長鏈非編碼RNA X失活特異轉(zhuǎn)錄物調(diào)控miR-340-5p對卵巢癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

姜平 郭哲 梁殿迅 楊喜科 付小玲 李和麗

河南省南陽市中心醫(yī)院（河南南陽 473000）

卵巢癌在全球女性癌癥患者中病死率最高［1-2］。由于缺乏有效和準確的診斷標志物，發(fā)現(xiàn)時往往已到晚期［2］。復發(fā)和轉(zhuǎn)移是導致卵巢癌患者死亡的重要原因，有研究發(fā)現(xiàn)癌細胞轉(zhuǎn)移和侵襲與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）密切相關(guān)［3］。近年來，越來越多的長鏈非編碼RNA（long non-cording RNAs，lncRNA）被發(fā)現(xiàn)通過調(diào)節(jié)微小RNA（MicroRNAs，miRNAs）在卵巢癌中作為癌基因和抑癌因子［4-5］。lncRNA X 失活特異轉(zhuǎn)錄物（X-inactive specific transcript，XIST）能夠促進食管癌、結(jié)直腸癌發(fā)展［6-7］。下調(diào)lncRNA XIST 可抑制卵巢癌細胞的惡性生物學行為［8］。因此，lncRNA XIST 是一種潛在的卵巢癌診斷標志物，但其調(diào)控機制尚不清楚。生物信息學分析顯示miR-340-5p 可能是lncRNA XIST 的下游靶點，其在結(jié)腸癌、乳腺癌等多種人類惡性腫瘤中調(diào)控腫瘤生長和進展［9-10］。然而，在卵巢癌中，lncRNA XIST 和miR-340-5p 之間的潛在調(diào)控軸尚不清楚。本研究將探討lncRNA XIST 通過EMT 影響卵巢癌細胞遷移、侵襲的作用及其機制，為卵巢癌提供潛在的預后標志物。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器 lncRNA XIST 干擾載體（silncRNA XIST）質(zhì)粒及其陰性對照（si-NC）、miR-340-5p 模擬物或抑制劑（miR-340-5p mimics 或miR-340-5p inhibitor）及其陰性對照（NC mimics 或NC inhibitor）、RT-qPCR 引物購自上海生工生物技術(shù)公司；Lipofectamine 2000 購自英國Invitrogen 公司；TaqManTMmicroRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和高容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；qPCR 試劑盒購自日本Takara 公司；雙熒光素酶檢測試劑盒、Matrigel、放射免疫沉淀試劑盒購自北京索萊寶科學技術(shù)公司；BCA 蛋白檢測試劑盒購自廣州捷倍斯生物科技有限公司；兔抗E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、GADPH 抗體及羊抗兔抗IgG 購自Abcam 公司；FITC 標記的山羊抗兔抗體購自美國Santa Cruz 生物公司；4，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）購自美國Sigma-Aldrich 公司。RT qPCR 儀購自ABI 公司；Glomax 20/20 熒光檢測器購自Promega 公司；XDS 800D 倒置顯微鏡購自上海凱肯光學儀器有限公司。

1.2 組織樣本 收集2018-2021年本院28 例卵巢癌手術(shù)患者組織標本。正常組織來自于卵巢楔形活檢或附件切除術(shù)的纖維狀瘤或子宮腺肌癥。卵巢切除后，取下生殖上皮并進一步分析。本研究經(jīng)本醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均簽署書面知情同意書。

1.3 細胞培養(yǎng)、分組與轉(zhuǎn)染 購自BNCC 公司的人正常卵巢上皮細胞IOSE80 和人卵巢癌細胞系ES-2、CoC1、SK-OV-3 和A2780 在添加10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，維持在5% CO2、37 ℃、飽和濕度條件下。

實驗分為Control 組（不轉(zhuǎn)染）、si-NC 組（轉(zhuǎn)染si-NC）、si-lncRNA XIST 組（轉(zhuǎn)染si-lncRNA XIST）、si-lncRNA XIST+NC inhibitor 組（轉(zhuǎn)染si-lncRNA XIST 和NC inhibitor）、si-lncRNA XIST+miR-340-5p inhibitor 組（轉(zhuǎn)染si-lncRNA XIST 和miR-340-5p inhibitor）。第3 代的A2780 細胞接種到24 孔板（2×106個/孔），然后培養(yǎng)至單層細胞。當細胞融合達到75%時，去除培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染細胞。在轉(zhuǎn)染前1 d，指數(shù)期生長的細胞被播種到6 孔細胞培養(yǎng)板中。孵育12 h后，使用Lipofectamine 2000進行細胞轉(zhuǎn)染。

1.4 RT-qPCR 檢測lncRNA XIST 和miR-340-5p表達水平 使用TRIzol 收集卵巢癌組織、細胞系及轉(zhuǎn)染48 h 后的各組A2780 細胞的總RNA。采用TaqManTMmicroRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和高容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。以GAPDH 和U6 為內(nèi)參，用qPCR 試劑盒配置PCR 反應(yīng)體系（25 μL）。將PCR 反應(yīng)液置于RT-qPCR 儀上進行PCR 反應(yīng)。最后，使用2-ΔΔCT方法進行數(shù)據(jù)分析。PCR 引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.5 雙熒光素酶實驗證實lncRNA XIST 和miR-340-5p 的調(diào)控關(guān)系 利用在線網(wǎng)站（http：//starbase.sysu.edu.cn/index.php）分析lncRNA XIST和miR-340-5p 之間的靶向關(guān)系。基于二者的結(jié)合序列，分別設(shè)計目標和突變序列，并將合成后的片段克隆到psiCHECK 2 載體中，進而獲得野生型/突變型（WT/MUT-lncRNA XIST）載體質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒與miR-340-5p mimics 或NC mimics 共轉(zhuǎn)染至A2780細胞，記為NC mimics+WT-lncRNA XIST 組、miR-340-5p mimics+WT-lncRNA XIST 組、NC mimics+MUT-lncRNA XIST 組、miR-340-5p mimics+MUT-lncRNA XIST 組。48 h 后，按照雙熒光素酶檢測試劑盒的說明檢測熒光素酶活性的變化。用Glomax 20/20 熒光檢測器記錄這些變化，將si-NC、si-lncRNA XIST、pcDNA、pc-lncRNA XIST 分別轉(zhuǎn)染至A2780 細胞，記為si-NC 組、si-lncRNA XIST 組、pcDNA 組、pc-lncRNA XIST 組，48 h 后收集細胞，根據(jù)1.4 的方法檢測各細胞中miR-340-5p 的表達。

1.6 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 將各組A2780細胞制備成細胞懸液，以細胞密度為1 × 105個細胞/孔接種于6 孔板中。當細胞融合達到90%時，用200 μL 的無菌針尖在平板每孔底部做4 個標記。除去原培養(yǎng)基后，每孔補充2 mL 含10%血清的培養(yǎng)基并孵育。分別于劃痕后0 h 和24 h 倒置顯微鏡下拍照，至少測量5 個劃痕點的間距，取平均值。各組劃痕愈合率=（0 ～ 24 h）劃痕面積/0 h劃痕面積×100%。

1.7 Transwell 法評估細胞侵襲能力 用Matrigel（1∶8）在24 孔板上覆蓋Transwell 室底膜的上室。在上室中加入200 μL 的細胞懸液（1×105個/mL），在下室中加入含20%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基600 μL，在37 ℃、5% CO2條件下孵育24 h。將上室表面非侵襲細胞擦拭干凈，剩余細胞用4%多聚甲醛固定15 min，0.5%結(jié)晶紫溶液染色15 min。倒置顯微鏡下，選擇5 個視野拍照。

1.8 Western blot 分析EMT 標志蛋白水平 轉(zhuǎn)染48 h后，提取A2780細胞總蛋白，然后用BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度。用10%SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜后用含5%牛血清白蛋白的Tween-20 溶液的Tris-緩沖鹽水阻斷膜。隨后，用稀釋的E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 多克隆抗體和GADPH在4 ℃孵育膜過夜。次日，用羊抗兔IgG 抗體在室溫下孵膜培養(yǎng)。通過電化學發(fā)光觀察條帶。

1.9 免疫熒光染色觀察EMT 標志蛋白表達 首先，用甲醇固定細胞，用0.1% Triton X-100 滲透細胞膜。接著，細胞與一抗（E-cadherin、N-cadherin 或Vimentin）在4 ℃孵育過夜。24 h 后，細胞與FITC標記的山羊抗兔抗體孵育2 h。細胞核用DAPI 染色。圖像用倒置顯微鏡拍攝。

1.10 統(tǒng)計學方法 資料均采用正態(tài)分布和方差齊性檢驗進行分析。符合正態(tài)分布的計量資料以平均值±標準差表示。將正常組織與癌組織數(shù)據(jù)進行t檢驗比較。多組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析進行比較。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA XIST、miR-340-5p 在卵巢癌組織和細胞系中的表達水平 與正常組織相比，卵巢癌組織中l(wèi)ncRNA XIST 表達升高，miR-340-5p 表達降低（P<0.05），見圖1A。與IOSE80細胞相比，ES-2、CoC1、SK-OV-3 和A2780 細胞系中l(wèi)ncRNA XIST 表達增高，miR-340-5p 表達降低（P<0.05），見圖1B。由于A2780 細胞中l(wèi)ncRNA XIST、miR-340-5p 表達水平與IOSE80 細胞差異最明顯，故選擇A2780 細胞進行轉(zhuǎn)染實驗。

圖1 lncRNA XIST、miR-340-5p 在卵巢癌組織和細胞系中的表達水平Fig.1 Expression levels of lncRNA XIST and miR-340-5p in ovarian cancer tissues and cell lines

2.2 lncRNA XIST 靶 向下調(diào)miR-340-5p 表達 StarBase 網(wǎng)站預測顯示lncRNA XIST 與miR-340-5p存在互補位點，見圖2A。與NC mimics+WT-lncRNA XIST 組相比，miR-340-5p mimics+WT-lncRNA XIST 組熒光素酶活性降低（P< 0.05），見圖2B。此外，si-lncRNA XIST 組miR-340-5p 水平高于si-NC 組，pc-lncRNA XIST 組miR-340-5p 水平低于pcDNA 組（P<0.05），見圖2C。

圖2 lncRNA XIST 靶向結(jié)合miR-340-5p 并下調(diào)miR-340-5p 表達Fig.2 lncRNA XIST targets miR-340-5p and downregulates miR-340-5p expression

2.3 轉(zhuǎn)染si-lncRNA XIST抑制卵巢癌細胞遷移 與Control 組、si-NC組比較，si-lncRNA XIST 組lncRNA XIST 水平、劃痕愈合率下降（t= 26.497、26.931、56.383、56.040，P<0.05）；與si-lncRNA XIST組、si-lncRNA XIST+NC inhibitor組相比，si-lncRNA XIST+miR-340-5p inhibitor 組lncRNA XIST 水平、劃痕愈合率增加（t= 24.325、23.456、48.614、48.190，P<0.05），見圖3。

圖3 轉(zhuǎn)染si-lncRNA XIST 影響卵巢癌細胞遷移（×50）Fig.3 Effect of si-lncrNA XIST transfection on migration of ovarian cancer cells

2.4 轉(zhuǎn)染si-lncRNA XIST 抑制卵巢癌細胞侵襲 si-lncRNA XIST 組細胞侵襲數(shù)低于Control 組、si-NC 組（t= 33.115、32.526，P< 0.05）；si-lncRNA XIST+miR-340-5p inhibitor 組細胞侵襲數(shù)高于silncRNA XIST 組 和si-lncRNA XIST+NC inhibitor 組（t=26.207、25.425，P<0.05），見圖4。

2.5 轉(zhuǎn)染si-lncRNA XIST抑制卵巢癌細胞EMT 與Control 組 和si-NC組相比，si-lncRNA XIST 組E-cadherin mRNA 和蛋白表達水平升高，N-cadherin和Vimentin 的mRNA 和蛋白表達水平降低（P<0.05）；與si-lncRNA XIST 組和si-lncRNA XIST+NC inhibitor 組相比，si-lncRNA XIST+miR-340-5p inhibitor 組E-cadherin mRNA 和蛋白表達水平下降，Ncadherin 和Vimentin 的mRNA 和蛋白表達水平增高（P<0.05），見圖4、表7。另外，圖5 顯示，與Control組和si-NC 組比較，si-lncRNA XIST 組E-cadherin 表達增強，N-cadherin 和Vimentin 表達減弱；與si-lncRNA XIST 組 和si-lncRNA XIST+NC inhibitor 組 比較，si-lncRNA XIST+miR-340-5p inhibitor 組E-cadherin 表達減弱，N-cadherin 和Vimentin 表達增強。

圖4 轉(zhuǎn)染si-lncRNA XIST 影響卵巢癌細胞侵襲（×200）Fig.4 Effect of si-lncrNA XIST transfection on ovarian cancer cell invasion

圖5 轉(zhuǎn)染si-lncRNA XIST 影響卵巢癌細胞EMT 標志物表達（×200）Fig.5 Effect of si-lncrNA XIST transfection on EMT marker expression in ovarian cancer cells

3 討論

EMT 是一個復雜的過程，癌細胞表現(xiàn)為極性喪失和細胞表型從上皮細胞到間充質(zhì)細胞形態(tài)的改變，被認為是血管生成上調(diào)、細胞運動性增強和細胞外基質(zhì)侵襲等典型腫瘤表型的先決條件，也被認為是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的重要步驟［11］。通過EMT，轉(zhuǎn)化的上皮細胞獲得間充質(zhì)特征，具有間充質(zhì)表型的單個癌細胞可以穿過內(nèi)皮屏障進入血液和淋巴循環(huán)［12］。這一過程的關(guān)鍵分子特征是上皮細胞標記物E-cadherin 的下調(diào)和間質(zhì)細胞標記物N-cadherin、Vimentin 的上調(diào)［13-14］。

許多研究［15-17］表明，lncRNA可以通過參與EMT進程影響腫瘤的侵襲和遷移。lncRNA XIST 是一種17 kb 的lncRNA，通過調(diào)控哺乳動物X 染色體失活，獲得XX 女性和XY 男性之間的基因劑量等效值［18］。相關(guān)文獻顯示，lncRNA XIST 能促進卵巢癌、宮頸癌的進展以及膠質(zhì)瘤的EMT［19-21］。本研究結(jié)果顯示，lncRNA XIST 在卵巢癌組織和4 種卵巢癌細胞系中均上調(diào)表達，這與JIANG 等［8］的發(fā)現(xiàn)一致，說明lncRNA XIST 在卵巢癌中發(fā)揮致癌作用。另外，以lncRNA XIST 表達最高的A2780細胞為轉(zhuǎn)染對象，通過轉(zhuǎn)染si-lncRNA XIST 下調(diào)lncRNA XIST 表達后，A2780 細胞的遷移和侵襲能力被抑制，此外，干擾lncRNA XIST 可顯著提高E-cadherin 表達，降低N-cadherin 和Vimentin 表達，與既往研究一致，提示干擾lncRNA XIST 表達能夠抑制卵巢癌細胞的EMT 進程，進而抑制細胞遷移和侵襲。

以往研究［22］表明，lncRNA XIST 對卵巢癌的影響通過調(diào)控miRNA實現(xiàn)，其下游靶點包括miR-335、miR-106a［23］等。本研究根據(jù)StarBase 預測網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)miR-340-5p 是lncRNA XIST 的一個可能靶點。miR-340-5p 可能是結(jié)直腸癌的一種新的預后生物標志物和治療靶點，其通過直接靶向結(jié)直腸癌中的ANXA3 發(fā)揮其抑瘤功能［24］。miR-340-5p 在甲狀腺癌中高表達，其過表達可顯著促進甲狀腺癌增殖［25］。然而，miR-340-5p 在卵巢癌中的作用尚不清楚。本研究在卵巢癌組織和細胞系中檢測到顯著降低的miR-340-5p 水平，說明miR-340-5p 可能在卵巢癌中發(fā)揮抑癌功能，這與miR-340-5p 在甲狀腺癌中的作用相反，提示miR-340-5p 的表達趨勢與癌細胞的類型相關(guān)。熒光素酶實驗進一步證實了lncRNA XIST 與miR-340-5p 之間的直接調(diào)控關(guān)系。抑制miR-340-5p 表達在體外逆轉(zhuǎn)了干擾lncRNA XIST 對卵巢癌遷移、侵襲及EMT 的作用。這說明lncRNA XIST 通過抑制miR-340-5p 在卵巢癌中發(fā)揮致癌作用。

綜上所述，lncRNA XIST 通過靶向下調(diào)miR-340-5p 促進卵巢癌細胞EMT 和遷移、侵襲，有助于探索卵巢癌新的治療策略。然而，本研究還存在一些不足之處。第一，卵巢癌的臨床樣本量較少；第二，未進行體內(nèi)實驗。基于這兩點，未來將通過擴大臨床組織樣本量，并采用荷瘤裸鼠實驗，深入研究lncRNA XIST、miR-340-5p 在卵巢癌中的功能和作用機制。