 從攤位1 采集到的樣品分別為豆瓣醬1、黃豆醬和辣椒醬，從攤位2 采集到的樣品為豆瓣醬2、麻辣醬和香辣醬，從攤位3 采集到的樣品為豆瓣醬C、藠頭醬和麥芽醬。 將這9種醬菜分別進(jìn)行編號(hào)（表1），置于-80 ℃冰箱儲(chǔ)存。

表1 各種醬菜對(duì)應(yīng)編號(hào)Table 1 Various pickles corresponding number

1.4 細(xì)菌基因組DNA 提取和PCR 擴(kuò)增

參照DNA 提取試劑盒的方法提取樣品細(xì)菌基因組DNA。 之后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 的純度和濃度。 根據(jù)DNA 濃度，用無(wú)菌水稀釋DNA 至1 ng/μL。

以提取的細(xì)菌基因組DNA 為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）模板，利用特異性引物515F-806R 進(jìn)行16S rDNA 擴(kuò)增。 PCR 產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，寄往北京諾禾致源科技股份有限公司，完成高通量測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為Illumina NovaSeq6000。 PCR 反應(yīng)體系如表2 所示。

表2 PCR 反應(yīng)體系Table 2 PCR reaction system

反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性1 min；30 個(gè)循環(huán)包括（98 ℃，10 s；50 ℃，30 s；72 ℃，30 s）；72 ℃，5 min。

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析

通過(guò)Illumina NovaSeq 測(cè)序平臺(tái)得到原始數(shù)據(jù)（Raw Data），對(duì)其進(jìn)行拼接、過(guò)濾，得到有效數(shù)據(jù)（Clean Data）。 有效數(shù)據(jù)以97%的一致性進(jìn)行OTUs（Operational Taxonomic Units）聚類和物種分類分析。 根據(jù)OTUs 聚類結(jié)果，一方面對(duì)每個(gè)OTU 的代表序列做物種注釋，得到對(duì)應(yīng)的物種信息和基于物種的豐度分布情況。 同時(shí)，對(duì)OTUs 進(jìn)行豐度、Alpha 多樣性計(jì)算，Venn 圖和花瓣圖等分析，以得到樣本內(nèi)物種豐富度和均勻度信息，不同樣本或分組間的共有和特有OTUs 信息等。

1.6 食源性致病菌的分離培養(yǎng)與鑒定

將采集到的醬菜樣品進(jìn)行10 倍梯度稀釋后，吸取200 μL 樣品稀釋液涂布不同的選擇培養(yǎng)基，置于33 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h 后觀察菌落形態(tài)。

挑取平板中的代表性菌落由上海捷瑞生物工程有限公司完成16S rDNA 序列擴(kuò)增、測(cè)序，利用NCBI（美國(guó)國(guó)家生物技信息中心）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 醬菜細(xì)菌多樣性分析

2.1.1 測(cè)序數(shù)據(jù)及稀釋曲線分析 9 種醬菜樣品的稀釋曲線如圖1 所示。隨著測(cè)序數(shù)據(jù)量的增加，各組樣品稀釋曲線逐漸上升并趨于平坦，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量增加，OUT 數(shù)量不再增加，測(cè)序數(shù)量足夠覆蓋樣品中絕大多數(shù)微生物信息。

圖1 細(xì)菌16S rDNA 克隆文庫(kù)稀釋曲線Fig.1 Rarefaction analysis of bacteria 16S rDNA clone library

2.1.2 細(xì)菌群落OTU 分布 通過(guò)R 軟件（Version 3.0.3，R package=VennDiagram） 繪制成花瓣圖。醬菜樣本中的細(xì)菌群落OTU 分布結(jié)果見(jiàn)圖2。 9組醬菜樣本共注釋出OTUs 1 018 個(gè)OUT，共有35 個(gè)相同的OTU 樣本，其中CJ.1 組產(chǎn)生54 個(gè)OUT，HJ.1 組產(chǎn)生34 個(gè)OTU，DJ.1 組產(chǎn)生63 個(gè)OUT。 XL.2 組產(chǎn)生44 個(gè)OTU，DJ.2 組產(chǎn)生139 個(gè)OTU，ML.2 組產(chǎn)生94 個(gè)OUT。PC.C 組產(chǎn)生117 個(gè)OTU，DJ.C 組產(chǎn)生121 個(gè)OTU，MJ.C 組產(chǎn)生107個(gè)OTU。 DJ.2 組所具有的特殊OUT 數(shù)量最多。

圖2 樣本OTU 分布花瓣圖Fig.2 Flower diagram of sample OTUs distribution

2.1.3 多樣性指數(shù)和菌落豐富度分析 α-多樣性分析能夠評(píng)價(jià)微生物群落的豐度和多樣性。 通過(guò)6 個(gè)指數(shù)，包括Observed-species，Chao1，Shannon，Simpson，ACE，Good-coverage 等，對(duì)樣本的物種多樣性進(jìn)行分析[16]。 醬菜樣本的α-多樣性分析結(jié)果見(jiàn)表3。Good-coverage 表示測(cè)序的深度，樣品中coverage 覆蓋率均達(dá)到99.5%～99.8%，這表明多樣性測(cè)序結(jié)果既真實(shí)又準(zhǔn)確。 根據(jù)多樣性檢測(cè)結(jié)果，Chao1 指數(shù)和Ace 指數(shù)代表菌群豐富度。 Chao1 指數(shù)越大，代表樣品中菌群豐富度越高[15]。其中，MJ.C 的Chao1 指數(shù)最高，達(dá)1 259.244，其次是DJ.C 和ML.2，分別為1 158.106 和1 080.657。HJ.1 的Chao1 指數(shù)最低，僅742.136。 這表明MJ.C樣品中的細(xì)菌菌群較多、豐富度較高，而相比較之下HJ.1 樣品中的細(xì)菌菌落較少、豐富度較低。Ace指數(shù)代表估計(jì)群落中OTU 數(shù)目，DJ.1、ML.2 和DJ.C 的Ace 指數(shù)較高，分別為1085.260，1123.712和1 165.155，MJ.C 的Ace 指數(shù)最高，其指數(shù)為1 179.523，而DJ.2 的Ace 指數(shù)最低，為577.161。Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)表征群落內(nèi)物種分布的多樣性和均勻度[15]。Shannon 指數(shù)代表樣品中的分?jǐn)?shù)總數(shù)及其占比，Shannon 指數(shù)越大，群落多樣性越高，物種分布越均勻。MJ.C 的Shannon 指數(shù)最高，為6.720，其次為DJ.C（6.212）、DJ.1（5.833）和ML.2（5.236）。同時(shí)，Simpson 指數(shù)最高的4 個(gè)醬菜樣本分別是：MJ.C（0.952）、DJ.1（0.937）、ML.2（0.903）和CJ.1（0.903）。從細(xì)菌多樣性指標(biāo)可以得出結(jié)論：9 種醬菜樣品中，MJ.C 樣品具有最高的菌落豐富度且分布均勻。

表3 細(xì)菌生物多樣性指標(biāo)Table 3 Indicators of bacterial biodiversity

2.1.4 不同醬菜樣本的微生物群落結(jié)構(gòu)的差異比較 通過(guò)菌群豐度柱狀圖表示分組在門(mén)水平（圖3）和屬水平（圖4）的菌落豐度。

由圖3 可知，在門(mén)分類水平上，以相對(duì)豐度≥0.01%為閾值，將＜0.01%的菌門(mén)歸為others，按照相對(duì)豐度從高到低的排序依次為厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、 變形菌門(mén) （Proteobacteria）、 藍(lán)藻菌門(mén)（Cyanobacteria）、類桿菌門(mén)（Bacteroidota）、放線菌門(mén) （Actinobacteria）、 放線桿菌門(mén)（Actinobacteriota）、疣菌門(mén) （verrucomicrobiota）、 脫硫菌（Desulfobacterota）和彎曲桿菌（Campilobacterota）。 其中優(yōu)勢(shì)菌門(mén) （平均豐富大于1.00%） 分別為厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)、藍(lán)藻菌門(mén)。 雖然關(guān)于云南醬菜細(xì)菌多樣性的研究相對(duì)較少，既往研究表明中國(guó)其它傳統(tǒng)發(fā)酵食品，如扎辣椒[16]和泡菜[17]中的細(xì)菌菌門(mén)組成與本研究結(jié)果相似。 對(duì)比不同醬菜樣本的細(xì)菌門(mén)水平相對(duì)豐度，可以發(fā)現(xiàn)不同類型的醬菜產(chǎn)品，其菌門(mén)種類相似而相對(duì)豐度具有較大的差異。其中彎曲桿菌門(mén)在DJ.C 中豐度較高，脫鐵桿菌門(mén)在MJ.C 中豐度較高。而在ML.2 和XL.2 中細(xì)菌菌種較少，微生物種類多樣性相對(duì)較低，這說(shuō)明不同的醬菜樣本中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在差異，且同一菌門(mén)在不同樣本中的相對(duì)豐度差異較大。

圖3 醬菜樣品中細(xì)菌門(mén)水平分布圖Fig.3 Horizontal distribution of bacterial in phylum level in pickles

如圖4 所示，在屬水平上，豐度≥0.1%的細(xì)菌屬分別是乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、色鹽桿菌 屬（Chromohalobacter）、泛菌屬（Pantoea）、克雷伯菌屬（Klebsiella）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）、四鏈球菌屬 （Tetragenococcus） 和伊格氏菌（Ignatzschineria）。 在不同的醬菜樣本中，主要菌屬的組成相似，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌豐度差異較大。 其中，乳酸桿菌屬和芽孢桿菌屬在9 種醬菜樣本中均有檢出，高吉祥等[2]研究結(jié)果表明，醬菜發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌能夠產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸。同時(shí)，研究表明乳酸菌能夠酶解蛋白質(zhì)產(chǎn)生多種氨基酸，這一發(fā)酵過(guò)程中生成的有機(jī)酸和氨基酸是醬菜的主要風(fēng)味來(lái)源之一[18]。 此外，乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中能促進(jìn)風(fēng)味組分（醛類、醇類、酯類等）的形成。 乳酸菌在醬菜發(fā)酵中提供了良好的風(fēng)味和豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是醬菜發(fā)酵中不可缺少的菌種[19]。 除乳酸桿菌屬外，芽孢桿菌屬微生物在9 種樣本中也均有檢出，其中在DJ.C 中芽孢桿菌的豐度占40.57%，是DJ.C 中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌種，這一點(diǎn)與成曉苑[20]的研究結(jié)果相吻合。 芽孢桿菌屬可以產(chǎn)生各種水解酶，如蛋白酶、纖維素酶和淀粉酶，從而促進(jìn)碳水化合物的液化和糖化。此外，在DJ.1、XL.2、DJ.2 和ML.2 中，均有葡萄球菌屬微生物檢出。 田媛等[20]和Iacumin等[21]的研究結(jié)果表明，葡萄球菌在發(fā)酵過(guò)程中能夠降解脂肪和蛋白質(zhì)，還可還原硝酸鹽，促進(jìn)風(fēng)味形成，在發(fā)酵過(guò)程中屬于有益菌。 除此之外，在攤位一采集到的CJ.1、HJ.1 和DJ.1 中都檢出檸檬酸桿菌（Citrobacteri）和和克雷伯菌（Klebsiella），在攤位二采集到的XL.2、DJ.2 和ML.2 中均檢出檸檬酸桿菌（Citrobacteri），在DJ.2 和ML.2 中檢出克雷伯菌（Klebsiella）。檸檬酸桿菌（Citrobacteri）和克雷伯菌（Klebsiella）都屬于致病菌群[22-23]，這一檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明攤位一和攤位二醬菜在制作、 運(yùn)輸和銷售過(guò)程中可能存在微生物污染，也進(jìn)一步說(shuō)明這2個(gè)攤位其生產(chǎn)制造的環(huán)境衛(wèi)生條件較差。

圖4 醬菜樣品中細(xì)菌屬水平分布圖Fig.4 Horizontal distribution of bacteria in genus level in pickles

2.2 醬菜致病菌組成分析

根據(jù)1.3 節(jié)樣品分類分離篩選醬菜樣品中微生物，從9 種顯色培養(yǎng)基中獲得具有顯著特征的菌株。 從顯色培養(yǎng)基中分離篩選得到的活性菌株的菌落形態(tài)如表4 所示。 其中坂崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基沒(méi)有菌落。

表4 選擇培養(yǎng)基菌株生長(zhǎng)情況Table 4 The growth of strains in selective medium

根據(jù)1.6 節(jié)的序列測(cè)定方法，挑取不同的目標(biāo)菌株進(jìn)行16S rDNA 測(cè)序比對(duì)，共檢出食源性致病菌5 種。 樣品中食源性致病菌檢測(cè)結(jié)果如圖5 所示。 CJ.1 中檢出蠟樣芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌和李斯特菌；HJ.1 中檢出大腸桿菌O157 和李斯特菌；DJ.1 中檢出副溶血性弧菌、 大腸桿菌O157 和李斯特菌；DJ.2 和PC.C 中檢出大腸桿菌O157；DJ.C 中檢出副溶血性弧菌；MJ.C 中檢出蠟樣芽胞桿菌、 沙門(mén)氏菌和李斯特菌。 上述結(jié)果表明，蠟樣芽胞桿菌和李斯特菌在樣品中檢出率較高。分析其原因在于芽孢桿菌屬微生物獨(dú)特的，對(duì)外界有害因子抵抗力極強(qiáng)的芽孢桿菌，具有耐高溫、快速?gòu)?fù)活等特點(diǎn)，在有氧和無(wú)氧的條件下都能存活[11]，并且研究表明蠟樣芽孢桿菌具有較強(qiáng)的耐鹽性[24]。 單增李斯特菌是李斯特菌屬中唯一能夠引起人類疾病的菌種，對(duì)鹽和堿的抵抗力都較強(qiáng)，并且在4 ℃的環(huán)境中也能存活[25]。

圖5 樣品中食源性致病菌檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Detection results of foodborne pathogens in samples

3 結(jié)論

對(duì)9 種云南安寧醬菜的致病菌組成和細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究。 通過(guò)對(duì)9 組醬菜樣品進(jìn)行稀釋曲線、OTU 分布、相似性、多樣性指數(shù)和菌落豐富度等方面的分析，得出結(jié)論：從OTU 分布以及相似性分析來(lái)看，9 醬菜樣品中，DJ.2 組所具有的特有OUT 數(shù)量最多，說(shuō)明DJ.2 樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣，細(xì)菌群落組成特異性最強(qiáng)，同時(shí)這9 組醬菜樣品具有相似的細(xì)菌群落豐度； 從多樣性指數(shù)和菌落豐富度分析來(lái)看，MJ.C 樣品具有最高的菌落豐富度；從樣本細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異來(lái)看，不同的醬菜樣本中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異。本次測(cè)序，在門(mén)水平上，厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)、藍(lán)藻菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。在屬水平上，各種醬菜樣本菌落組成差異較大，乳酸桿菌屬、葡萄球菌屬和芽孢桿菌屬都是醬菜中常見(jiàn)的微生物屬。

為探究云南安寧醬菜中的致病菌組成，采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的方法和16S rDNA 測(cè)序技術(shù)，從這9 種安寧醬菜中分離得到蠟樣芽孢桿菌、 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等常見(jiàn)食源性致病菌。值得一提的是，蠟樣芽孢桿菌在大部分醬菜樣本中都有檢出，屬于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌種。芽孢桿菌屬?gòu)V泛存在于自然界中，而其特性是在不利條件下能夠產(chǎn)生具有特殊抵抗力的芽孢，難以除去。

醬菜的制作、發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的發(fā)酵體系，發(fā)酵過(guò)程中涉及微生物種類繁多，不同的外部因素如氣候、地域、原輔料、發(fā)酵方法等均影響發(fā)酵醬菜微生物群落結(jié)構(gòu)，因此研究醬菜中的細(xì)菌多樣性，對(duì)開(kāi)發(fā)利用醬菜中的微生物資源奠定了基礎(chǔ)。如今食品安全越來(lái)越受到人們的重視，食源性致病菌成為食品質(zhì)量與安全的首要影響因素，對(duì)醬菜中食源性致病菌進(jìn)行分析，對(duì)確保醬菜食用安全具有重要意義。