燈盞花素對宮內(nèi)炎癥致早產(chǎn)大鼠腦損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制探討

王思思 謝雙雙 孟玥秀 張翔云 劉云春 王玲玲 王艷飛

（河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 1.婦產(chǎn)科；2.新生兒科，河北張家口 075000）

宮內(nèi)炎癥是引起早產(chǎn)兒腦損傷的主要致病因素，可導(dǎo)致腦室周圍白質(zhì)軟化壞死、神經(jīng)元凋亡等病理現(xiàn)象，造成早產(chǎn)兒腦性癱瘓、視聽及語言障礙、認(rèn)知能力下降等神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥［1-2］。小膠質(zhì)細(xì)胞激活引發(fā)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)和細(xì)胞焦亡是宮內(nèi)感染造成早產(chǎn)兒腦損傷的主要機(jī)制，控制宮內(nèi)感染引發(fā)的炎癥和小膠質(zhì)細(xì)胞焦亡是防治早產(chǎn)兒腦損傷的關(guān)鍵［3-4］。核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是機(jī)體主要的抗氧化分子，在各種腦損傷疾病的發(fā)生機(jī)制中起到重要調(diào)控作用，上調(diào)Nrf2可通過減輕神經(jīng)炎癥而抑制神經(jīng)元死亡［5］，還可抵抗脂多糖誘導(dǎo)的母嬰炎癥，防治宮內(nèi)炎癥引起的早產(chǎn)和圍生期腦損傷［6］，由此可知，Nrf2是防治宮內(nèi)炎癥所致早產(chǎn)腦損傷的重要靶點(diǎn)。

燈盞花素是從燈盞花中提取的一類總黃酮，有抗菌消炎、抗血栓、抗氧化、清除自由基的作用，在臨床常用于腦梗死、冠心病等心腦血管疾病的治療，可明顯減輕腹腔鏡全子宮切除術(shù)患者圍術(shù)期應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)，促進(jìn)患者術(shù)后恢復(fù)［7］。燈盞花素還可通過激活Nrf2信號(hào)通路下調(diào)炎性因子白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6水平，從而抑制大鼠液壓沖擊腦損傷后腦組織炎性損傷［8］。由此推測燈盞花素可能通過激活Nrf2信號(hào)通路而抑制宮內(nèi)炎癥所致早產(chǎn)大鼠腦損傷與小膠質(zhì)細(xì)胞焦亡。

本文以燈盞花素處理宮內(nèi)炎癥致早產(chǎn)腦損傷模型大鼠，探究燈盞花素是否可通過其抗炎作用減輕宮內(nèi)炎癥所致早產(chǎn)大鼠腦損傷，以Nrf2抑制劑（ML385）和燈盞花素聯(lián)合處理宮內(nèi)炎癥致早產(chǎn)腦損傷模型大鼠，檢測ML385是否可逆轉(zhuǎn)燈盞花素對宮內(nèi)炎癥致早產(chǎn)大鼠腦損傷的保護(hù)作用，進(jìn)而探究燈盞花素對宮內(nèi)炎癥致早產(chǎn)大鼠腦損傷的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)Sprague-Dawley大鼠購自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（晉）2019-0007。雄性28只，約7周齡，體重240~270 g；雌性56只，約7周齡，體重190~220 g，均在本院屏障環(huán)境動(dòng)物房中心適應(yīng)飼養(yǎng)，1周后用于實(shí)驗(yàn)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（24±1）℃，濕度為44%±5%，晝夜時(shí)長12 h∶12 h。

1.2 主要藥物、試劑及儀器

注射用燈盞花素購自湖南恒生制藥股份有限公司，ML385、脂多糖、兔源抗大鼠血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）一抗購自北京索萊寶科技有限公司，蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色試劑盒、免疫熒光染色試劑盒-Alexa Fluor 488標(biāo)記的抗小鼠二抗、免疫熒光染色試劑盒-Alexa Fluor 555標(biāo)記的抗兔二抗、大鼠IL-1β酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒、RIPA裂解液、山羊抗兔二抗、兔源抗大鼠核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白 3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）一抗、兔源抗大鼠Nrf2一抗、兔源抗大鼠β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）一抗購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，兔源抗大鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（caspase-1）一抗、小鼠源抗大鼠離子鈣接頭蛋白分子-1（ionized calcium binding adaptor molecule-1，IBA-1）一抗、兔源抗大鼠NLRP3一抗購自美國Abcam公司，BCA法總蛋白定量測定試劑盒、IL-6 ELISA試劑盒、IL-8 ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所，MF-53N型倒置熒光顯微鏡購自蘇州阿爾法生物實(shí)驗(yàn)器材有限公司，F(xiàn)lexA-200型全波長酶標(biāo)儀購自杭州奧盛儀器有限公司，E-Gel Imager型凝膠成像系統(tǒng)購自廣州道一科學(xué)技術(shù)有限公司。

1.3 宮內(nèi)炎癥致早產(chǎn)腦損傷仔鼠模型建立及分組給藥

制備宮內(nèi)炎癥致早產(chǎn)腦損傷大鼠模型［9］：將雄雌大鼠以1∶2的比例合籠，檢查陰栓選出受孕成功的雌鼠，記為妊娠第1天，于孕鼠妊娠第16天腹腔內(nèi)注射350 μg/kg脂多糖，連續(xù)注射2 d至妊娠第17天結(jié)束，孕期≤21 d表明早產(chǎn)造模成功［9］。將早產(chǎn)造模成功的孕鼠隨機(jī)分為模型組、燈盞花素低劑量（45 mg/kg）組、燈盞花素高劑量（90 mg/kg） 組［8］、燈盞花素高劑量 （90 mg/kg）+ML385 （30 mg/kg） 組［10］，每組10只孕鼠；再隨機(jī)選取10只孕鼠腹腔內(nèi)注射等量0.9%氯化鈉溶液作為對照組。

用0.9%氯化鈉溶液將燈盞花素和ML385配制成濃度為4.5、9 mg/mL的燈盞花素溶液，9 mg/mL的燈盞花素和3 mg/mL的ML385混合藥液，各組孕鼠于妊娠第17天給藥（注射脂多糖后）。燈盞花素低劑量組、燈盞花素高劑量組孕鼠分別以10 mL/kg的劑量腹腔內(nèi)注射4.5、9 mg/mL的燈盞花素，使燈盞花素的劑量分別為45 mg/kg、90 mg/kg［8］；燈盞花素高劑量+ML385組孕鼠以10 mL/kg的劑量腹腔內(nèi)注射9 mg/mL的燈盞花素和3 mg/mL的ML385混合藥液，使燈盞花素和ML385［10］的劑量分別為90 mg/kg、30 mg/kg；模型組和對照組孕鼠以10 mL/kg的劑量腹腔內(nèi)注射0.9%氯化鈉溶液，每天早上9∶00注射1次，共注射2 d。

每組的10只孕鼠生產(chǎn)后，隨機(jī)自每組所有存活仔鼠中各選出10只，于出生后給藥（每天給藥后送回母鼠旁喂養(yǎng)）。燈盞花素低劑量組、燈盞花素高劑量組仔鼠分別腹腔內(nèi)注射45 mg/kg、90 mg/kg的燈盞花素；燈盞花素高劑量+ML385組仔鼠腹腔內(nèi)注射90 mg/kg燈盞花素和30 mg/kg的ML385；模型組和對照組仔鼠以10 mL/kg的劑量腹腔內(nèi)注射0.9%氯化鈉溶液，每天早上9∶00注射1次，共注射7 d。

1.4 測定各組孕鼠產(chǎn)出的仔鼠存活數(shù)和體重及標(biāo)本收集

各組孕鼠生產(chǎn)后，計(jì)數(shù)每只孕鼠產(chǎn)出的仔鼠存活數(shù)，稱量每只仔鼠體重，每組取平均值。異氟醚吸入麻醉產(chǎn)后的孕鼠，分離取出子宮和胎盤，清洗后浸沒入冷凍切片所需的包埋劑中，以液氮迅速冷凍成塊后，經(jīng)專業(yè)技術(shù)員切片得到厚為4 μm的子宮和胎盤組織切片備用。

1.5 HE染色檢測各組孕鼠子宮、胎盤病理形態(tài)及仔鼠腦組織病理形態(tài)

各組仔鼠于7 d給藥結(jié)束后24 h，異氟醚吸入麻醉后脫頸椎處死，解剖分離出仔鼠大腦，剪下0.4 g左腦組織加入1 mL 0.9%氯化鈉溶液研磨勻漿，取離心后的上清置于-80℃?zhèn)溆茫辉俅渭粝?.4 g左腦組織加入1 mL RIPA裂解液研磨勻漿，100℃加熱變性，以BCA法測定離心后上清中總蛋白濃度，置于-80℃?zhèn)溆茫皇Ｓ嘧竽X組織清洗后浸沒入冷凍切片包埋劑中，以液氮迅速冷凍成塊后切片，得到厚為4 μm的腦組織切片，與1.4中子宮和胎盤組織切片一起在室溫下靜置復(fù)溫，5 min后孵育冰丙酮固定15 min后取出，每只大鼠取子宮和胎盤組織切片3張，同時(shí)取具有腦室周圍白質(zhì)結(jié)構(gòu)的腦組織切片3張，參照HE染色試劑盒說明進(jìn)行，蒸餾水洗滌后在正常光下用顯微鏡觀察并拍照。

1.6 免疫熒光染色法檢測各組仔鼠腦皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞焦亡情況

取出1.4中各組仔鼠腦組織切片，室溫下靜置復(fù)溫，5 min后孵育冰丙酮固定，分別孵育3%雙氧水5 min后取出，3%牛血清白蛋白孵育2 h后取出，孵育IBA-1和NLRP3一抗（均1∶200稀釋）過夜后洗滌，孵育Alexa Fluor 488標(biāo)記的抗小鼠二抗（1∶100）和Alexa Fluor 555標(biāo)記的抗兔二抗（1∶100）2 h，參照免疫熒光染色試劑盒說明書進(jìn)行免疫熒光染色，避光洗滌后在熒光顯微鏡激發(fā)光下觀察IBA-1與NLRP3共表達(dá)情況并拍照。Image J軟件定量分析IBA-1與NLRP3共表達(dá)熒光強(qiáng)度，計(jì)算IBA-1與NLRP3共表達(dá)相對熒光強(qiáng)度=實(shí)驗(yàn)組IBA-1與NLRP3共表達(dá)熒光強(qiáng)度/對照組IBA-1與NLRP3共表達(dá)熒光強(qiáng)度。

1.7 ELISA法檢測各組仔鼠腦組織炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-8、IL-1β水平

將1.4中各組仔鼠腦組織樣品液取出置于4℃解凍，取0.2 mL參照ELISA試劑盒說明測量其中IL-6、IL-8、IL-1β含量。

1.8 免疫印跡法檢測各組仔鼠腦組織中Nrf2通路相關(guān)蛋白表達(dá)

將1.5中測出總蛋白濃度的各組仔鼠腦組織樣品液取出，置于4℃解凍后每組取出20 μg總蛋白，加入適量上樣緩沖液并置于100℃水浴變性，通過跑電泳后濕轉(zhuǎn)，將其按分子量大小分離轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，根據(jù)目的蛋白分子量將其自膜上剪下后都浸沒入3%牛血清白蛋白溶液中，室溫孵育2 h封閉蛋白非特異位點(diǎn)，然后分別孵育相應(yīng)的NLPR3、caspase-1、Nrf2、HO-1、β-actin一抗（分別按 1∶1 000、1∶3 000、1∶2 000、1∶2 000、1∶2 000稀釋）、山羊抗兔二抗（1∶1 500），化學(xué)發(fā)光法顯影后掃描出蛋白條帶圖片，運(yùn)用圖像處理軟件Image J分析各蛋白灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 燈盞花素對仔鼠存活數(shù)和體重的影響

與對照組相比，模型組仔鼠存活數(shù)和體重降低（P<0.05）；與模型組相比，燈盞花素低、高劑量組仔鼠存活數(shù)和體重均升高（P<0.05）；與燈盞花素低劑量組相比，燈盞花素高劑量組仔鼠存活數(shù)和體重均升高（P<0.05）。與燈盞花素高劑量組相比，燈盞花素高劑量+ML385組仔鼠存活數(shù)和體重降低（P<0.05）。見表1。

表1 各組仔鼠存活數(shù)和體重 （± s，n=10）

表1 各組仔鼠存活數(shù)和體重 （± s，n=10）

注：a示與對照組比較，P<0.05；b示與模型組比較，P<0.05；c示與燈盞花素低劑量組比較，P<0.05；d示與燈盞花素高劑量組比較，P<0.05。

images/BZ_93_1320_758_1755_817.pngimages/BZ_93_1320_876_1755_935.pngimages/BZ_93_1320_994_1755_1112.pngimages/BZ_93_1755_758_2034_817.pngimages/BZ_93_1755_876_2034_935.pngimages/BZ_93_1755_994_2034_1112.png組別對照組燈盞花素低劑量組燈盞花素高劑量+ML385組仔鼠存活數(shù)(只)11.2±1.7 8.3±0.9b 6.1±0.5d仔鼠體重(g)7.6±0.7 5.1±0.4a 6.2±0.4b 7.4±0.5b,c 5.4±0.4d 54.735<0.000

2.2 燈盞花素對孕鼠子宮、胎盤及仔鼠腦組織病理形態(tài)的影響

對照組孕鼠子宮及胎盤形態(tài)完好正常；仔鼠腦室周圍白質(zhì)結(jié)構(gòu)完好清晰，神經(jīng)纖維排列致密且走向整齊，整體形態(tài)正常無損傷。模型組孕鼠子宮及胎盤組織產(chǎn)生病理損傷，子宮壁和胎盤組織中有大量中性粒細(xì)胞浸潤且血管充血；仔鼠腦組織產(chǎn)生病理損傷，腦室旁白質(zhì)結(jié)構(gòu)稀疏并出現(xiàn)軟化灶，神經(jīng)纖維紊亂、呈網(wǎng)狀或條索狀排列，神經(jīng)元數(shù)目變少。與模型組相比，燈盞花素低、高劑量組孕鼠子宮、胎盤及仔鼠腦組織病理損傷均減輕；與燈盞花素低劑量組相比，燈盞花素高劑量組孕鼠子宮、胎盤及仔鼠腦組織病理損傷進(jìn)一步減輕；與燈盞花素高劑量組相比，燈盞花素高劑量+ML385組孕鼠子宮、胎盤及仔鼠腦組織病理損傷加重。見圖1~2。

圖1 各組孕鼠子宮及胎盤病理形態(tài)（蘇木精-伊紅染色，×200） A：對照組；B：模型組；C：燈盞花素低劑量組；D：燈盞花素高劑量組；E：燈盞花素高劑量+ML385組。對照組孕鼠子宮及胎盤形態(tài)完好正常；模型組子宮壁和胎盤組織有大量中性粒細(xì)胞浸潤且血管充血；燈盞花素低劑量組子宮壁和胎盤組織有少量中性粒細(xì)胞浸潤，血管充血輕微；燈盞花素高劑量組子宮壁和胎盤組織有很少中性粒細(xì)胞浸潤，血管幾乎不充血；燈盞花素高劑量+ML385組子宮壁和胎盤組織有大量中性粒細(xì)胞浸潤且血管充血。箭頭所指為炎性浸潤。

2.3 燈盞花素對仔鼠腦皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞焦亡的影響

對照組、模型組、燈盞花素低劑量組、燈盞花素高劑量組、燈盞花素高劑量+ML385組IBA-1與NLRP3共表達(dá)相對熒光強(qiáng)度分別為1.00±0、3.12±0.30、2.06±0.33、 1.29±0.32、2.91±0.35，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=105.041，P<0.001）。與對照組相比，模型組仔鼠腦皮質(zhì)產(chǎn)生嚴(yán)重小膠質(zhì)細(xì)胞焦亡，IBA-1和NLRP3共表達(dá)相對熒光強(qiáng)度升高（P<0.05）；與模型組相比，燈盞花素低、高劑量組仔鼠腦皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞焦亡均減輕，IBA-1和NLRP3共表達(dá)相對熒光強(qiáng)度降低（P<0.05）；與燈盞花素低劑量組相比，燈盞花素高劑量組仔鼠腦皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞焦亡減輕，IBA-1和NLRP3共表達(dá)相對熒光強(qiáng)度降低（P<0.05）；與燈盞花素高劑量組相比，燈盞花素高劑量+ML385組仔鼠腦皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞焦亡加重，IBA-1和NLRP3共表達(dá)相對熒光強(qiáng)度升高（P<0.05）。見圖3。

圖3 各組仔鼠腦皮質(zhì)中IBA-1和NLRP3共表達(dá)情況（免疫熒光染色，×200） A：對照組；B：模型組；C：燈盞花素低劑量組；D：燈盞花素高劑量組；E：燈盞花素高劑量+ML385組。IBA-1在仔鼠腦皮質(zhì)中呈現(xiàn)明亮的綠色熒光；NLRP3在仔鼠腦皮質(zhì)中呈現(xiàn)明亮的紅色熒光；DAPI標(biāo)記仔鼠腦皮質(zhì)細(xì)胞核染色，呈現(xiàn)藍(lán)色熒光；Merge為各組IBA-1、NLRP3和DAPI三者合成圖，IBA-1和NLRP3共表達(dá)相對熒光強(qiáng)度越低，表明仔鼠腦皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞焦亡越輕。

2.4 燈盞花素對仔鼠腦組織中IL-6、IL-8及IL-1β水平的影響

與對照組相比，模型組仔鼠腦組織中IL-6、IL-8及IL-1β水平升高（P<0.05）；與模型組相比，燈盞花素低、高劑量組仔鼠腦組織中IL-6、IL-8及IL-1β水平均降低（P<0.05）；與燈盞花素低劑量組相比，燈盞花素高劑量組仔鼠腦組織中IL-6、IL-8及IL-1β水平降低（P<0.05）；與燈盞花素高劑量組相比，燈盞花素高劑量+ML385組仔鼠腦組織中IL-6、IL-8及IL-1β水平升高（P<0.05）。見表2。

表2 各組仔鼠腦組織中IL-6、IL-8及IL-1β水平比較 （± s，n=10）

表2 各組仔鼠腦組織中IL-6、IL-8及IL-1β水平比較 （± s，n=10）

注：［IL-6］白細(xì)胞介素-6；［IL-8］白細(xì)胞介素-8；［IL-1β］白細(xì)胞介素-1β。a示與對照組比較，P<0.05；b示與模型組比較，P<0.05；c示與燈盞花素低劑量組比較，P<0.05；d示與燈盞花素高劑量組比較，P<0.05。

images/BZ_95_273_2878_891_2932.pngimages/BZ_95_273_2985_891_3038.pngimages/BZ_95_273_3091_891_3197.pngimages/BZ_95_891_2878_1353_2932.pngimages/BZ_95_891_2985_1353_3038.pngimages/BZ_95_891_3091_1353_3197.pngimages/BZ_95_1353_2878_1816_2932.pngimages/BZ_95_1353_2985_1816_3038.pngimages/BZ_95_1353_3091_1816_3197.png組別對照組燈盞花素低劑量組燈盞花素高劑量+ML385組IL-6 (pg/g)74±10 178±20b 241±40d IL-8 (ng/g)215±34 628±51b 960±91d IL-1β (ng/g)197±32 835±87a 526±50b 214±46b,c 815±81d 242.669<0.001

圖2 各組仔鼠腦組織病理形態(tài)（蘇木精-伊紅染色，×200） A：對照組；B：模型組；C：燈盞花素低劑量組；D：燈盞花素高劑量組；E：燈盞花素高劑量+ML385組。對照組腦室旁白質(zhì)結(jié)構(gòu)完好清晰，神經(jīng)纖維排列致密且走向整齊，整體形態(tài)正常；模型組腦室旁白質(zhì)結(jié)構(gòu)稀疏并出現(xiàn)軟化灶，神經(jīng)纖維紊亂、呈網(wǎng)狀或條索狀排列，神經(jīng)元數(shù)目變少；燈盞花素低劑量組腦室旁白質(zhì)結(jié)構(gòu)稀疏程度減輕，軟化灶減少，神經(jīng)纖維紊亂減輕，神經(jīng)元數(shù)目增多；燈盞花素高劑量組腦室旁白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得緊密，軟化灶大大減少，神經(jīng)纖維致密且走向整齊，神經(jīng)元數(shù)目增多；燈盞花素高劑量+ML385組腦室旁白質(zhì)結(jié)構(gòu)稀疏并出現(xiàn)軟化灶，神經(jīng)纖維紊亂、呈網(wǎng)狀或條索狀排列，神經(jīng)元數(shù)目變少。箭頭所指為炎性浸潤。

2.5 燈盞花素對仔鼠腦組織中NLPR3、caspase-1、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)的影響

與對照組相比，模型組仔鼠腦組織中NLPR3、caspase-1蛋白表達(dá)升高（P<0.05），Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)降低（P<0.05）；與模型組相比，燈盞花素低、高劑量組仔鼠腦組織中NLPR3、caspase-1蛋白表達(dá)降低（P<0.05），Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)升高（P<0.05）；與燈盞花素低劑量組相比，燈盞花素高劑量組仔鼠腦組織中NLPR3、caspase-1蛋白表達(dá)降低 （P<0.05），Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)升高（P<0.05）；與燈盞花素高劑量組相比，燈盞花素高劑量+ML385組仔鼠腦組織中NLPR3、caspase-1蛋白表達(dá)升高（P<0.05），Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)降低（P<0.05）。見圖4、表3。

圖4 各組仔鼠腦組織中NLPR3、caspase-1、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)條帶圖 A：對照組；B：模型組；C：燈盞花素低劑量組；D：燈盞花素高劑量組；E：燈盞花素高劑量+ML385組。

表3 各組仔鼠腦組織中NLPR3、caspase-1、Nrf2、HO-1蛋白相對表達(dá)水平比較 （± s，n=10）

表3 各組仔鼠腦組織中NLPR3、caspase-1、Nrf2、HO-1蛋白相對表達(dá)水平比較 （± s，n=10）

注：［NLPR3］核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3；［caspase-1］半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1；［Nrf2］核因子E2相關(guān)因子2；［HO-1］血紅素加氧酶-1。a示與對照組比較，P<0.05；b示與模型組比較，P<0.05；c示與燈盞花素低劑量組比較，P<0.05；d示與燈盞花素高劑量組比較，P<0.05。

images/BZ_96_273_1945_800_2008.pngimages/BZ_96_273_2067_800_2126.pngimages/BZ_96_273_2185_800_2244.pngimages/BZ_96_273_2303_800_2421.pngimages/BZ_96_800_1945_1184_2008.pngimages/BZ_96_800_2067_1184_2126.pngimages/BZ_96_800_2185_1184_2244.pngimages/BZ_96_800_2303_1184_2421.pngimages/BZ_96_1184_1945_1567_2008.pngimages/BZ_96_1184_2067_1567_2126.pngimages/BZ_96_1184_2185_1567_2244.pngimages/BZ_96_1184_2303_1567_2421.pngimages/BZ_96_1567_1945_1923_2008.pngimages/BZ_96_1567_2067_1923_2126.pngimages/BZ_96_1567_2185_1923_2244.pngimages/BZ_96_1567_2303_1923_2421.png對照組燈盞花素低劑量組燈盞花素高劑量+ML385組0.19±0.04 0.58±0.07b 0.86±0.09d 0.11±0.02 0.47±0.07b 0.81±0.10d 0.90±0.16 0.53±0.09b 0.36±0.06d HO-1 1.01±0.22 0.24±0.04a 0.57±0.08b 0.96±0.16b,c 0.29±0.05d 77.414<0.001

3 討論

宮內(nèi)炎癥會(huì)導(dǎo)致早產(chǎn)兒腦損傷，不及時(shí)治療可遺留運(yùn)動(dòng)、智力、精神等方面的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，采取積極有效措施減輕因早產(chǎn)導(dǎo)致的腦損傷可減少小兒傷殘的發(fā)生，有益于優(yōu)生優(yōu)育的實(shí)行［11-12］。小膠質(zhì)細(xì)胞激活引起的細(xì)胞焦亡是神經(jīng)炎癥導(dǎo)致腦損傷的主要病理基礎(chǔ)，NLRP3炎癥小體激活是其中的關(guān)鍵事件，減輕NLRP3誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞焦亡，可減輕炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的腦神經(jīng)損傷［13］，IBA-1是小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物，檢測NLRP3和IBA-1的共表達(dá)情況可評測小膠質(zhì)細(xì)胞激活引發(fā)的細(xì)胞焦亡水平［13-14］。本研究于妊娠第16天、第17天向孕鼠腹腔內(nèi)注射350 μg/kg脂多糖構(gòu)建宮內(nèi)炎癥致早產(chǎn)大鼠模型，結(jié)果顯示脂多糖可增強(qiáng)促炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-8及IL-1β表達(dá)，引發(fā)孕鼠宮內(nèi)炎癥及子宮、胎盤組織損傷，最終導(dǎo)致仔鼠腦組織產(chǎn)生病理損傷，造成仔鼠存活數(shù)和體重降低，揭示宮內(nèi)炎癥可造成孕鼠早產(chǎn)及仔鼠腦損傷。早產(chǎn)仔鼠腦皮質(zhì)IBA-1和NLRP3共表達(dá)增強(qiáng)，腦組織中NLPR3、caspase-1蛋白表達(dá)水平升高，表明宮內(nèi)炎癥可導(dǎo)致仔鼠腦部小膠質(zhì)細(xì)胞焦亡。

宮內(nèi)感染能觸發(fā)母嬰炎癥，并可誘導(dǎo)仔鼠神經(jīng)系統(tǒng)炎癥，造成早產(chǎn)大鼠髓鞘發(fā)育不良、神經(jīng)元減少等腦室周圍白質(zhì)損傷［15］?？刂撇p輕宮內(nèi)炎癥是防治早產(chǎn)小鼠腦損傷的有效手段［16］。燈盞花素是具有顯著抗炎作用的總黃酮類活性物質(zhì)，臨床中常用其注射液治療顱腦損傷、腦梗死等神經(jīng)系統(tǒng)疾病，燈盞花素聯(lián)合吡拉西坦可有效降低血清炎癥因子，改善中型顱腦損傷患者神經(jīng)功能［17］，還可聯(lián)合阿加曲班減輕急性腦梗死患者神經(jīng)功能缺損［18］，抑制腹腔鏡全子宮切除術(shù)患者圍術(shù)期炎癥及應(yīng)激反應(yīng)［7］，本研究以燈盞花素處理孕鼠和仔鼠，可降低仔鼠腦組織中IL-6、IL-8、IL-1β水平及NLPR3、caspase-1蛋白表達(dá)，升高仔鼠存活數(shù)和體重，減弱仔鼠腦皮質(zhì)IBA-1和NLRP3共表達(dá)，并減輕孕鼠子宮、胎盤組織及仔鼠腦組織病理損傷，表明燈盞花素可下調(diào)促炎因子表達(dá)，抑制孕鼠宮內(nèi)及仔鼠腦組織炎癥發(fā)生，減輕仔鼠腦組織病理損傷及小膠質(zhì)細(xì)胞焦亡，促使仔鼠發(fā)育，改善孕鼠早產(chǎn)現(xiàn)象，最終對早產(chǎn)大鼠發(fā)揮腦保護(hù)作用。

Nrf2可通過調(diào)控活性氧自由基和炎性因子生成介導(dǎo)腦部神經(jīng)炎癥，激活Nrf2信號(hào)可顯著抑制活性氧介導(dǎo)的炎癥和神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，減輕缺血性卒中后腦損傷［19］，還可促進(jìn)抗氧化反應(yīng)，下調(diào)促炎細(xì)胞因子表達(dá)，通過抗氧化和抗炎作用減輕氧自由基介導(dǎo)的早產(chǎn)兒腦損傷，對發(fā)育中大腦發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［20］。另有研究顯示燈盞花素可通過上調(diào)Nrf2通路減輕液壓沖擊所致腦部炎性損傷［8］，因而推測激活Nrf2信號(hào)可能是燈盞花素抑制宮內(nèi)炎癥所致早產(chǎn)腦損傷大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞焦亡的作用機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，燈盞花素可提高宮內(nèi)炎癥致早產(chǎn)大鼠腦組織中Nrf2及HO-1蛋白表達(dá)，且高劑量燈盞花素作用更強(qiáng)，表明Nrf2信號(hào)參與燈盞花素對宮內(nèi)炎癥致早產(chǎn)大鼠腦損傷的保護(hù)作用。以燈盞花素高劑量和ML385聯(lián)合處理孕鼠和仔鼠，相比燈盞花素高劑量單獨(dú)處理，可降低仔鼠存活數(shù)和體重、仔鼠腦組織中Nrf2及HO-1蛋白表達(dá)水平，升高仔鼠腦組織中IL-6、IL-8、IL-1β水平及NLPR3、caspase-1蛋白表達(dá)水平，并增強(qiáng)仔鼠腦皮質(zhì)IBA-1和NLRP3共表達(dá)，加重孕鼠子宮、胎盤組織及仔鼠腦組織病理損傷，表明ML385可減弱燈盞花素的抗炎作用，降低其對宮內(nèi)炎癥致早產(chǎn)大鼠腦組織炎癥反應(yīng)和小膠質(zhì)細(xì)胞焦亡的抑制作用，最終逆轉(zhuǎn)燈盞花素的腦保護(hù)作用，揭示燈盞花素抑制宮內(nèi)炎癥所致早產(chǎn)腦損傷大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞焦亡是通過激活Nrf2信號(hào)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究表明燈盞花素可通過激活Nrf2信號(hào)而減輕宮內(nèi)炎癥，促使胎鼠存活，并抑制早產(chǎn)大鼠腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞焦亡和炎癥反應(yīng)，緩解腦損傷，促使Nrf2信號(hào)通路傳導(dǎo)是其作用機(jī)制之一，本研究為宮內(nèi)炎癥致早產(chǎn)兒腦損傷的防治藥物選擇提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新思路。