基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析黃芪-附子治療慢性心力衰竭的作用機(jī)制

李俊輝，李?lèi)?，朱靈妍，姚成增

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 200021；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010；3.上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院，上海 200031

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是多種原因引起心臟功能或結(jié)構(gòu)異常，使心臟泵血量減少，不能滿足組織器官代謝需求的臨床綜合征[1]。CHF是大多數(shù)心血管疾病的終末階段，患病率和致死率逐年升高，給社會(huì)帶來(lái)極大負(fù)擔(dān)[2]。西醫(yī)常用利尿劑、強(qiáng)心劑和β受體阻滯劑等改善CHF癥狀，但長(zhǎng)期服藥會(huì)出現(xiàn)不同程度的不良反應(yīng)，整體療效及安全性仍有待提高。中醫(yī)藥治療CHF療效確切、不良反應(yīng)少，可明顯改善患者癥狀，提高生活質(zhì)量。中醫(yī)認(rèn)為，CHF病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，治療應(yīng)以溫補(bǔ)陽(yáng)氣為主，兼活血、利水、行氣[3]，臨床多用黃芪-附子等溫補(bǔ)陽(yáng)氣藥對(duì)為代表的方劑，療效滿意。但目前鮮有關(guān)于黃芪-附子治療CHF機(jī)制的論述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析黃芪-附子治療CHF的潛在作用機(jī)制，以期為臨床治療CHF提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 黃芪-附子活性成分篩選及靶點(diǎn)獲取

在TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）[4]數(shù)據(jù)庫(kù)以“huangqi”“fuzi”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲取黃芪-附子活性成分，以口服生物利用度（OB）≥30%、類(lèi)藥性（DL）≥0.18為條件進(jìn)一步篩選有效成分。通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)有效成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，并導(dǎo)入U(xiǎn)niProt（https://sparql.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶點(diǎn)名稱(chēng)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.2 疾病靶點(diǎn)及交集靶點(diǎn)獲取

在PharmGKB（https://www.pharmgkb.org/）[5]、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）、GeneCards（https://www.genecards.org/）[6]、OMIM（https://omim.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)以“chronic heart failure”為關(guān)鍵詞檢索CHF相關(guān)靶點(diǎn)，將疾病靶點(diǎn)與藥物靶點(diǎn)取交集，交集靶點(diǎn)即黃芪-附子治療CHF的潛在靶點(diǎn)。

1.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING（https://www.string-db.org/）[7]平臺(tái)，繪制蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件進(jìn)一步簡(jiǎn)化篩選，獲取核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.4 GO功能和KEGG通路富集分析

利用R語(yǔ)言3.6.3軟件相關(guān)數(shù)據(jù)包對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能和KEGG富集分析，篩選qvalue＜0.05的分析結(jié)果進(jìn)行展示。

2 結(jié)果

2.1 藥物活性成分與靶點(diǎn)

在TCMSP獲取黃芪活性成分20個(gè)，附子活性成分21個(gè)，無(wú)共有成分。進(jìn)一步獲取活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，有19個(gè)活性成分無(wú)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，剩余22個(gè)活性成分（見(jiàn)表1）對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)492個(gè)，去除重復(fù)后得到靶點(diǎn)191個(gè)。將靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù)轉(zhuǎn)化為UniProt ID，通過(guò)Cytoscape3.7.2 軟件構(gòu)建藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（見(jiàn)圖1），節(jié)點(diǎn)越大度值越大，節(jié)點(diǎn)間連線表示相互作用關(guān)系，活性成分平均度值為20.63，按度值由大到小排序，前10位活性成分見(jiàn)表2。

表2 黃芪-附子活性成分（度值前10位）

圖1 黃芪-附子治療CHF藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

表1 黃芪-附子主要活性成分

2.2 疾病靶點(diǎn)及交集靶點(diǎn)

在PharmGKB、TTD、GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)分別得到CHF靶點(diǎn)16、13、10 531、153個(gè)，經(jīng)去重后，共得到CHF相關(guān)靶點(diǎn)10 573個(gè)。利用Excel2016將疾病靶點(diǎn)和藥物靶點(diǎn)取交集，得到交集靶點(diǎn)183個(gè)，Venn圖見(jiàn)圖2。

圖2 黃芪-附子治療CHF靶點(diǎn)Venn圖

2.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

將183個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，建立黃芪-附子治療CHF 靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖3。利用Cytoscape3.7.2軟件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，篩選中介中心性（between centrality）≥19.565、緊密中心性（closeness centrality） ≥0.561、度中心性（degree centrality）≥10.5、特征向量中心性（eigenvector centrality）≥0.136、位置中心性（location centrality）≥4.558、鄰域連通性（neighborhood connectivity）≥5.910的靶點(diǎn)，最終得到由14個(gè)核心靶點(diǎn)、108條邊組成的核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖4。

圖3 黃芪-附子治療CHF靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 黃芪-附子治療CHF核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO功能和KEGG通路富集分析結(jié)果

對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析，得到2 625個(gè)條目，包括生物過(guò)程（BP）2 324 個(gè)、細(xì)胞組分（CC）88 個(gè)，分子功能（MF）213個(gè)，結(jié)果按qvalue從小到大排序，BP、CC、MF前10個(gè)條目見(jiàn)圖5。BP主要涉及細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)（cellular response to chemical stress）、對(duì)藥物的反應(yīng)（response to drug）、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)（response to oxidative stress）等；CC 主要涉及膜筏（membrane raft）、膜微區(qū)（membrane microdomain）、膜區(qū)（membrane region）等；MF主要涉及DNA/RNA轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白受體活性。KEGG通路富集分析篩選前30 條通路，主要包括AGE-RAGE 信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路等，見(jiàn)圖6。

圖5 黃芪-附子治療CHF靶點(diǎn)GO富集分析

圖6 黃芪-附子治療CHF靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，血脂、血糖、血壓異常及吸煙、飲酒、飲食失節(jié)等不良生活習(xí)慣會(huì)影響或加快CHF進(jìn)程，主要從增加心肌收縮力、抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）激活等角度治療。古代文獻(xiàn)有與CHF臨床表現(xiàn)相似的描述，如《素問(wèn)·舉痛論篇》“勞則喘息汗出，外內(nèi)皆越，故氣耗矣”，《金匱要略》“心水者，其身重而少氣，不得臥，煩而躁，其人陰腫”，《靈樞·脹論》“夫心脹者，煩心短氣，臥不安”。CHF可屬中醫(yī)學(xué)“心水”“心脹”等范疇，病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，臨床以氣虛證為主。氣虛無(wú)力推動(dòng)血行而成瘀，故標(biāo)實(shí)多以血瘀居多，治法多以溫陽(yáng)補(bǔ)氣為主[8]，兼以活血。黃芪性溫，歸脾、肺經(jīng)，有補(bǔ)氣升陽(yáng)、行血通滯之功；附子性大熱，歸心、脾、腎經(jīng)，有回陽(yáng)救逆、補(bǔ)火助陽(yáng)之功。二者相須使用則心氣得溫，心陽(yáng)得補(bǔ)，心血得通，氣虛之證得除。史君等[9]對(duì)近20年治療CHF的方劑進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，使用頻率最高的中藥為黃芪，附子排名第4位，可知黃芪-附子廣泛應(yīng)用于CHF治療。

高血壓、高血脂是心力衰竭的危險(xiǎn)因素，心肌重構(gòu)是心力衰竭發(fā)展的必然病理結(jié)果，炎癥反應(yīng)貫穿心力衰竭發(fā)生發(fā)展[10]。本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，在TCMSP篩選黃芪-附子活性成分22個(gè)，在UniPort數(shù)據(jù)庫(kù)獲得相關(guān)靶點(diǎn)191個(gè)，藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中度值較高的有槲皮素、 山柰酚、 7-Omethylisomucronulatol、異鼠李素、芒柄花素、3,9-di-O-methylnissolin、毛蕊異黃酮等。槲皮素、山柰酚、芒柄花素均為黃酮類(lèi)化合物，槲皮素可通過(guò)多途徑預(yù)防或延緩心力衰竭進(jìn)程[11]，通過(guò)抑制血管緊張素Ⅱ降低心肌纖維化和心肌肥大，從而改善心肌重構(gòu)[12-13]。山柰酚可通過(guò)調(diào)節(jié)核因子E2相關(guān)因子、核因子-κB和PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路抑制心肌細(xì)胞凋亡，從而起到保護(hù)心臟作用[14]。芒柄花素可通過(guò)調(diào)節(jié)一氧化氮合成酶、5-羥色胺2A/1B受體和1-adrenoceptors表達(dá)降低血壓[15]，抑制脂肪生成[16]。此外，β-谷甾醇[17]、異鼠李素[18]、脫氧烏頭堿[19]等活性成分也能從多角度發(fā)揮延緩心力衰竭的作用。黃芪-附子治療CHF度值較高的有效成分，如槲皮素、山柰酚、芒柄花素等可關(guān)聯(lián)到PPI網(wǎng)絡(luò)中評(píng)分較高的靶點(diǎn)，并且可富集到與CHF有關(guān)的通路。因此，推測(cè)以槲皮素、山柰酚、芒柄花素為代表的活性成分可能在CHF治療中發(fā)揮重要作用。

核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)中共有14個(gè)靶點(diǎn)，其中AKT1是AKT家族的成員之一，有實(shí)驗(yàn)表明，敲除AKT1基因小鼠，其胎兒死亡率顯著高于對(duì)照組[20]，且存活小鼠心功能低于對(duì)照組。AKT1對(duì)心臟的影響主要表現(xiàn)為抑制心肌細(xì)胞凋亡，Kapustian等[21]研究表明，心力衰竭小鼠p-AKT1呈低表達(dá)，激活A(yù)KT1對(duì)CHF有一定治療作用。MAPK14又稱(chēng)p38α，能被多種刺激因素激活，如白細(xì)胞介素（IL）-1、脂多糖、腫瘤壞死因子（TNF）-α、缺血、缺氧等[22-23]，MAPK14激活會(huì)引起心肌細(xì)胞肥大、凋亡或收縮功能障礙，Kompa等[24]觀察MAPK14抑制劑對(duì)心肌梗死小鼠心肌纖維化、心肌肥大的影響發(fā)現(xiàn)，MAPK14抑制劑能改善心功能，減少心肌梗死后心臟重構(gòu)，防止其進(jìn)一步發(fā)展為心力衰竭。IL-6是一種多功能的細(xì)胞因子，大部分研究表明，其在CHF發(fā)展過(guò)程中表現(xiàn)為促進(jìn)炎癥發(fā)展作用[25-26]。Kobara等[27]研究表明，給予心肌梗死后小鼠IL-6拮抗劑可以抑制炎癥，改善左心室重構(gòu)。KEGG通路富集分析主要集中在PI3K-Akt信號(hào)通路、AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路，其中PI3K-Akt信號(hào)通路富集的基因最多。PI3K-Akt信號(hào)通路是生物體內(nèi)關(guān)鍵的通路，通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)各種信號(hào)蛋白表現(xiàn)其生物學(xué)功能，包括細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)移、分化、代謝、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及囊泡轉(zhuǎn)移等[28-29]，激活PI3Kα可促進(jìn)TNF-β和miR-21表達(dá)，抑制心肌肥大[30]，激活PI3Kγ會(huì)損害心功能，降低心肌收縮力[31]。PI3K-Akt信號(hào)通路的下游靶點(diǎn)mTOR、GSK3、FoxOs 等亦參與心力衰竭的過(guò)程，有研究表明，mTOR抑制劑可抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β誘導(dǎo)的心肌纖維化標(biāo)志物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)[32]，此外，RAGE能抑制PI3K-Akt信號(hào)通路，增加心肌細(xì)胞自噬，抑制RAGE對(duì)心肌細(xì)胞有保護(hù)作用[33]。由此推測(cè)，黃芪-附子治療CHF可能與調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡、改善心室重構(gòu)有關(guān)，可能是以AKT1為靶點(diǎn)調(diào)控PI3KAkt信號(hào)通路改善心功能。

綜上所述，黃芪-附子可能通過(guò)槲皮素、山柰酚、芒柄花素等活性成分，作用于AKT1、MAPK14等靶點(diǎn)，直接或間接調(diào)控PI3K-Akt、AGE-RAGE等多條信號(hào)通路，干預(yù)CHF的各個(gè)過(guò)程。體現(xiàn)了黃芪-附子通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療CHF的特點(diǎn)。