基于氨基酸代謝的復(fù)合茶降脂作用研究

周才碧，文治瑞，趙 燕，梅 鑫，楊再波

（黔南民族師范學(xué)院 貴州都勻 558000）

由于能量攝入和消耗之間的不平衡，體力勞動(dòng)和運(yùn)動(dòng)量相對(duì)減少，使得肥胖人群持續(xù)增長，肥胖逐漸成為世界性的公共健康問題[1]。肥胖帶來的不僅是外表的不美觀，對(duì)自身健康也造成負(fù)面影響，更重要的是隨之而來的高脂血癥、 心血管疾病、代謝綜合癥等各類代謝疾病[2]。

高脂血癥 （Hyperlipidemia，HLP） 是 因TCHD、LDL-C、T-GHD 過高，或HDL-C 過低，而引發(fā)的一類代謝型疾病。 HLP 也稱為脂質(zhì)代謝異?；蛭蓙y，是多種代謝通路異常的結(jié)果[3]，主要由脂代謝和腸道菌群紊亂，以及氨基酸代謝、 氧化應(yīng)激、糖代謝所致。 脂質(zhì)代謝涉及糖異生、糖酵解、TCA 循環(huán)、戊糖磷酸途徑、脂質(zhì)合成以及氨基酸代謝等路徑，可以互相轉(zhuǎn)化和影響；若某個(gè)代謝路徑發(fā)生代謝產(chǎn)物累積或過度消耗都會(huì)導(dǎo)致其它路徑的紊亂，是較為常見的內(nèi)分泌和代謝性疾病[3]。HLP 的發(fā)生會(huì)加劇肥胖，進(jìn)而引起腸道菌群紊亂[4]、脂肪組織和肝臟的慢性炎癥[5]、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病[6]、中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變[7]、非酒精性脂肪肝（NASH）[8-11]、骨關(guān)節(jié)炎、心血管疾病等，以及提高某些類型癌癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。 這些病的變異性及其相關(guān)的共病使其成為一種復(fù)雜的、 不易分類和治療的多因素疾病[7]。

茶葉具有降脂、減肥的作用，可調(diào)節(jié)相關(guān)代謝酶活性，阻止膽固醇吸收，抑制膽固醇合成，調(diào)節(jié)代謝相關(guān)基因的表達(dá)，對(duì)肝臟有保護(hù)作用[9]。 通過長期飲茶和適量運(yùn)動(dòng)去脂，可讓各代謝途徑恢復(fù)正常。 飲茶不僅有降三高，提高免疫力，延年益壽等功能，而且安全、無副作用。

茶葉中茶多酚、兒茶素、茶黃素等化學(xué)成分可降低膽固醇、低密度脂蛋白和血漿甘油三酯水平，并促使低密度脂蛋白受體表達(dá)，調(diào)節(jié)或抑制高脂血癥，減少脂肪含量[11]。 茶多酚對(duì)高脂飲食小鼠結(jié)腸菌群組成和多樣性的影響，抑制了宿主體質(zhì)量和血脂的增加。 兒茶素可顯著降低大鼠肝臟中脂肪酸合酶（FAS）和蘋果酸酶（ME）的活性，并可降低葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PDH）和?；o酶A氧化酶（ACO）活性[12-13]。 綠茶提取物中，茶多酚等成分可減少自由基引起的機(jī)體損傷，提高SOD 等抗氧化物酶活性及機(jī)體自身的抗氧化水平，從而改善血脂水平[14-15]。 普洱茶可以提高SOD 和GSPPx 活性，減少M(fèi)DA 含量，促進(jìn)其避免肝細(xì)胞受損，提高肝細(xì)胞的抗氧化能力，抑制或減少脂肪肝的合成[16-17]。 鳳凰單叢茶提取物可提高CPT-1、p-ACC 和p-AMPK 表達(dá)，促進(jìn)脂肪酸的氧化；減少FAS 表達(dá)，抑制體內(nèi)脂肪合成[18]。

代謝組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，其在病理診斷及藥物機(jī)理、 作用等與人類健康密切相關(guān)的領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[3，19]。 代謝組學(xué)在許多方面都存在優(yōu)勢(shì)，如代謝組學(xué)研究是介于基因、細(xì)胞、蛋白質(zhì)以及組織之間，是位于生物及其信息傳遞的中端，而代謝產(chǎn)物位于下端，因此對(duì)生物體的氨基酸類代謝產(chǎn)物能更直接地分析其病理和生理狀態(tài)。

本文利用代謝組學(xué)技術(shù)研究復(fù)合茶中氨基酸及其氨基酸衍生物對(duì)高脂血癥小鼠肝臟代謝的影響，旨在探究復(fù)合茶中氨基酸及其氨基酸衍生物的降脂機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

受試樣品：由都勻古樹綠茶、都勻原樹甜茶、都勻闊葉苦丁、荷葉、野薄荷、金銀花拼配而成的復(fù)合茶。

試劑：乙腈、甲醇、乙醇皆是色譜純級(jí)，德國Merck。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF 級(jí)雄性KM 小鼠，體質(zhì)量（30±2）g，約5 周齡，上海斯萊克。

1.2 儀器與設(shè)備

CTO-20AC柱溫箱、IT-TOF質(zhì)譜儀、CBM-20A 系統(tǒng)控制器、DGU-20A5R 在線脫氣機(jī)、SIL-30AC 自動(dòng)進(jìn)樣器、LC-30AD 液相輸液泵，日本島津；超純水器，美國Thermo。

1.3 茶樣制備

取適量的由都勻古樹綠茶、都勻闊葉苦丁、都勻原樹甜茶、金銀花、荷葉、野薄荷配制成復(fù)合茶樣品粉碎，配制成質(zhì)量濃度0.1 g/mL 的茶水于100 ℃沸水中浸提30 min，真空抽濾后，茶渣按同樣的方法再浸提1 次，合并2 次提取液。最后將濾液蒸發(fā)至適當(dāng)濃度，在-80 ℃預(yù)冷12 h 后，真空干燥30 h，收集干粉，置于-20 ℃超低溫冰箱中，備用。

1.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

將小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分成4 組：飼喂基礎(chǔ)飼料的正常對(duì)照組（CK），以蒸餾水灌胃、飼養(yǎng)高脂飼料的小鼠模型對(duì)照組（NK），以復(fù)合茶茶湯灌胃、飼養(yǎng)高脂飼料的復(fù)合茶葉組（DH），以血脂康灌胃、 飼養(yǎng)高脂飼料的陽性對(duì)照組（YK）。各組均分開飼養(yǎng)30 d，保證實(shí)驗(yàn)室里的相對(duì)濕度為50%～60%，溫度為20～26 ℃。 2 d 更換1 次墊料，保持環(huán)境干凈；1 周更換小鼠飲用的蒸餾水。該實(shí)驗(yàn)通過了華南農(nóng)業(yè)大學(xué)（中國廣州）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，程序嚴(yán)格按照華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物護(hù)理和使用實(shí)驗(yàn)室指南進(jìn)行操作。

1.5 樣品制備

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，使用乙醚將小鼠麻醉并解剖，將肝組織取出，用預(yù)冷的生理鹽水漂洗干凈血液。精確稱取50 mg 小鼠肝組織，加入1 000 μL 預(yù)冷提取劑[70%甲醇水溶液（含2-氯苯丙氨酸1 μg/mL）作為內(nèi)標(biāo)]和預(yù)冷的鋼珠，勻漿3 min 并將鋼珠取出，再渦旋1 min，冰上靜置15 min；最后4 ℃離心（12 000 r/min）10 min，取上清倒入襯管，待LCMS/MS 分析。

1.6 色譜條件

質(zhì)譜條件：質(zhì)譜電壓5 500 V（positive），-4 500 V（negative）；電噴霧離子源（Electrospray ionization，ESI） 溫度為500 ℃； 氣簾氣 （Curtain gas，CUR）25 psi，離子源氣體II（GS II）60 psi、氣體I（GSI）55 psi；碰撞誘導(dǎo)電離（CAD）參數(shù)設(shè)置為高。在三重四極桿（Qtrap）中，離子對(duì)要求根據(jù)優(yōu)化后的去簇電壓（Declustering potential，DP）和碰撞能（Collisionenergy，CE）進(jìn)行掃描和檢測(cè)。

流動(dòng)相：A 相（超純水）是0.04%的乙酸，B 相（乙腈）是0.04%的乙酸；洗脫倒梯度：14.0 min 為95∶5（V/V），12.1 min 為95∶5（V/V），12.0 min 為5∶95（V/V），11.0 min 為5 ∶95（V/V），0 min 水/乙腈=95 ∶5（V/V）；進(jìn)樣量2 μL；流速0.4 mL/min，柱溫40 ℃。

色譜條件： 色譜柱為Waters ACQUITY UPLCHSS T3C 181.8 μm，2.1 mm×100 mm。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用三重四極桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（Multiple reaction monitoring，MRM）及Analyst 1.6.3 軟件處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)及定量分析，對(duì)代謝物進(jìn)行峰校正和峰提取。 所有數(shù)據(jù)集經(jīng)過處理后用OPLS-DA 模型進(jìn)行分析，用預(yù)測(cè)參數(shù)Q2 和R2X、R2Y 評(píng)價(jià)模型的可靠程度，反映模型的有效性。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估

由混樣質(zhì)控QC 樣本的總離子流圖 （圖1a、1b）所示，在圖中幀與幀之間重疊性好，即說明機(jī)器運(yùn)行比較穩(wěn)定可靠，從而測(cè)得的數(shù)據(jù)結(jié)果真實(shí)可信。 通過三重四極桿篩選出特征離子，可得到MRM 代謝物檢測(cè)多峰圖，利用軟件Analyst 1.6.3處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)得到圖1c 和1d。

圖1 混樣質(zhì)控QC 樣本的總離子流圖及MRM 代謝物檢測(cè)多峰圖Fig.1 Total ion flow diagram of sample mass spectrometry and multi peak diagram of MRM metabolite detection

由圖1 可知樣本中能夠檢測(cè)到的物質(zhì)，不同顏色的色譜峰代表檢測(cè)到的不同代謝物； 每個(gè)色譜峰的峰面積（Area）代表對(duì)應(yīng)物質(zhì)的相對(duì)含量。

2.2 定性和定量代謝物

通過自建靶向標(biāo)品數(shù)據(jù)庫MWDB 和代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫，對(duì)樣本及樣本間的氨基酸類代謝物進(jìn)行質(zhì)譜定性和定量分析，根據(jù)檢測(cè)物質(zhì)的子母離子對(duì)信息、 保留時(shí)間RT 及二級(jí)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行定性分析和廣泛靶向氨基酸代謝組技術(shù)的代謝分析，檢測(cè)到97 個(gè)代謝物包括馬尿酸、延胡索酸、琥珀酸、丙甘氨酸等。

2.3 主成分分析

主成分分析（PCA）顯示出各組之間分離的趨勢(shì)，表示樣品組間氨基酸代謝物是否存在差異。PCA 分析可以看出，本研究得到每組處理內(nèi)樣品間的差異比較小，也具有相似的代謝特性，測(cè)試結(jié)果可重復(fù)且穩(wěn)定。 除了CK-vs-DH 處理之間的分離趨勢(shì)較小以外，其余處理組之間分離趨勢(shì)明顯，即CK-vs-DH 處理之間的氨基酸代謝物差異較小，其PC1 貢獻(xiàn)度為36.2%（圖2a、2g），說明復(fù)合茶可恢復(fù)部分氨基酸代謝物至正常對(duì)照組的氨基酸代謝情況。 CK_vs_NK 組中可以得出，兩組之間存在差異（圖2b），且PC1 貢獻(xiàn)度為40.49%，表明建立的高脂小鼠模型成功。 其余處理組之間分離趨勢(shì)明顯，則說明這幾組氨基酸代謝物差異較為顯著，PC1 貢獻(xiàn)度分別為40.96%，38.58%，36.93%，31.26%（圖2c～2f）。

圖2 主成分分析得分圖和三維圖Fig.2 Principal component analysis two dimensional score map and three dimensional graph

2.4 正交偏最小二乘判別分析

主成分分析法能有效提取主要信息，然而它對(duì)于相關(guān)性小的變量較不敏感，而正交偏最小二乘判別分析 （Partial least squares-Discriminant analysis，PLS-DA）便能夠解決此問題。 PLS-DA 是一種監(jiān)督模式識(shí)別的統(tǒng)計(jì)分析手段，分別取自變量（X）與因變量（Y）中的成分后，再進(jìn)行成分間相關(guān)性計(jì)算。與PCA 相比較，PLS-DA 能夠促使組間區(qū)分度達(dá)到最大化，這樣更有利于找到差異代謝物。 而正交偏最小二乘判別分析（Orthogonal partial least squares -Discriminant analysis，OPLS -DA）結(jié)合了正交信號(hào)矯正（Orthogonal signal correction，OSC）和PLS-DA 方法，通過去除不相關(guān)的差異來篩選差異變量。

根據(jù)OPLS-DA 模型來分析代謝數(shù)據(jù)，繪制出各分組的得分圖，其中Q2、R2Y 和R2X 展示出各個(gè)分組間的差異； 相關(guān)指標(biāo)越接近1，模型越穩(wěn)定、可靠，而Q2>0.9 時(shí)為出色，Q2>0.5 時(shí)為有效。

利用OPLS-DA 模型分析可見，CK-vs-NK（圖3b），CK-vs-YK（圖3c），NK-vs-DH（圖3d），NKvs-YK（圖3e），YK-vs-DH（圖3f）的Q2 分別為0.792，0.774，0.689，0.52，0.758，均>0.5，即所建立的模型為有效模型，值得注意的是CK-vs-DH 中的Q2<0.5 且P<0.05，即該模型是無效模型。 在NK-vs-DH（圖3d），YK-vs-DH（圖3f）兩個(gè)對(duì)比組中R2Y 的P 分別為0.1，0.04；Q2 的P 分別為0.015，0.04，均<0.05，說明這兩個(gè)對(duì)照模型組是建立的最佳的，在此次Permutation 檢測(cè)中，各對(duì)比組各有2 和8 個(gè)隨機(jī)分組模型其對(duì)Y 矩陣的解釋率優(yōu)于本OPLS-DA 模型；各有3 和8 個(gè)隨機(jī)分組模型的預(yù)測(cè)能力優(yōu)于本OPLS-DA 模型。

圖3 OPLS-DA 模型的評(píng)分（左）、OPLS-DA 驗(yàn)證圖（中）、OPLS-DA S-plot（右）Fig.3 OPLS-DA model score （left），OPLS-DA verification chart （middle），OPLS-DA S-plot （right）

在OPLS-DA 的S-plot 圖中NK-vs-DH （圖3d）有43 種氨基酸差異代謝物VIP>1。 有趣的是，YK-vs-DH （圖3f） 中的33 種氨基酸差異代謝物VIP>1（甘氨酸VIP>2）均包含在NK-vs-DH 組的差異代謝物中，其余10 種差異代謝物不在其中，分別是S-甲基谷胱甘肽、γ-L-谷氨酸-L-半胱氨酸、N-乙酰苯丙氨酸、1-甲基組氨酸、 琥珀酸、α-酮戊二酸、順式烏頭酸、丙酮酸、檸蘋酸、馬尿酸。推測(cè)這10 種氨基酸差異代謝物可能參與了該復(fù)合茶調(diào)控高脂飲食小鼠的血脂紊亂。

2.5 差異代謝物篩選

通過觀察圖4，選擇VIP≥1 的代謝物作為顯著差異代謝物。 由差異代謝物條形圖中的每一條形，差異代謝物VIP 值圖、差異代謝物火山圖中的每一點(diǎn)及差異代謝聚類熱圖中的每一行代表一種顯著差異代謝物。 在差異代謝物篩選結(jié)果中可以看出，NK-vs-YK 中代謝物差異較小，CK-vs-YK中的代謝物差異相對(duì)較大（圖4a～4f）。 還知道在CK-vs-DH、NK-vs-DH、NK-vs-YK 中分別有9，13，5 種下調(diào)的顯著差異代謝物；在DH-vs-YK 中除了L-瓜氨酸和N-乙酰基亮氨酸為上調(diào)顯著差異代謝物，其余皆為下調(diào)的顯著差異代謝物；在CK-vs-YK 中上調(diào)和下調(diào)的顯著差異代謝物數(shù)量相近； 在CK-vs-NK 中僅有3-羥基-3-甲基谷氨酸是下調(diào)顯著差異代謝物，其它顯著差異代謝物皆是上調(diào)的（圖4a～4f）。 詳細(xì)情況見表2 和表3。

表2 差異代謝物篩選結(jié)果Table 2 Screening results of differential metabolites

CK-vs-DH 對(duì)比發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組與復(fù)合茶組的組間差異最?。▓D4a），說明復(fù)合茶對(duì)高脂誘導(dǎo)的小鼠肝臟代謝有明顯影響，能減少脂肪，降低血脂水平。 其中，9 種顯著差異代謝物VIP>1 （圖4a）均呈現(xiàn)下調(diào)，其中延胡索酸、檸蘋酸、L-正亮氨酸是該對(duì)比組特有的顯著差異代謝物，而L-冬胺基乙酸-L-苯丙胺基乙酸是差異倍數(shù)最大的代謝物log2FC=10。 延胡索酸調(diào)節(jié)高脂血癥有促進(jìn)作用，說明延胡索酸在氨基酸代謝中對(duì)高脂血癥的調(diào)節(jié)呈負(fù)相關(guān)。

CK-vs-NK 有10 種顯著差異代謝物VIP>1（圖4b），僅有3-羥基-3-甲基谷氨酸是下調(diào)的，其余9 種全是上調(diào)差異代謝物，茶氨酸、馬尿酸、L-色氨酸、Nα-乙酰-L-精氨酸對(duì)比組特有的顯著差異代謝物。 研究表明，茶氨酸、馬尿酸對(duì)降脂有積極作用，說明茶氨酸、馬尿酸在氨基酸代謝中對(duì)調(diào)節(jié)高脂血癥表現(xiàn)出正相關(guān)的關(guān)系。

CK-vs-YK 有23 種顯著差異代謝物VIP>1（圖4c），其中與CK-vs-NK 共有的差異代謝物均顯示對(duì)氨基酸代謝有上調(diào)作用，除了L-冬胺基乙酸-L-苯丙胺基乙酸、5-氧化脯氨酸上調(diào)以外，其余均下調(diào)，包括1-甲基組氨酸和甘氨酸，它是該組特有的顯著差異代謝物。 L-瓜氨酸通過改變腸道菌群和菌門豐度，導(dǎo)致小鼠高脂或增重[20]，說明L-瓜氨酸在氨基酸代謝通路中對(duì)高脂血癥的調(diào)節(jié)是正相關(guān)。3-羥基-3-甲基谷氨酸是前3 組共有的下調(diào)差異代謝物，目前尚未明確其是否與正常對(duì)照組有密切關(guān)系。

NK-vs-DH 有13 種對(duì)氨基酸代謝有下調(diào)的顯著差異代謝物VIP>1（圖4d）。

NK-vs-YK 有5 種對(duì)氨基酸代謝有下調(diào)的顯著差異代謝物VIP>1（圖4e），且與NK-vs-DH 無共有差異代謝物，3-碘化酪氨酸和N-乙?；拾彼崾窃搶?duì)照組特有的顯著差異代謝物。

YK-vs-DH 有14 種顯著差異代謝物VIP>1（圖4f），除了與CK-vs-YK 共有的L-瓜氨酸和丙甘氨酸上調(diào)外，其余皆是下調(diào)的差異代謝物。半胱氨酰甘氨酸是該對(duì)照組特有的顯著差異代謝物。L-冬胺基乙酸-L-苯丙胺基乙酸和L-高胱氨酸是CK-vs-DH、NK-vs-DH、YK-vs-DH 及CK-vs-NK共有的顯著差異代謝物。

圖4 差異代謝物的條形圖、VIP 值圖、火山圖、各組差異韋恩圖Fig.4 Bar chart of differential metabolites，VIP value chart of differential metabolites，Volcano chart of differential metabolites，Venn diagram of different groups

2.6 差異代謝物的統(tǒng)計(jì)分析

利用UPLC-MS/MS 檢測(cè)平臺(tái)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，檢測(cè)出氨基酸及其衍生物代謝物97 個(gè)，組間對(duì)比篩選出有顯著差異代謝物39 種。

表1 差異代謝物數(shù)目統(tǒng)計(jì)表Table 1 Statistical table of the number of differential metabolites

2.7 差異代謝物的富集分析與功能注釋

KEGG （Kyoto encyclopedia of genes an d genomes）數(shù)據(jù)庫可以把基因信息表達(dá)和代謝物含量看成一個(gè)整體的網(wǎng)絡(luò)。

按照KEGG 通路類型進(jìn)行顯著差異代謝物的分類繪圖，同時(shí)進(jìn)行KEGG 通路的富集分析；其中Rich factor 值越大，富集程度越大；P 值越接近0，富集越顯著。 差異代謝物KEGG 分類圖中點(diǎn)的大小表示富集到相應(yīng)通路上顯著差異代謝物的個(gè)數(shù)。

CK-vs-DH 對(duì)比中的顯著差異代謝物主要存在的路徑是組織系統(tǒng)、代謝、人類疾病、環(huán)境信息處理，代謝主要是組氨酸代謝，在該途徑中的差異代謝物數(shù)量較多而且差異也相對(duì)顯著，其余途徑包括丁酸代謝、精氨酸生物合成、原核生物的碳固定途徑、檸檬酸循環(huán)（TCA 循環(huán)）、胰高血糖素信號(hào)途徑（圖5a）；CK-vs-NK 的顯著差異代謝物主要存在的路徑是丙氨酸代謝途徑 （圖5b）；CK-vs-YK 對(duì)比中顯著差異代謝主要路徑是賴氨酸降解（圖5c）；NK-vs-DH 對(duì)比中氨基酸代謝路徑是半胱氨酸和甲硫氨酸代謝（圖5d）；其余兩對(duì)比組差異代謝物較少，且差異很?。▓D5e、5f）。

圖5 差異代謝物KEGG 分類圖（左）、差異代謝物KEGG 富集圖（右）Fig.5 Classification map of differential metabolite KEGG （left），enrichment map of differential metabolite KEGG （right）

通路歸屬分析是使找到的差異代謝物定位到相應(yīng)代謝途徑中，再根據(jù)差異物質(zhì)找出組間有顯著差異的代謝途徑； 差異代謝則在生物體內(nèi)產(chǎn)生相互作用，從而形成了不同的通路。而在整個(gè)通路中有多種酶催化復(fù)雜反應(yīng)，在通路圖中與其表達(dá)基因有關(guān)的酶，使用KEGG 數(shù)據(jù)庫標(biāo)示相應(yīng)酶的數(shù)字，再根據(jù)對(duì)比組之間差異，觀察出代謝通路的差異表達(dá)，尋找研究對(duì)象中表型差異的原因。

圖6 差異代謝物KEGG 通路圖Fig.6 Pathway of differential metabolite KEGG

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

氨基酸及其衍生物是構(gòu)成生物機(jī)體的活性大分子，在肝臟中進(jìn)行代謝制造出相關(guān)的酶和激素來維持和調(diào)節(jié)機(jī)體的新陳代謝。 多個(gè)氨基酸和多個(gè)肽鍵（主要是在肽基轉(zhuǎn)移酶等酶催化下形成肽鍵）組合合成蛋白質(zhì)，是一個(gè)很復(fù)雜的催化過程，有不止一個(gè)酶的參與。 細(xì)胞色素P450（Cytochrome P450，CYP450）酶系統(tǒng)是機(jī)體重要的代謝酶，它參與了許多內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的代謝，也是氨基酸代謝中重要的催化酶[21]。 馬尿酸是連續(xù)性靜脈-靜脈血液透析濾過（CVVHDF）治療中含量上升的一種氨基酸，可改善氨基酸代謝等過程，維持機(jī)體代謝平衡[22]；在本實(shí)驗(yàn)條件中，于CK-vs-NK 中發(fā)現(xiàn)馬尿酸呈上調(diào)，即NK 組里抑制了馬尿酸的表達(dá)，可能就使機(jī)體不能正常維持代謝平衡，導(dǎo)致高脂現(xiàn)象出現(xiàn)。 呂艷秋等[23]研究延胡索酸可以使體外培養(yǎng)中的丙酸和總揮發(fā)性脂肪酸的含量提高，降低其乳酸的沉積量，從而減少脂肪的積累。 許婷[24]研究了大腸桿菌中，通過擴(kuò)增延胡索酸還原酶（FRD）基因，從而增大了延胡索酸轉(zhuǎn)化為琥珀酸這一代謝途徑上的通量，從而減少脂肪的積累。在該試驗(yàn)中，空白對(duì)照組與模型對(duì)照組和陽性對(duì)照組對(duì)比下，琥珀酸皆呈上調(diào)趨勢(shì)，說明在模型對(duì)照組和陽性對(duì)照組處理中，可能是通過抑制琥珀酸的表達(dá)，使得脂肪累積引起高脂；而空白對(duì)照組與復(fù)合茶組對(duì)比中，延胡索酸是下調(diào)的，即可能是復(fù)合茶通過誘導(dǎo)延胡索酸的表達(dá)，及促進(jìn)轉(zhuǎn)化為琥珀酸來減少脂肪，起到降脂的作用。李曉斌等[20]研究L-瓜氨酸通過增加放線、軟壁、擬桿菌門及疣微菌門的豐度來改變小鼠盲腸門水平菌群組成，從而增加小鼠的末重、總增重及平均日增重，可能會(huì)出現(xiàn)高脂現(xiàn)象。在本研究的陽性對(duì)照與復(fù)合茶對(duì)比組中，L-瓜氨酸表現(xiàn)出上調(diào)，說明復(fù)合茶可能是通過抑制了生成L-瓜氨酸基因的表達(dá)，有效控制其增重，即血脂康處理的減脂效果可能不如該復(fù)合茶。 這些結(jié)論說明氨基酸及其衍生物代謝可以調(diào)節(jié)高脂血癥，然而其機(jī)理還需進(jìn)一步研究論證。

本實(shí)驗(yàn)受試樣品是由都勻古樹綠茶、 都勻闊葉苦丁、都勻原樹甜茶、金銀花、荷葉、野薄荷配制而成的復(fù)合茶。 苦丁茶能夠降低肝臟中脂肪合成和積累相關(guān)基因 （FAS、SREBP-1c、PPAR γ 和LXR α）的表達(dá)，促進(jìn)脂代謝相關(guān)基因（CPT-1 和PPARa）的表達(dá)，可以降低小鼠肝臟的質(zhì)量以及血清中總膽固醇（TC）和低密度脂蛋白（LDL-C）的濃度，具有一定減脂的作用[25]。 甜茶提取物中發(fā)現(xiàn)的主要化合物是沒食子酸、鞣花酸，通過維持胰島素敏感性，有助于防止肥胖癥和2 型糖尿病等代謝性疾病的早期發(fā)作[26]。 金銀花提取物可顯著降低血清中前言載脂蛋白B （apo-B）、INS 水平以及蛋黃中TG、TC、LDL/HDL 含量，顯著提高血清中超氧化物歧化酶（SOD）水平（P<0.05）[27]。荷葉中的主要活性成分為荷葉堿，是一種具有調(diào)節(jié)血脂和治療肥胖相關(guān)疾病的阿樸啡類生物堿，它對(duì)細(xì)胞色素P450 酶活性有抑制作用，且對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)體P-糖蛋白（P-g p）功能具有抑制效果[28]。 小鼠肝臟中氨基酸代謝可能受到這些物質(zhì)的某些積極刺激或抑制相應(yīng)的表達(dá)，達(dá)到減脂作用。

3.2 結(jié)論

本研究通過高脂飲食建立高脂小鼠模型，隨機(jī)分組飼養(yǎng)30 d 后殺死并取出肝臟，檢驗(yàn)分析氨基酸及其衍生物代謝情況。 首先觀察樣品總離子流圖說明機(jī)器運(yùn)行比較穩(wěn)定可靠，證明測(cè)得的數(shù)據(jù)結(jié)果真實(shí)可信；再經(jīng)PCA 分析、OPLS-DA 模型分析、差異代謝物篩選及其通路分析；最后發(fā)現(xiàn)各對(duì)比組之間氨基酸及其衍生物代謝對(duì)高脂血癥小鼠的治療效果各有不同。 經(jīng)分析CK-vs-DH，CKvs-NK，CK-vs-YK，NK-vs-DH，NK-vs-YK 以及YK-vs-DH 6 個(gè)對(duì)比組，比較組內(nèi)和組間對(duì)高脂血癥小鼠肝臟的影響發(fā)現(xiàn)：1） 該復(fù)合茶可能通過促進(jìn)馬尿酸、延胡索酸、琥珀酸等氨基酸代謝物生產(chǎn)，來減少脂肪和抑制L-瓜氨酸等氨基酸代謝物產(chǎn)生來控制其增重，達(dá)到降脂作用；2）本實(shí)驗(yàn)所用的復(fù)合茶與血脂康減脂效果相比更加明顯；3）丙甘氨酸與L-瓜氨酸的降脂功效可能相仿，尚不明確，還需進(jìn)一步研究。

4 展望

基于代謝組學(xué)技術(shù)探討復(fù)合茶中氨基酸及其氨基酸衍生物代謝對(duì)小鼠肝臟代謝的影響，以及探索復(fù)合茶中氨基酸及其氨基酸衍生物的降脂機(jī)理，為該復(fù)合茶的開發(fā)和利用提供一定參考。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸及其衍生物代謝可能是預(yù)防和治療高脂血癥、肥胖、腸道菌群紊亂、脂肪組織和肝臟的慢性炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變、非酒精性脂肪肝、骨關(guān)節(jié)炎、心血管等疾病以及某些相似癌癥的新途徑。