不同病理類型闌尾炎兒童患者的腸道菌群多樣性分析

劉園園 努爾買買提 王亞勇 周京濤

1新疆醫(yī)科大學(xué)第七附屬醫(yī)院（烏魯木齊 830028）；2新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院（烏魯木齊 830028）

闌尾炎發(fā)生是由闌尾管腔阻塞、細(xì)菌入侵、闌尾畸形等因素綜合造成的，可發(fā)生在任何年齡。根據(jù)臨床過(guò)程可分為4 種病理類型：急性單純性闌尾炎、急性化膿性闌尾炎、壞疽性及穿孔性闌尾炎、闌尾周圍膿腫［1］。主要病因是由病原菌感染、淋巴濾泡過(guò)度增生及闌尾腔內(nèi)糞石造成的梗阻而產(chǎn)生的炎癥。有研究［2］表明急性闌尾炎發(fā)病首要因素為病原菌感染，厭氧菌多樣性的增加和芽孢桿菌、核芽孢桿菌和疣狀芽孢桿菌的易位與急性闌尾炎的進(jìn)展有關(guān)。認(rèn)識(shí)感染灶部位的菌群多樣性就顯得尤為重要。目前臨床多采用闌尾腔內(nèi)分泌物進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)來(lái)指導(dǎo)臨床抗菌藥物的合理使用。但是傳統(tǒng)培養(yǎng)方法難以模擬菌群自然生長(zhǎng)條件，檢出率低且嚴(yán)重低估了感染性疾病病原菌的種類和數(shù)量，病原學(xué)資料是否全面地反映了感染灶菌群情況值得進(jìn)一步探討，因其結(jié)果會(huì)影響到感染性疾病病原菌的診斷和治療方案的制定［3-4］。本研究采用16S rRNA 基因測(cè)序測(cè)定兒童急性闌尾炎手術(shù)患者闌尾腔分泌物，通過(guò)對(duì)兒童闌尾炎患者不同病理類型闌尾內(nèi)容物菌群的多樣性分析，為闌尾炎發(fā)病機(jī)制的組織病原學(xué)研究提供新的思路，為臨床制定個(gè)性化治療提供理論支持，從而達(dá)到避免抗菌藥物不合理使用引發(fā)菌群失調(diào)的目的。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2020年6-12月期間收治的闌尾炎兒童患者12 例，其中男3 例，女9 例。年齡5 ～16 歲，中位年齡11.5 歲。12 例患者中有5 例少數(shù)民族患者。手術(shù)組織病理證實(shí)為單純性闌尾炎6 例和化膿性闌尾炎6 例。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）闌尾炎經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診，均為兒童患者；（2）術(shù)前均使用頭孢西丁鈉一組抗感染治療；（3）無(wú)其他腸道疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)前使用不同種抗菌藥物治療患者；（2）合并其他疾病者；（3）資料不全者。本研究通過(guò)本院倫理委員會(huì)關(guān)于開展臨床研究審批（審批號(hào)：20221101-LW01），就整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程各項(xiàng)細(xì)節(jié)及以后的數(shù)據(jù)公布等事宜征得志愿者監(jiān)護(hù)人同意，并簽署知情同意書。

1.2 方法 由外科醫(yī)生手術(shù)切除闌尾，在無(wú)菌環(huán)境下用生理鹽水擦拭表面滲出物，清洗切口。沿縱軸解剖闌尾組織，用無(wú)菌棉簽擦拭收集闌尾腔內(nèi)的所有內(nèi)容物，并置于無(wú)菌收集管中。收集完畢后迅速放入無(wú)菌冰盒，轉(zhuǎn)運(yùn)至-80 ℃冰箱中，備后續(xù)分析。

1.2.1 內(nèi)容物DNA 提取 使用MN NucleoSpin 96 SoiDNA 提取試劑盒提取患者闌尾腔內(nèi)容物微生物組全基因組DNA 提取，并測(cè)定DNA 的數(shù)量和質(zhì)量。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增 16S rRNA 基因 測(cè) 序V3-V4 高變區(qū)擴(kuò)增，上游引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和下游引物806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。Solexa PCR（20 μL 體系）：目的區(qū)域PCR 純化產(chǎn)物5 μL，上、下游引物各2.5 μL，高保真酶10 μL。PCR 反應(yīng)條件：98 ℃30 s；98 ℃10 s，65 ℃30 s，72 ℃30 s，共10個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min。定量后使用Illumina Novaseq 6000 平臺(tái)測(cè)序。在相似性97%的水平上對(duì)序列進(jìn)行聚類，以測(cè)序所有序列數(shù)的0.005%作為閾值過(guò)濾OTU。對(duì)可執(zhí)行OTUs 聚類進(jìn)行菌群豐度、構(gòu)成、群落結(jié)構(gòu)、多樣性等分析，測(cè)序由北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 序列數(shù)據(jù)分析應(yīng)用QIIME2 和R 語(yǔ)言包。應(yīng)用QIIME2 計(jì)算OTUs 水平Alpha 多樣性指數(shù)，比較樣本間的OTU 豐度和均勻度。通過(guò)R 語(yǔ)言中的vegan 包對(duì)不同樣本的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行Beta 多樣性分析，使用python繪圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，針對(duì)細(xì)菌豐度的比較，采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 樣本病原學(xué)檢查 手術(shù)組織病理證實(shí)為單純性闌尾炎6 例和化膿性闌尾炎6 例，均在術(shù)中取闌尾內(nèi)容物進(jìn)行病原學(xué)檢查，包括需氧菌培養(yǎng)和厭氧菌培養(yǎng)。單純性闌尾炎組僅有2 例培養(yǎng)出具體病原菌，1 例為大腸埃希菌，1 例為肺炎克雷伯菌；化膿性闌尾炎組培養(yǎng)出2 例大腸埃希菌。12 例樣本僅檢出4 例，檢出率為33.33%。

2.2 樣本測(cè)序數(shù)據(jù) 下機(jī)數(shù)據(jù)tags、有效數(shù)據(jù)及OTUs 滿足測(cè)試要求，使用Usearch 軟件在97.0%的相似度水平下進(jìn)行聚類，共獲得816 個(gè)OTUs，其中單純性闌尾炎組808 個(gè)，化膿性闌尾炎組659 個(gè)，兩組共有的OTUs 641 個(gè)，單純性闌尾炎特有的OTUs 有167 個(gè)，化膿性闌尾炎特有的OTUs 有18 個(gè)。

2.3 Alpha 多樣性分析 單純性闌尾炎組與化膿性闌尾炎組的Chao1、Shannon、Simpson 指數(shù)比較，單純性闌尾炎組Chao1、Shannon、Simpson 指數(shù)分別為（608.67±95.49）、（5.92±0.76）、（0.95±0.02），化膿性闌尾炎組分別為（475.82±45.19）、（4.16±0.67）、（0.88±0.05），兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明兩組在物種豐度和物種多樣性上存在差異（圖1）。

圖1 Alpha 多樣性分析Fig.1 Alpha diversity analysis

2.4 Beta 多樣性分析 采用PERMANOVA/Anosim分析對(duì)樣本進(jìn)行Beta 多樣性分析，Beta 距離越大表示分組差異越大，R 值越接近1 表示組間差異越大于組內(nèi)差異，P ＜0.05 時(shí)說(shuō)明檢驗(yàn)的可信度高；兩組樣本測(cè)得R=0.344，P=0.02，樣本間差異明顯，組間差異大于組內(nèi)差異，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。

圖2 PERMANOVA/Anosim 分析Fig.2 PERMANOVA/Anosim analysis

2.5 組間菌群結(jié)構(gòu)差異性分析 從分析進(jìn)化圖可看出兩組闌尾炎患者的闌尾組織內(nèi)容物在門、綱水平無(wú)明顯差異，在目、科、屬、種水平存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖3）。在科水平Lachnospiraceae（毛螺菌科）、Ruminococcaceae（瘤胃菌科）、Fusobacteriaceae（梭桿菌科）三個(gè)存在差異，單純性闌尾炎組Lachnospiraceae、Ruminococcaceae 居多，化膿性闌尾炎組Fusobacteriaceae 居多。兩組在需氧菌、厭氧菌、兼性厭氧菌的構(gòu)成上存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具有各自獨(dú)立的科。需氧菌中單純性闌尾炎組具有Lactobacillaceae（乳桿菌科），而化膿性闌尾炎組具有Alcaligenaceae（產(chǎn)堿桿菌科）和Campylobacteraceae（彎曲菌科螺桿菌科）。厭氧菌的構(gòu)成上，化膿性闌尾炎具有Fusobacteriaceae、Peptostreptococcaceae（消化鏈球菌科）、Porphyromonadaceae（紫單胞菌科）、Veillonellaceae（韋榮氏球菌科）、Tissierellaceae（組織菌科）。兼性厭氧菌的構(gòu)成上，單純性闌尾炎具有Pasteurellaceae（巴斯德氏菌科）、Streptococcaceae（鏈球菌科），見圖4。在屬水平Faecalibacterium（糞桿菌屬）、Agathobacter（直腸真桿菌屬）、Bilophila（嗜膽菌屬）三個(gè)存在顯著性差異，單純性闌尾炎組Faecalibacterium、Agathobacter居多，化膿性闌尾炎組Bilophila 居多。兩組在需氧菌、厭氧菌、兼性厭氧菌的構(gòu)成上存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具有各自獨(dú)立的屬。需氧菌中單純性闌尾炎組具有Lactobacillus（乳酸桿菌屬），而化膿性闌尾炎組具有Campylobacter（彎曲桿菌屬）和Sutterella（薩特氏菌屬）。厭氧菌的構(gòu)成上，單純性闌尾炎具有Ruminococcaceae、Blautia（布勞特氏菌屬）、Faecalibacte-rium，化膿性闌尾炎具有Fusobacterium、Parvimonas（微單胞菌屬）、Peptostreptococcus（消化鏈球菌屬）、Porphyromonas（卟啉菌屬）、Ruminococcus（瘤胃球菌屬）。兼性厭氧菌的構(gòu)成上，單純性闌尾炎具有Klebsiella（克雷伯菌屬），化膿性闌尾炎具有Bulleidia（布雷德菌屬）、Streptococcus（鏈球菌屬），圖5。

圖3 LEfSe 分析進(jìn)化分枝圖Fig.3 LEfSe analysis diagram of the structural difference

圖4 科水平組間差異Fig.4 Differences between groups at the family level

圖5 屬水平組間差異Fig.5 Differences between groups at the genus level

3 討論

兒童急性闌尾炎約占小兒外科急性腹痛的20%～30%，臨床上多認(rèn)為其病因?yàn)榧S便殘?jiān)蛄馨徒M織增生阻塞闌尾管腔，導(dǎo)致管腔內(nèi)高壓力，損害黏膜的完整性，進(jìn)而導(dǎo)致感染并最終發(fā)生急性闌尾炎［5-6］。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一些使用這些技術(shù)在闌尾炎領(lǐng)域的研究認(rèn)為闌尾炎的發(fā)生與原發(fā)性感染相關(guān)［7-9］。高通量測(cè)序技術(shù)目前已廣泛用于腸道微生態(tài)研究，其中16S rRNA 測(cè)序方法可通過(guò)提取樣本中編碼細(xì)菌16S 核糖體基因的核酸序列，根據(jù)特定引物擴(kuò)增該基因可變區(qū)序列，然后根據(jù)測(cè)序和數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)進(jìn)而了解樣本中細(xì)菌種類、豐度、差異性和多樣性［9］。這就彌補(bǔ)了傳統(tǒng)病原學(xué)培養(yǎng)低檢出率的不足，對(duì)探討闌尾炎的發(fā)病機(jī)制以及個(gè)性化治療具有指導(dǎo)意義［10-12］。

本研究采用16S rRNA 基因測(cè)序測(cè)定兒童急性闌尾炎手術(shù)患者闌尾腔分泌物，結(jié)果顯示，在屬水平菌落組成占總菌落50%的菌群中，發(fā)現(xiàn)單純性闌尾炎闌尾內(nèi)容物中菌屬主要有Bacteroides（擬桿菌屬）、Faecalibacterium、Prevotella（普雷沃菌屬）、Agathobacter、Akkermansia（艾克曼菌屬）、Fusobacterium、Comamonas（單胞菌屬）、Parabacteroides（副擬桿菌屬）?；撔躁@尾炎內(nèi)容物中菌屬主要有Fusobacterium、Bacteroides、Porphyromonas（卟啉 菌屬）、Escherichia_Shigella（埃希菌屬-志賀菌屬），兩組優(yōu)勢(shì)菌群均為G-厭氧菌，單純性闌尾炎組的闌尾內(nèi)容物中益生菌比例高，而化膿性闌尾炎組中條件致病菌比例更高。THE 等［13］在對(duì)兒童闌尾標(biāo)本的研究中發(fā)現(xiàn)，闌尾炎患者的闌尾組織中Fuso-bacteriaceae的豐度增加，它的增加也與闌尾炎的嚴(yán)重程度有關(guān)。本研究標(biāo)本采集自闌尾內(nèi)容物，得出的結(jié)論與其一致，在化膿性闌尾炎組Fusobacteriaceae豐度更高，F(xiàn)aecalibacterium、Agathobacter在單純性闌尾炎組具有更高的豐度，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Faecalibacterium、Agathobacter這兩類菌屬可通過(guò)產(chǎn)生短鏈脂肪酸保護(hù)腸道黏膜屏障，F(xiàn)aecalibacterium中的普拉梭菌是具有抗炎作用的下一代益生菌［14-16］。厭氧菌組中單純性闌尾炎患者具有高豐度的Blautia，該菌同樣具有產(chǎn)生短鏈脂肪酸的能力，起到保護(hù)腸道黏膜降低人體炎癥水平的作用［17］。這些細(xì)菌豐度的差異或可用來(lái)解釋單純性闌尾炎患者感染指標(biāo)改變不明顯以及鏡下病理局限于黏膜或黏膜下層的原因。Bilophila 在化膿性闌尾炎組存在顯著差異，該菌目前被認(rèn)為與腸道屏障更高的滲透性和對(duì)感染和結(jié)腸癌更高的易感性相關(guān)，在闌尾炎中可作為病原菌［18-19］。這與化膿性闌尾炎患者感染指標(biāo)明顯的升高以及鏡下炎性病變向肌層及漿膜層擴(kuò)延的表現(xiàn)呈現(xiàn)一致性。Faecalibacterium、Agathobacter、Bilophila在兩組別間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示該細(xì)菌在不同病理類型的闌尾炎中可能存在特殊的臨床意義，為闌尾炎的發(fā)病機(jī)制研究增加理論支持。有益菌豐度減少可能會(huì)導(dǎo)致患者腸道正常生理功能受損，這提示腸道微生態(tài)制劑或糞菌移植或許對(duì)闌尾炎的治療有所幫助，為保守治療闌尾炎提供個(gè)體化治療的新的方向。

日常病原學(xué)培養(yǎng)檢出率高的大腸埃希菌是腸桿菌科埃希菌屬細(xì)菌，屬兼性厭氧菌［20-21］。通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，埃希菌屬在單純性闌尾炎組豐度為（0.02±0.02），化膿性闌尾炎組為（0.08±0.12），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.42），且在菌群構(gòu)成比例中排名第九位，不是闌尾內(nèi)容物中的優(yōu)勢(shì)菌群。Bacteroides 在兩組樣本中均有較高豐度，雖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.82），但單純性闌尾炎組（0.15±0.05）的豐度高于化膿性闌尾炎組（0.12±0.05）。劉枘岢等［22］的研究發(fā)現(xiàn)2 型糖尿病患者腸道菌群中Bacteroides 的豐度顯著下降。朱萬(wàn)英等［23］發(fā)現(xiàn)肥胖兒童群體腸道中Bacteroides的多樣性及相似性降低。由此可見，Bacteroides參與人體腸道中許多重要的代謝活動(dòng)，其豐度的平衡對(duì)人體健康有著重要的意義。有研究［24］表明抗感染藥物對(duì)腸道菌群的多樣性、結(jié)構(gòu)組成和代謝功能等產(chǎn)生影響。在抗菌藥物的抗性基因傳播中，參與水平轉(zhuǎn)移的菌種以Bacteroides為主［25］。本研究發(fā)現(xiàn)化膿性闌尾炎組Bacteroides豐度降低，而臨床闌尾炎抗感染治療方案常規(guī)覆蓋厭氧菌，這可能加劇Bacteroides豐度的下降，提示在闌尾炎抗感染治療中常規(guī)覆蓋厭氧菌的方案是否必要值得思考。對(duì)于保守治療闌尾炎的患者，Bacteroides對(duì)抗菌藥物抗性基因的傳播也需更加關(guān)注。

本研究為單中心研究，存在以下不足：（1）例數(shù)較少，患者性別、民族、飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣均可造成菌群差異。（2）缺少正常闌尾內(nèi)容物作對(duì)照。后期將增加樣本量，并納入健康對(duì)照人群，通過(guò)對(duì)比正常闌尾內(nèi)容物，進(jìn)一步探索闌尾內(nèi)容物菌群的構(gòu)成差異。（3）在本研究中，不能回答闌尾炎中糞體的存在和微生物群之間的潛在相關(guān)性，這是未來(lái)研究的關(guān)注點(diǎn)。（4）本研究的一個(gè)局限性是使用了預(yù)防性抗生素?？股氐挠幸孀饔靡驯粡V泛接受，由于它們只在手術(shù)前很短的時(shí)間內(nèi)使用，認(rèn)為抗生素的使用并不能解釋研究發(fā)現(xiàn)的差異。（5）目前臨床治療方案常規(guī)覆蓋抗厭氧菌活性，闌尾炎中Bacteroides低豐度的表達(dá)，對(duì)目前的治療方案提出了挑戰(zhàn)，后期針對(duì)不同類型抗菌藥物對(duì)腸道菌群的影響展開深入研究，為從調(diào)整菌群平衡的角度開展闌尾炎的治療提供支持，從而達(dá)到個(gè)體化治療的目的。