活性引導結合高速逆流色譜分離藍莓活性成分及其與α-葡萄糖苷酶的相互作用

楊兆艷，田艷花，王玲麗，譚佳琪

（1 山西藥科職業(yè)學院食品工程系 太原 030031 2 運城學院生命科學系 山西運城 044000 3 北京大學前沿交叉研究院 北京 100091）

天然產(chǎn)物的化學成分非常復雜，傳統(tǒng)的分離方法存在操作復雜、 耗時長和效率低等問題。 因此，提出一種潛在的以活性為導向的分離方法，以提高活性化合物的分離效率[1]。通過活性引導結合色譜技術對活性化合物進行富集和分離，最終得到高純度活性化合物，該技術已被成功應用于抗菌香豆素[2]、抗腫瘤藥物[3]和水溶性抗氧化劑[4]分離。柱色譜是活性引導中最重要的色譜技術，常用于從天然植物資源中分離各種活性化合物，然而，該技術在分離化合物的過程中，不可逆吸附會造成微量活性化合物丟失[5]。 該現(xiàn)象可以通過液-液萃取來避免，液-液萃取通常被用于粗提物的初步純化。 傳統(tǒng)的液-液萃取分離效率低，導致萃取物的組成仍非常復雜，因此需改進以獲得目標活性成分。高速逆流色譜（High-speed counter-current chromatography，HSCCC） 作為一種不需要任何固體相作為載體的連續(xù)液-液萃取方法，被廣泛用于從粗提物中制備活性化合物[6-7]。 HSCCC 可以避免樣品在固相上的不可逆吸附。與傳統(tǒng)色譜法相比，HSCCC 可以提高樣品的載樣能力，便于活性物質的大規(guī)模制備。 采用HSCCC 分離后，目標組分中的雜質大幅減少，有效成分的分離成功率顯著提高。

藍莓（Vaccinium spp.）屬杜鵑花科越橘屬，廣泛種植于世界各地，尤其在我國東北地區(qū)種植面積較廣。 藍莓中富含花色苷、酚酸、超氧化物歧化酶和各種維生素等活性成分[8]。大量研究表明藍莓中活性化合物具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎和抗衰老等功效[9]。 此外，藍莓中的一些化合物可以改善血糖和血壓水平[10]。 α-葡萄糖苷酶作為一種水解酶，具有水解和轉糖苷的雙重功能。 它被廣泛應用于乙醇發(fā)酵、低聚糖生產(chǎn)、淀粉水解、食品成分分析和代謝機理研究等方面[11]。 α-葡萄糖苷酶通過加水切割寡糖/多糖中的α-1，4-糖苷鍵，產(chǎn)生游離的α-D-葡萄糖，易被腸細胞從血液中吸收，導致餐后血糖水平升高[12]。 而控制餐后血糖水平是治療或預防2 型糖尿病的關鍵。 目前α-葡萄糖苷酶被用作治療2 型糖尿病的靶點酶，臨床藥物一般通過抑制其活性來治療2 型糖尿病[13]。 雖然這些藥物在臨床上有效，但是長期使用耐藥性增強，同時會產(chǎn)生不良反應。 天然活性化合物被作為潛在的α-葡萄糖苷酶抑制劑，可以避免上述問題。 目前，有研究表明，酚酸和黃酮類化合物對α-葡萄糖苷酶具有較好的抑制作用[14-15]，而藍莓中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的成分及與酶的相互作用尚未闡明。

鑒于此，本研究建立活性引導結合HSCCC 分離藍莓中具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的組分，并通過紫外光譜、傅立葉紅外光譜、高效液相色譜-質譜聯(lián)用及核磁技術鑒定其結構；采用熒光光譜、圓二色譜和分子對接技術研究活性組分與α-葡萄糖苷酶的相互作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮矮叢藍莓購于小興安嶺地區(qū)，經(jīng)除雜清洗后，自然晾干。 利用九陽破壁機將其打漿，果漿首先置于-80 ℃冰箱預冷12 h，預冷結束后將其置于真空冷凍干燥機中，連續(xù)干燥72 h，然后采用植物粉碎機將其粉粹，過40 目篩，制得藍莓果粉，將其避光保存在-18 ℃冰箱中備用。

α-葡萄糖苷酶（50 U/mg，68.5 ku，釀酒酵母），上海聯(lián)碩生物科技有限公司； 對硝基苯-α-D-吡喃葡糖苷 （4-Nitrophenyl α-D-glucopyranoside，PNPG），上海吉至生化科技有限公司；對硝基苯酚（P-nitrophenol，PNP），泰州蘇澤化工材料有限公司； 甲基叔丁基醚 （Methyl tert-butyl ether，MTBE），上海金錦樂實業(yè)有限公司；正丁烷（1-butane，1-BU），上海脈鉑醫(yī)藥科技有限公司； 乙腈（Acetonitrile，ACN），上海升德醫(yī)藥科技有限公司；三氟乙酸（Trifluoroacetic acid，TFA），南京草本源生物科技有限公司；Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠，北京綠百草科技發(fā)展有限公司；甲醇、乙醇和甲酸（分析純級），湖北惠擇普醫(yī)藥科技有限公司。

1.2 儀器與設備

LC-40 高效液相色譜，廣東晟澤科技有限公司；LCMS-8080日本島津三重四極桿液相色譜質譜聯(lián)用儀，日本島津公司；HSCCC-TBE1000A 高速逆流色譜，深圳同田生化技術有限公司；LANYI-650CT 超聲波提取儀，上海蘭儀實業(yè)有限公司；3-18KS 高速離心機，北京博邁星儀器有限公司；SHZ-D 臺式循環(huán)水多用真空泵，河南金博儀器制造有限公司；Advance 400MHz 核磁共振譜儀，德國布魯克公司；752N 紫外可見分光光度計，濟南好來寶醫(yī)療器材有限公司；PHSJ-3F 高精度臺式數(shù)顯pH 酸度計，上海力辰儀器科技有限公司；RGF-6300 原子熒光分光光度計，杭州俊升科學器材有限公司；DSM 20 CD 圓二色光譜儀，皕赫國際貿(mào)易（上海）有限公司；DJ10R-K6 九陽豆?jié){機，山東九陽股份有限公司；124-1CN 分析天平，愛來寶（濟南）醫(yī)療科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品提取物制備 在預試驗的基礎上，采用超聲輔助提取藍莓中具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的成分，利用60%乙醇作為提取溶劑。 稱取1 000 g 藍莓粉末，按照料液比1∶3 g/mL 加入60%乙醇，將其充分混合后，置于超聲提取設備中，設定超聲功率350 W，提取溫度50 ℃，提取時間25 min，待提取結束后，將提取液通過高速離心機離心（7 000 r/min，15 min），過濾收集濾液。 殘渣采用同樣的方式提取3 次，合并濾液。 濾液先通過40℃旋轉蒸發(fā)儀除去大部分溶劑，后置于真空冷凍干燥機中將其凍干，得到藍莓粗提物樣品（43.18 g）。藍莓粗提物樣品經(jīng)水復溶后，再依次通過500 mL 石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，將每種溶劑得到的提取液進行濃縮干燥后，分別得到0.69 g石油醚提取物 （樣品1）、2.84 g 乙酸乙酯提取物（樣品2）、7.03 g 正丁醇提取物（樣品3）和18.47 g水提取物（樣品4）。

1.3.2 HSCCC 分離 參考薛宏坤等[16]的方法，選擇1-BU-MTBE-ACN-水-TFA （2∶2∶1∶5∶0.01，V/V）作為HSCCC 溶劑體系，設定上相作為固定相，下相作為流動相。 依據(jù)α-葡萄糖苷酶抑制活性試驗發(fā)現(xiàn)，樣品4 對α-葡萄糖苷酶抑制效果明顯優(yōu)于其它樣品。 因此，選擇樣品4 進一步分析。 分別稱取0.20 g 樣品4，溶于20 mL 上相和20 mL 下相，待兩相平衡后，將上、下相分離，并利用超聲脫氣30 min。樣品在分離前，設定溫度和固定相流速分別為25 ℃和15 mL/min，直到固定相充滿整個螺線管后，打開主機，設定轉速850 r/min，待轉速恒定后，將流動相以2 mL/min 流速泵入進行分離，在波長254 nm 處檢測，根據(jù)HPLC 對應的出峰時間進行分步收集組分，并對其濃縮干燥，然后避光保存于-18 ℃冰箱中備用。

1.3.3 Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠分離 采用Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠進一步純化，經(jīng)HSCCC 分離獲得具有最高α-葡萄糖苷酶抑制活性組分（F4）。 稱取20 g Sephadex LH-20 凝膠，加200 mL 蒸餾水充分飽和，轉移至洗脫柱（30 cm×2.5 cm）中，并用體積分數(shù)45%丙酮洗脫。稱取1.0 mg F4，用蒸餾水溶解，采用0.22 μm 微孔膜對樣品溶液過濾，然后將其轉移至凝膠床上，待組分完全滲透到凝膠床后，采用體積分數(shù)50%甲醇溶液洗脫色譜柱，收集洗脫液，并將其濃縮干燥后，即可獲得高純度的α-葡萄糖苷酶抑制活性組分（組分Ⅰ）。

1.3.4 組分Ⅰ鑒定

1.3.4.1 紫外掃描 將組分Ⅰ配制成0.1 mg/mL樣品溶液，然后在波長200～700 nm 范圍內(nèi)掃描，分析組分Ⅰ的紫外光譜特征。

1.3.4.2 傅里葉紅外光譜掃描 稱取2.0 mg 組分Ⅰ，按照1 ∶100（g/g）加入KBr 粉末，共同研磨壓片，然后對其在波長400～4 000 cm-1范圍內(nèi)進行光譜掃描，分析組分Ⅰ的紅外光譜特征。

1.3.4.3 HPLC 分析 樣品處理：分別稱取1.0 mg樣品4、F4 和組分Ⅰ于試管中，加入0.1%HCl-甲醇溶液，配制成0.1 mg/mL 溶液，利用0.45 μm 濾膜對溶液進行過濾，用于HPLC 分析。

色譜條件： 島津-228 C18柱 （6.0 mm×150 mm，5.0 μm）；選擇體積分數(shù)20%甲酸作為流動相A，體積分數(shù)60%乙腈作為流動相B。 洗脫程序：5%～20%B，10 min；20%～25%B，5 min；25%～30%B，10 min；30%～33%B，5 min；33%～5%B，15 min。柱溫、 進樣量和檢測波長分別設為25 ℃，20 μL，520 nm。 依據(jù)公式（1）計算樣品組分的純度。

式中，Pi——待測樣品 （i） 峰面積百分數(shù)；λi——校正因子；Ai——待測樣品（i）峰面積。

1.3.4.4 HPLC-MS 分析 質譜條件：質譜采用正離子掃描方式對樣品進行掃描，掃描范圍100～1 000 m/z，同時分別設定霧化器壓力、干燥氣溫度和毛細管電壓分別為138 kPa，335 ℃，4.5 kV。

1.3.4.5 NMR 鑒定 樣品處理：稱取5.0 mg 組分Ⅰ，加入氚代甲醇將其溶解，配制成0.1 mg/mL 的溶液，利用0.45 μm 濾膜對其過濾，用于1H NMR和13C NMR 分析。

1.3.5 α-葡萄糖苷酶抑制試驗 α-葡萄糖苷酶能水解PNPG 生成黃色的PNP，PNP 在波長405 nm 處有最大吸收峰。參考文獻[17]的方法，分別取1 mL α-葡萄糖苷酶（0.2 μmol/L）置于試管中，分別加入1 mL 質量濃度為10，20，40，80，160 μg/mL樣品溶液（樣品1～4 和HSCCC 分離獲得的組分）和1 mL 組分Ⅰ（矢車菊-3-O-葡萄糖苷，Cyanidin-3-O-glucoside，C3G）（10，20，40，80，160 μmol/L），并將其充分混合，其余操作參考文獻[17]的方法。依據(jù)式（2）計算樣品對α-葡萄糖苷酶抑制率。

1.3.6 熒光光譜測定 參照Zeng 等[18]的方法，將1 mL 不同濃度C3G（10，20，40，80，160 μmol/L）分別與4 mL α-葡萄糖苷酶液（0.2 U/mL）均勻混合，分別在25，30，37 ℃條件下反應10 min，然后對其進行熒光光譜掃描，設定掃描波長范圍為320～380 nm，激發(fā)波長為295 nm，發(fā)射和激發(fā)的狹縫寬度均為10 nm。

1.3.7 圓二色譜 采用圓二色譜儀測定C3G 對α-葡萄糖苷酶二級結構的影響。樣品分別為α-葡萄糖苷酶（20 μmol/L）和α-葡萄糖苷酶（20 μmol/L）+C3G（40 μmol/L）。 圓二色譜設置條件為：掃描速率60 nm/min，光譜分辨率1 nm，響應1 s，帶寬1 nm。 測定樣品在200～250 nm 下的遠紫外吸收，計算α-葡萄糖苷酶二級結構中α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)則卷曲的變化。

1.3.8 分子對接模擬 采用AutoDck4.2 軟件進行分子對接模擬。C3G（CID：132989527）的分子結構來自PubChem 分子庫，用于配體對接。 晶體結構α-葡萄糖苷酶（PDB ID：3A47） 可在RSCB 蛋白質數(shù)據(jù)庫中獲得（https：//www.rcsb.org/）在對接過程中被用作受體。 利用Lamarck 遺傳算法計算配體和大分子可能的構象。 根據(jù)計算結果中以結合能最小為原則，得到最優(yōu)對接結果，并進一步分析。

2 結果與分析

2.1 α-葡萄糖苷酶抑制效果

本研究以α-葡萄糖苷酶抑制活性為導向，進行提取分離，篩選出具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的藍莓組分。 藍莓粗提物樣品對α-葡萄糖苷酶抑制效果如圖1a 所示。 由圖1a 可知，當藍莓粗提物樣品質量濃度在10～160 μg/mL 范圍內(nèi)，α-葡萄糖苷酶抑制率隨藍莓粗提物樣品質量濃度增加而顯著增加（P<0.05），且呈濃度依賴性。 當藍莓粗提物樣品質量濃度為160 μg/mL 時，α-葡萄糖苷酶抑制率高達72.82%±1.64%。 結果表明，藍莓粗提物樣品中含有具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的活性成分。為使活性成分被分段和富集，本研究將藍莓粗提物樣品依次通過石油醚、 乙酸乙酯和正丁醇萃取，分別得到不同提取物，提取物在最大質量濃度（160 μg/mL）條件下對α-葡萄糖苷酶抑制效果如圖1b 所示。 由圖1b 可知，樣品1～4 對α-葡萄糖苷酶抑制效果存在顯著差異（P<0.05）。 樣品1和樣品2 能促進α-葡萄糖苷酶發(fā)揮作用。 其原因可能是由于石油醚提取物和乙酸乙酯提取物中的活性成分促進α-葡萄糖苷酶活性位點的釋放，有利于酶發(fā)揮作用。 樣品3 和樣品4 均能有效抑制α-葡萄糖苷酶活性，而樣品4 對α-葡萄糖苷酶抑制效果明顯優(yōu)于樣品3（P<0.05）。 因此，選擇樣品4 作為下一步的研究對象，利用活性引導結合HSCCC 分離純化樣品4 中具有α-葡萄糖苷酶抑制效果的活性成分。

圖1 藍莓粗提取物（a）、液-液提取物（b）、HSCCC 組分（c）和組分Ⅰ（d）對α-葡萄糖苷酶抑制率的影響Fig.1 Effect of blueberry crude extract （a），liquid-liquid extract （b），HSCCC component （c） and component I （d）on the inhibition rate of α-glucosidase

2.2 HSCCC 組分及其對α-葡萄糖苷酶抑制效果

選取1-BU ∶MTBE ∶ACN ∶水∶TFA=2 ∶2 ∶1 ∶5 ∶0.01（V/V）作為HSCCC 溶劑體系，用于分離樣品4，其結果如圖2 所示。 由圖2 可知，樣品4 經(jīng)HSCCC 分離后得到6 種組分，分別命名為F1、F2、F3、F4、F5 和F6，此時固定相保留率為68.52%。固定F1、F2、F3、F4、F5 和F6質量濃度為160 μg/mL，測定其對α-葡萄糖苷酶的抑制率，結果如圖1C 所示。 由圖1c 可知，F(xiàn)4 對α-葡萄糖苷酶抑制率顯著高于其它組分（P<0.05）。 因此，選擇F4 進一步分析其組成。

圖2 HSCCC 分離樣品4 活性成分的色譜圖Fig.2 Chromatogram of active components in sample 4 separated by HSCCC

2.3 組分結構鑒定

2.3.1 HPLC 分析 采用HPLC 對樣品4 和F4 進一步采用HPLC 分析，其結果如圖3 所示。 由圖3a～3b 可知，樣品4 和F4 均有多個峰。說明樣品4和F4 是混合物，含有多種組分，含量最高的組分被記為組分Ⅰ。采用Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠進一步純化F4，獲得高純度的組分Ⅰ。 組分Ⅰ的HPLC 圖見圖3c，由圖3c 可知，組分Ⅰ僅有1 個單峰。 結果表明，組分Ⅰ為單一高純度化合物，依據(jù)式（1）計算組分Ⅰ的純度為95.06%。

圖3 樣品4（a）、F4（b）和組分Ⅰ（c）的HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of sample 4 （a），F(xiàn)4 （b）and component I （c）

2.3.2 紫外和傅里葉紅外光譜分析 為了鑒定組分Ⅰ的結構，首先利用紫外光譜對組分Ⅰ進行掃描，其結果如圖4a 所示。 由圖4a 可知，組分Ⅰ在278 nm 和519 nm 波長處具有特征吸收峰，說明組分Ⅰ屬于花色苷類物質。 隨后進一步對組分Ⅰ采用傅里葉紅外光譜掃描，其結果如圖4b 所示。 由圖4b 可知，3 372 cm-1和2 927 cm-1波長處對應的吸收峰分別是由O-H 和C-H 伸縮振動引起[19]。1 631 cm-1波長處對應的吸收峰可能與C=C 剪切振動有關。此外，1 497 cm-1和1 116 cm-1之間的紅外波段作為“指紋”區(qū)域，該區(qū)域是由C-O、C-C、C-H 伸縮振動引起，為有機化合物提供大量信息[20]。Molaeafard 等[21]和Ma 等[22]同樣利用傅里葉紅外光譜分析櫻桃和黑米中花色苷的官能團。

圖4 組分Ⅰ的紫外（a）和傅里葉紅外光譜（b）Fig.4 UV （a） and FTIR spectra （b） of component I

2.3.3 HPLC-MS 和NMR 分析 為進一步鑒定組分Ⅰ的結構，利用HPLC-MS、NMR 和參考文獻共同確定組分Ⅰ的結構。 組分Ⅰ的一級質譜和二級質譜分別如圖5a～5b 所示。組分Ⅰ分子離子峰[M+]為m/z 449.2，在質譜中，檢測到碎片離子為m/z 287.1。 m/z 287 屬于矢車菊素的特征離子，丟失的碎片m/z 162，可能是失去半乳糖和葡萄糖，同時檢測到組分Ⅰ最大吸收波長為516 nm，參考相關文獻報道[16]，初步判斷組分Ⅰ為矢車菊-3-O-葡萄糖苷。 隨后對組分Ⅰ進行NMR 檢測，數(shù)據(jù)如下：1H NMR （CF3COOD-CD3OD）： δ6.64 （1H，d，J=1.2 Hz，H-6），δ6.86 （1H，d，J=1.2 Hz，H-8），8.22（1H，dd，J=8.8，2.2 Hz，H-60），8.02（1H，d，J=2.2 Hz，H-2'），7.04（1H，d，J=8.8 Hz，H-5'），8.98（1H，s，H-4）； 5.31（1H，d，J=7.8 Hz，H-1 glc），3.69（1H，m，H-2 glc），3.56（2H，m，H-3，5 glc），3.46（1H，m，H-4 glc），3.73（1H，dd，J=12.2，5.6 Hz，H-6b glc），3.96（1H，dd，J=12.2，2.2 Hz，H -6a glc）；13C NMR （CF3COOD -CD3OD）： δ164.5 （C-2），145.8 （C-3），137.2（C-4），159.6 （C-5），103.7（C-6），170.8（C-7），95.4（C-8），157.9（C-9），113.6（C-10），121.5（C-1'），118.7 （C-2'），147.6 （C-3'），156.0 （C-4'），117.7（C-5'），128.4 （C-6'），104.1 （C-1 glc），75.0 （C-2 glc），78.3（C-3 glc），71.3（C-4 glc），79.0（C-5 glc），62.6（C-6 glc）。 組分Ⅰ1H 和13C 譜圖如圖5c～5d所示。 該研究結果與Lee 等[23]鑒定鵝掌楸果實中矢車菊-3-O-葡萄糖苷的NMR 信息一致。 故最終確定組分Ⅰ為矢車菊-3-O-葡萄糖苷 （Cyanidin-3-O-glucoside，C3G）。

圖5 組分Ⅰ一級質譜（a）、二級質譜（b）、1H（c）和13C（d）譜圖Fig.5 primary mass spectrometry （a），secondary mass spectrometry （b），1H （c） and 13C spectra （d） of component I

組分Ⅰ（C3G）對α-葡萄糖苷酶的抑制率結果如圖1d 所示。 由圖1d 可知，隨組分Ⅰ濃度增加α-葡萄糖苷酶抑制率顯著增加（P<0.05），呈濃度依賴性。 對上述數(shù)據(jù)進行非線性擬合可得組分Ⅰ對α-葡萄糖苷酶抑制率的IC50值為（47.52±0.85）μmol/L。 因此，選取組分Ⅰ（C3G）進一步探究其與α-葡萄糖苷酶的相互作用。

2.4 熒光光譜分析

不同濃度C3G（0～160 μmol/L）對α-葡萄糖苷酶熒光光譜影響結果如圖6a～6c 所示。由圖6a～6c 可知，在3 個溫度（25，30，37 ℃）下，α-葡萄糖苷酶的熒光強度隨C3G 濃度增加而逐漸減弱。 溫度和C3G 濃度越高，α-葡萄糖苷酶的熒光強度減弱越顯著。結果表明，α-葡萄糖苷酶的熒光強度受C3G 濃度和溫度依賴性猝滅的影響[18]。 此外，在C3G 作用下，α-葡萄糖苷酶的最大吸收峰（339 nm）沒有發(fā)生移動。 表明C3G 可能與α-葡萄糖苷酶形成復合物，改變了α-葡萄糖苷酶中色氨酸的微環(huán)境，猝滅α-葡萄糖苷酶內(nèi)熒光[12]。 戴濤濤[24]研究發(fā)現(xiàn)多酚類物質（原花青素B2 和茶多酚）能與α-葡萄糖苷酶結合猝滅α-葡萄糖苷酶內(nèi)熒光。

圖6 C3G 在25 ℃（a）、30 ℃（b）和37 ℃（c）時對α-葡萄糖苷酶熒光光譜的影響；C3G 對α-葡萄糖苷酶熒光猝滅的Stern-Volmer 曲線（d）； C3G 對α-葡萄糖苷酶熒光猝滅修正的Stern-Volmer 圖（e）Fig.6 The effect of C3G on the fluorescence spectrum of α-glucosidase at 25 ℃（a），30 ℃（b） and 37 ℃（c）；Stern-Volmer curve of fluorescence quenching of α-glucosidase by C3G（d）； Modified Stern-Volmer diagram of C3G on the fluorescence quenching of α-glucosidase （e）

2.4.1 熒光猝滅機制及結合常數(shù) 熒光光譜法是探究小分子物質與酶相互作用中最常用的一種方法，其原理是基于小分子活性成分與酶發(fā)生相互作用進而引起酶內(nèi)源性熒光發(fā)生變化，并通過數(shù)據(jù)分析獲得小分子活性成分與酶的結合常數(shù)和結合位點數(shù)等參數(shù)信息[17]。 采用Stern-Volmer 方程分析不同溫度下（25，30，37 ℃）熒光數(shù)據(jù)，得到相關的參數(shù)，如表1 所示。

式中，F(xiàn)0和F——分別為在沒有猝滅劑和有猝滅劑下反應體系熒光強度（au）；Kq和Ksv——分別為α-葡萄糖苷酶猝滅速率和Stern-Volmer 猝滅常數(shù)；τ0——在沒有猝滅劑下熒光分子壽命（s）。

由圖6d 可知，在3 個溫度下（25，30，37 ℃），Stern-Volmer 方程線性擬合較好，擬合R2均在0.95 以上。結果表明，α-葡萄糖苷酶熒光猝滅為動態(tài)猝滅或靜態(tài)猝滅，相關的擬合參數(shù)如表1 所示。由表1 可知，在溫度為25，30，37 ℃下，Ksv分別為（4.26±0.04）×103，（3.95±0.02）×103，（3.27±0.03）×103L/mol。 隨溫度升高Ksv降低，表明α-葡萄糖苷酶熒光猝滅過程為靜態(tài)猝滅。此外，α-葡萄糖苷酶最小熒光猝滅速率為（3.27±0.03）×1011/L（mol·s），該值遠大于最大動態(tài)熒光猝滅常數(shù)2×1010L/（mol·s）。 進一步表明α-葡萄糖苷酶熒光猝滅過程屬于靜態(tài)猝滅。在靜態(tài)猝滅過程中，采用雙對數(shù)方程計算C3G 與α-葡萄糖苷酶之間的結合常數(shù)（Ka）和結合位點數(shù)（n）。

表1 不同溫度下C3G 與α-葡萄糖苷酶的猝滅和結合常數(shù)Table 1 The values of quenching and binding parameters for C3G binding with α-glucosidase at different temperatures

由圖6e 可知，在3 個溫度下（25，30，37 ℃），雙對數(shù)方程線性擬合較好，擬合R2均在0.95 以上，回歸計算所得結合常數(shù)（Ka）和結合位點數(shù)（n）可信度較高，相關數(shù)據(jù)如表1 所示。 由表1 可知，在溫度為25，30，37 ℃下，Ka分別為 （1.30±0.01）×105，（1.27±0.03）×105，（1.11±0.02）×105L/mol。隨溫度升高Ka降低，說明C3G 與α-葡萄糖苷酶復合物的形成是個溫和的過程。 在溫度為25，30，37 ℃下，結合位點數(shù)（n）在1 附近，表示C3G 與α-葡萄糖苷酶有一個活性部位結合。

2.4.2 熱力學參數(shù) 采用熒光數(shù)據(jù)計算熱力學參數(shù)被用于確定C3G 與α-葡萄糖苷酶之間的相互作用。小分子與蛋白相互作用力主要有氫鍵、疏水相互作用、靜電相互作用和范德華力等作用力。相關研究已經(jīng)證實[25]：①當ΔS<0、ΔH<0，小分子和蛋白主要相互作用力為氫鍵； ②當ΔS>0、ΔH>0，小分子和蛋白主要相互作用力為疏水相互作用；③當ΔS>0、ΔH<0，小分子和蛋白主要相互作用力為靜電相互作用。 采用Van't Hoff 方程計算C3G與α-葡萄糖苷酶結合過程中的ΔS、ΔH 和ΔG，其結果如表2 所示。

式中，ΔS——商變 （kJ/mol·K）；ΔH——焓變（kJ/mol）；ΔG——吉布斯自由能變（kJ/mol）；R——理想氣體狀態(tài)常數(shù)（J/mol·K）。

由表2 可知，ΔS（kJ/mol·K）和ΔH（kJ/mol）分別為（-0.096±0.004）kJ/mol·K 和（-32.61±0.58）kJ/mol，ΔS 和ΔH 均為負值。 表明C3G 與α-葡萄糖苷酶主要相互作用力為氫鍵。 在25，30，37 ℃下，ΔG 分別為（-3.42±0.03），（-2.47±0.04），（-1.45±0.02）kJ/mol。不同溫度下ΔG 為負值。說明C3G 與α-葡萄糖苷酶的結合是自發(fā)進行的。

表2 不同溫度下C3G 與α-葡萄糖苷酶的熱力學常數(shù)Table 2 Thermodynamic constants of C3G and α-glucosidase at different temperatures

2.5 圓二色譜分析

采用圓二色譜儀測定C3G 對α-葡萄糖苷酶二級結構 （α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)則卷曲）的變化的影響，其結果如圖7 和表3 所示。

圖7 C3G 對α-葡萄糖苷酶二級結構及含量的變化Fig.7 Changes of secondary structure and content of α-glucosidase by C3G

由圖7 可知，當α-葡萄糖苷酶與C3G 作用后，α-葡萄糖苷酶負的橢圓峰上升，結果表明C3G的確影響了α-葡萄糖苷酶的二級結構。 圖7 顯示α-葡萄糖苷酶在209 nm 和221 nm 波長處出現(xiàn)2個負的橢圓峰，這個橢圓峰是α-螺旋結構特征。由表3 可知，α-葡萄糖苷酶二級結構中的α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)則卷曲分別為22.6%±0.3%，23.4%±0.1%，24.2%±0.4%，32.3%±0.3%，當加入C3G 后，此時α-葡萄糖苷酶二級結構中的α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)則卷曲分別為19.5%±0.3%，26.2%±0.3%，20.5%±0.5%，35.0%±0.4%。 結果表明加入C3G 后，α-葡萄糖苷酶二級結構中α-螺旋和β-轉角顯著降低（P<0.05），β-折疊和無規(guī)則卷曲顯著增加（P<0.05）。 該現(xiàn)象可能是由于C3G 與α-葡萄糖苷酶的結合促進了蛋白質多肽鏈的去折疊，破壞了α-葡萄糖苷酶的氫鍵網(wǎng)絡結構，進而導致α-葡萄糖苷酶構象發(fā)生改變[26]。

表3 C3G 對α-葡萄糖苷酶二級結構及含量的影響Table 3 Effect of C3G on the secondary structure and content of α-glucosidase

2.6 分子動力學模擬分析

采用AutoDock 軟件對C3G 與α-葡萄糖苷酶進行分子對接，通過分子對接結果驗證上述試驗的結果。 經(jīng)過100 次對接操作，從AutoDock 對接結果中選擇能量最低、 組合數(shù)最多的一次作為最終分析結果，其對接結果如圖8 所示。

圖8 α-葡萄糖苷酶與C3G 的3D 對接圖（a）和二維平面對接圖（b）Fig.8 3D docking diagram （a） and 2D planar docking diagram （b） of α-glucosidase and C3G

C3G 與α-葡萄糖苷酶形成復合物的捆綁結合能為-11.71 kcal/mol，該結果與估算的結合能一致，說明分子對接結果是準確可行的。 結合3D 對接模式和2 維示意圖，可以清楚地顯示C3G 插入到α-葡萄糖苷酶活動腔中。 圖8b 展示C3G 與氨基酸殘基發(fā)生相互作用，其中發(fā)生相互作用的氨基 酸 殘 基 包 括Ser 157、Tyr 158、Phe 314、Arg 315、Asp 307、His 280、Val 232 和Leu 313，它們是C3G 與α-葡萄糖苷酶之間可能的相互作用位點。 C3G 和氨基酸殘基 （Leu 313、Ser 157、Tyr 158、Phe 314、Arg 315 和2 個Asp 307）之間形成7 個氫鍵。 C3G 和氨基酸殘基（Val 232、Leu 313、Arg 315 和His 280）之間形成4 種疏水相互作用（1 個Pi-Pi T-Shaped，1 個Pi-Cation 和2 個Pi-Alkyl）。Tyr 和Phe 具有固有的熒光吸收特性。C3G和α-葡萄糖苷酶的氨基酸殘基（Tyr 和Phe）通過氫鍵形成復合物。 這一結果較好地解釋了C3G 與α-葡萄糖苷酶相互作用降低α-葡萄糖苷酶熒光強度。 圖8b 分別顯示了7 個氫鍵的距離（2.12，3.47，2.01，2.60，2.58，2.13，2.18?）和4 個疏水力的距離（6.18，5.81，4.71，4.52?）。C3G 與α-葡萄糖苷酶相互作用的綜合比較，證實氫鍵是C3G 與α-葡萄糖苷酶相互作用的主要驅動力。

3 結論

采用活性引導結合HSCCC 技術成功從藍莓中分離獲得純度為95.06%的C3G，C3G 并對α-葡萄糖苷酶具有較強的抑制作用。此外，利用光譜分析和分子對接的方法闡明C3G 與α-葡萄糖苷酶相互作用的主要驅動力為氫鍵。 α-葡萄糖苷酶與C3G 結合后，其二級結構發(fā)生了不同程度的變化。 其中α-螺旋和β-轉角含量降低，β-折疊含量和不規(guī)則的螺旋結構增加。 研究結果可為C3G 抑制α-葡萄糖苷酶的機制提供新的認識。