應(yīng)激誘導(dǎo)磷蛋白1可能通過(guò)調(diào)節(jié)Cx43表達(dá)影響低溫缺血再灌注后心室肌電傳導(dǎo)

安麗 高鴻 劉艷秋 鐘毅 曹瑩 易菁 劉旸佟睿 潘志軍 王圣釗 吳昊 劉美言

1貴州醫(yī)科大學(xué)麻醉學(xué)院（貴陽(yáng) 550004）；2貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科（貴陽(yáng) 550004）；3貴州醫(yī)科大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心（貴陽(yáng) 550025）；4貴陽(yáng)市第四人民醫(yī)院麻醉科（貴陽(yáng) 550007）

再灌注心律失常（reperfusion arrhythmia，RA）是心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）后較為常見的并發(fā)癥之一［1］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)［2］，低溫缺血再灌注后，RA 的發(fā)生與心肌細(xì)胞間縫隙連接通道的連接蛋白43（connexin 43，Cx43）表達(dá)減少有關(guān)，但Cx43 下調(diào)的機(jī)制尚不明確。文獻(xiàn)報(bào)道大部分在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成的初生肽蛋白，需借助分子伴侶完成折疊與組裝，初生肽蛋白最初與分子伴侶熱休克蛋白40（heat shock protein 40，HSP40）和熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）形成復(fù)合物，通過(guò)應(yīng)激誘導(dǎo)磷蛋白1（stress induced phosphoprotein 1，STIP1）與熱休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）結(jié)合后完成折疊組裝［3］，HSP90 可與Cx43 結(jié)合，發(fā)揮心臟保護(hù)作用［4］，而未折疊或錯(cuò)誤折疊的Cx43 易被泛素化降解［5］。另有研究［6］表明STIP1 在缺氧處理的心肌細(xì)胞中低表達(dá)，而STIP1 基因敲除的小鼠可致胚胎死亡［7］，這表明該分子是必不可少的輔助伴侶。然而，RA 的發(fā)生及心肌細(xì)胞Cx43 蛋白的下調(diào)是否與STIP1 有關(guān)，目前未見相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)建立大鼠Langendroff 離體心臟灌注模型，采用Mapping Lab 矩陣式電生理標(biāo)測(cè)系統(tǒng)及Western blot 和免疫組化檢測(cè)STIP1、Cx43 蛋白表達(dá)和分布，探究STIP1 通過(guò)調(diào)節(jié)Cx43 表達(dá)影響低溫缺血再灌注后心室肌電傳導(dǎo)的機(jī)制，為尋求防治RA 的新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型制備 本研究已獲貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（審核批號(hào)：NO.2200996）。選擇體質(zhì)量250 ～ 350 g，健康清潔級(jí)2～3月齡雄性SD 大鼠16 只，腹腔注射3%肝素3 125 U/kg 進(jìn)行抗凝10 min 處理后，再腹腔注射1%的戊巴比妥鈉0.4 mL/100 g 完成麻醉，待麻醉生效之后，開胸迅速取出心臟，并置于4 ℃的K-H 液（mmol/L：NaCl 118、CaCl21.26、KCl 4.5、MgSO4·7H2O 1.22、KH2PO41.18、C6H12O611.1、NaHCO324.99、pH 值7.4）中，沖洗主動(dòng)脈內(nèi)的殘留血液，顯露并修剪主動(dòng)脈后，固定主動(dòng)脈于IH-SR，844 型Langendorff 灌注裝置（德國(guó)HUGO SACHS ELEKTRONIK-HARVARD APPA RATUS GmbH D-79232 March-Hugstetten）上，主動(dòng)脈插管深度距主動(dòng)脈瓣距離>2 mm，用95%O2-5%CO2預(yù)充K-H 液，設(shè)置灌流恒溫（36.5～37.5 ℃）、恒壓（8.65 kPa）后進(jìn)行逆行非循環(huán)式灌注。Langendroff 離體心臟灌注模型制備成功標(biāo)準(zhǔn)為：在平衡灌注上述K-H 液10 min 內(nèi)離體心臟恢復(fù)正常節(jié)律跳動(dòng)且心率（heart rate，HR）>180 次/min。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 將建立成功的離體心臟模型16個(gè)，通過(guò)數(shù)字表法隨機(jī)分成兩組，每組8 個(gè)。對(duì)照組（C 組）：持續(xù)灌注37 ℃K-H 液120 min；低溫缺血再灌注組（IR組）：持續(xù)灌注37 ℃K-H液30 min后，經(jīng)主動(dòng)脈根部注射4 ℃20 mL/kg Thomas 停跳液（mmol/L：NaCl 110、KCl 16.1、CaCl21.26、NaHCO39.99、MgCl 15.96、pH 值7.8）使心臟停搏后停灌K-H液60 min，心臟在停跳期間，被置于4 ℃K-H 液中，在心臟停灌的30 min 時(shí)，被追加半量4 ℃10 mL/kg Thomas 液經(jīng)主動(dòng)脈根部注射，停跳60 min 結(jié)束后經(jīng)主動(dòng)脈根部再灌注37 ℃K-H 液30 min。

1.3 微電極陣列測(cè)定心室肌前壁電傳導(dǎo) 持續(xù)灌注15 min 后，于左心室前壁放置64 矩陣式電極固定，放置參考電極于主動(dòng)脈根部，隨后將電極導(dǎo)線與Mapping Lab 矩陣式電生理標(biāo)測(cè)系統(tǒng)的信號(hào)輸入線連接，根據(jù)采集的局部場(chǎng)電位調(diào)整矩陣式電極與心臟貼合情況，記錄左心室局部的電傳導(dǎo)情況。分別采集持續(xù)灌注15 min（T0）、持續(xù)灌注30 min（T1）、再灌注15 min 即C 組持續(xù)灌注105 min（T2）、再灌注30 min 即C 組持續(xù)灌注120 min（T3）各時(shí)點(diǎn)的HR、傳導(dǎo)速度（conduction velocity，CV）和電傳導(dǎo)圖。分別記錄并觀察心臟復(fù)跳的時(shí)間和再灌注30 min 內(nèi)心律失常發(fā)生的類型及其持續(xù)時(shí)間，參照文獻(xiàn)［8］行心律失常評(píng)分。再灌注結(jié)束立刻取左心室心肌組織置于液氮凍存，待心肌組織冰凍后轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱保存，另取心肌組織用多聚甲醛溶液（10 g/L）固定后放置于-4 ℃冰箱保存待后續(xù)檢測(cè)。

1.4 Western blot 法檢測(cè)STIP1 和Cx43 的表達(dá)取出-80 ℃冰箱中的心室肌組織，冰上研磨后加入裂解液（RIPA）提取各組心肌組織的總蛋白，通過(guò)BCA 試劑盒來(lái)檢測(cè)各組的總蛋白濃度后定量。在12%的SDS-PAGE 分離膠進(jìn)行電泳后轉(zhuǎn)膜，洗膜后用5%脫脂牛奶封閉2 h，徹底清洗后分別用抗Cx43兔抗大鼠一抗（1∶1 000，Affinity 公司，美國(guó)），抗STIP1 兔抗大鼠一抗（1∶1 000，Affinity 公司，美國(guó)）4 ℃孵育過(guò)夜。第2 天加入標(biāo)記為HRP 的二抗（1∶1 000，北京博奧森生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）后，置于室溫振蕩器中孵育1 h，隨后ECL 顯影并應(yīng)用全自動(dòng)化學(xué)放光成像系統(tǒng)（Tanon-5200 上海天能科技有限公司，中國(guó)）曝光。通過(guò)Image J 圖像軟件分析各組條帶的灰度值，以GAPDH（1∶1 000，Bioword公司，美國(guó)）為內(nèi)參并計(jì)算其相對(duì)的蛋白表達(dá)量。

1.5 免疫組化檢測(cè)Cx43 蛋白分布 取出-4 ℃冰箱中多聚甲醛溶液固定的心室肌組織，用EDTA 脫鈣液脫鈣，乙醇脫水并石蠟包埋后切片，用滅活內(nèi)源性酶將切片放置在體積分?jǐn)?shù)為20%H2O2的蒸餾水中5～10 min，隨后在枸櫞酸鹽緩沖液中浸泡，并用高壓鍋將其加熱沸騰修復(fù)抗原后，滴加5%牛血清白蛋白（BSA）的封閉液置于37 ℃的溫箱15 min，之后滴加稀釋的抗Cx43 的一抗（1∶100，Affinity 公司，美國(guó)），抗STIP1 的一抗（1∶100，Affinity 公司，美國(guó)）置于4 ℃溫箱過(guò)夜，次日滴加辣根過(guò)氧化物酶的二抗IgG1（1∶1 000，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）置于37 ℃的溫箱中20 min 后，滴加免疫組化試劑SABC 染色，隨后用DAB 顯色劑顯色和蘇木精復(fù)染、然后將其脫水后透明并封片。置于全玻片的光學(xué)顯微鏡下（OLYMPUS SLIDEVIEW VS200，儀景通光學(xué)科技上海有限公司）觀察，其中陽(yáng)性為棕黃色染色，陰性為不著色。用Image J 圖像分析軟件分析各著色蛋白的平均光密度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)分布計(jì)量資料用（）表示，組間比較采用單因素方差分析，各時(shí)點(diǎn)組間比較用重復(fù)測(cè)量方差分析，P<0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組心律失常的發(fā)生情況 C 組：持續(xù)灌注期間無(wú)心律失常發(fā)生；IR 組：再灌注時(shí)8 例在30 s內(nèi)均恢復(fù)心跳，發(fā)生心律失常有7 例，心律失常的發(fā)生類型、持續(xù)時(shí)間及心律失常的評(píng)分見表1。

表1 兩組大鼠心律失常及評(píng)分比較Tab.1 Comparison of arrhythmias and scores between two groups of rats ±s

表1 兩組大鼠心律失常及評(píng)分比較Tab.1 Comparison of arrhythmias and scores between two groups of rats ±s

注：IR 組心律失常發(fā)生率為87.5%

組別C 組IR 組例數(shù)8 8復(fù)跳時(shí)間（s）0 26.00±6.14室早（例）0 4室顫（例）0 3心律失常持續(xù)時(shí)間（min）0 8.74±8.63心律失常評(píng)分（分）0 3.13±2.64

2.2 兩組不同時(shí)點(diǎn)HR 及CV 的比較 C 組：各時(shí)點(diǎn)的HR 及CV 未見明顯的差異（P> 0.05），IR 組：T2與T3時(shí)點(diǎn)與T0與T1時(shí)點(diǎn)比較，其HR 及CV 出現(xiàn)明顯減慢（P<0.05），見表2、3。

表2 兩組大鼠不同時(shí)點(diǎn)HR 的比較Tab.2 Comparison of HR between two groupst rats at different times ±s，次/min

表2 兩組大鼠不同時(shí)點(diǎn)HR 的比較Tab.2 Comparison of HR between two groupst rats at different times ±s，次/min

注：與C 組比較，IR 組，T2、T3與T0、T1比較，*P<0.05

組別C 組IR 組P 值例數(shù)8 8 T0 290.4±7.7 302.6±10.9 0.269 T1 302.5±7.9 307.1±9.5 0.193 T2 307.8±7.9 237.0±23.5*0.003 T3 313.4±6.4 278.0±13.9*0.006

表3 兩組大鼠不同時(shí)點(diǎn)CV 的比較Tab.3 Comparison of CV between two groups rats at different times ±s，mm/ms

表3 兩組大鼠不同時(shí)點(diǎn)CV 的比較Tab.3 Comparison of CV between two groups rats at different times ±s，mm/ms

注：與C 組比較，IR 組，T2、T3與T0、T1比較，*P<0.05

組別C 組IR 組P 值例數(shù)8 8 T0 2.2±0.3 2.5±0.4 0.118 T1 2.4±0.2 2.5±0.1 0.281 T2 2.3±0.1 1.7±0.1*0.001 T3 2.9±0.1 1.9±0.1*0.001

2.3 不同時(shí)點(diǎn)左心室肌前壁傳導(dǎo)方向 Mapping Lab 64 矩陣式電生理指標(biāo)測(cè)示可見，C 組：與T0時(shí)點(diǎn)相比，T1、T2、T3時(shí)點(diǎn)傳導(dǎo)方向未見改變。IR 組：與T0時(shí)點(diǎn)相比，T1時(shí)點(diǎn)傳導(dǎo)方向未見明顯改變，T2、T3時(shí)點(diǎn)傳導(dǎo)方向呈發(fā)散改變，見圖1。

圖1 兩組離體心臟不同時(shí)點(diǎn)傳導(dǎo)方向Fig.1 The conduction direction of two groups of isolated hearts at different time points

2.4 Western blot 檢測(cè)STIP1、Cx43 蛋白表達(dá) 與C 組比較，IR 組STIP1、Cx43 蛋白表達(dá)均明顯降低（P<0.05），見圖2。

圖2 兩組大鼠心室肌Cx43、STIP1 蛋白表達(dá)Fig.2 Expression of Cx43 and STIP1 proteins in ventricular muscle of two groups rats

2.5 左心室肌免疫組化檢測(cè)STIP1、Cx43 蛋白分布 免疫化學(xué)分析兩組間心肌組織內(nèi)STIP1 和Cx43 陽(yáng)性著色細(xì)胞的平均光密度。呈棕黃色顆粒狀為陽(yáng)性著色，藍(lán)色表示心肌細(xì)胞的細(xì)胞核。與C 組比較，IR 組STIP1、Cx43 蛋白的陽(yáng)性分布減少（P<0.05），另Cx43 蛋白的陽(yáng)性分布有從端端轉(zhuǎn)為側(cè)側(cè)的鏈接情況，并呈凌亂排列，黑色箭頭為閏盤處的Cx43，紅色箭頭為Cx43 的側(cè)偏化。見圖3。

圖3 兩組大鼠心室肌免疫組化染色結(jié)果（×200）Fig.3 Results of immunohistochemical staining in ventricular muscle of two groups rats（×200）

3 討論

在體外循環(huán)下實(shí)施心內(nèi)直視手術(shù)過(guò)程中，雖對(duì)心肌進(jìn)行了低溫高鉀停跳液等保護(hù)措施處理，但心臟復(fù)跳時(shí)RA 仍是較常見的并發(fā)癥，使此類手術(shù)的成敗和患者預(yù)后常受到影響［9］。如何改善RA 的發(fā)生，是目前一直研究的熱點(diǎn)。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)［2］：低溫缺血再灌注后，RA 的發(fā)生與Cx43表達(dá)減少有關(guān)，但對(duì)其機(jī)制不清，是否通過(guò)改善心肌缺血再灌注后Cx43 下調(diào)，從而減少RA 的發(fā)生，是本實(shí)驗(yàn)預(yù)探究的問(wèn)題。

位于心肌細(xì)胞閏盤（intercalated disc，ID）的Cx43 是哺乳動(dòng)物心室肌細(xì)胞膜上表達(dá)最豐富一種特殊的通道連接蛋白［10-11］，大量文獻(xiàn)證實(shí)在RA 的發(fā)生發(fā)展中，Cx43 發(fā)揮著重要作用［12］。MAHONEY

等［13］研究報(bào)道，小鼠心肌細(xì)胞中心室CV 下降與Cx43 的表達(dá)下降有關(guān)。JUNG 等［14］研究認(rèn)為，大鼠心臟的Cx43 基因被敲除后，可致心肌細(xì)胞間的電傳導(dǎo)出現(xiàn)障礙，引起惡性心律失常。李偉超等［15］研究認(rèn)為七氟醚可穩(wěn)定心肌細(xì)胞間Cx43 的分布與表達(dá)，減輕RA 的發(fā)生。另有研究［16］表明，初生肽蛋白最初由HSP40 和HSP70 形成的復(fù)合物募集，然后在STIP1 的幫助下轉(zhuǎn)移到HSP90 上完成折疊與組裝，而未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白易被泛素化降解［17］。在真核生物中，HSP90 作為伴侶蛋白與HSP70 一起控制蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)［18］。WEI 等［19］研究發(fā)現(xiàn)異丙腎上腺素可通過(guò)抑HSP70/HSP40 的表達(dá)來(lái)促進(jìn)Cx43 的表達(dá)，從而改善心肌肥厚。RODRIGUEZ-SINOVAS 等［20］發(fā)現(xiàn)HSP90 與Cx43 結(jié)合，通過(guò)TOM20 途徑促進(jìn)Cx43 線粒體易位，發(fā)揮其心臟保護(hù)功能。Cx43 的折疊與組裝也依賴于HSP90［21-22］。STIP1（也稱為HSP70-HSP90 組織蛋白或HOP）作為熱休克蛋白HSP70 和HSP90 之間相互作用的介質(zhì)，參與客戶蛋白形成成熟的結(jié)構(gòu)蛋白［23］，另一項(xiàng)研究［24］表明，STIP1 可防止缺血介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，具有神經(jīng)保護(hù)作用，XIN 等［6］發(fā)現(xiàn)大鼠心肌H9c2 細(xì)胞進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理后，STIP1的表達(dá)明顯降低。故本研究通過(guò)建立大鼠心臟Langendroff 離體灌注模型，采用Mapping Lab 矩陣式電生理標(biāo)測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)了心室肌表面?zhèn)鲗?dǎo)方向及速度，并應(yīng)用Western blot 和免疫組化檢測(cè)STIP1及Cx43 蛋白的表達(dá)和分布情況，以探討低溫缺血再灌注心律失常的發(fā)生及Cx43 表達(dá)下調(diào)是否與STIP1 有關(guān)。

本研究結(jié)果表明，C 組8 只大鼠持續(xù)灌注期間均未發(fā)生心律失常，而IR 組，再灌注期間心律失常發(fā)生率較高，室早和室顫均有發(fā)生，該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)再灌注心律失常是缺血再灌注較為常見的并發(fā)癥，與BERNIKOVA 等［25］研究發(fā)現(xiàn)一致。另IR 組在T2、T3的HR 和心室壁CV 均顯著減慢，并伴隨傳導(dǎo)方向的改變，該結(jié)果電傳導(dǎo)的改變可能因缺血再灌注后心肌損傷引起心肌細(xì)胞間縫隙連接通道的Cx43 減少使縫隙連接電阻增加所致。通過(guò)Western blot 和免疫組化進(jìn)一步驗(yàn)證，IR 組相比C 組，STIP1 及Cx43 蛋白水平的表達(dá)均明顯下調(diào)，另C 組中，可見Cx43 陽(yáng)性著色的棕黃色顆粒在心肌閏盤處呈規(guī)律分布并表達(dá)量較多，而IR 組Cx43蛋白的分布出現(xiàn)從心肌細(xì)胞間的端端轉(zhuǎn)向側(cè)側(cè)連接的偏側(cè)化現(xiàn)象，說(shuō)明低溫缺血再灌注后STIP1低表達(dá)可能影響了Cx43 的表達(dá)和分布，從而影響心肌細(xì)胞間離子通道功能，引起心室肌電傳導(dǎo)的改變。根據(jù)上述結(jié)果推測(cè)低溫全心缺血再灌注后，心室肌電傳導(dǎo)減慢、傳導(dǎo)方向改變，這可能與低溫缺血再灌注后心室肌STIP1 表達(dá)下調(diào)致Cx43表達(dá)減少有關(guān)。本研究結(jié)果為RA 中Cx43 的低表達(dá)提供了一個(gè)可能的解釋，其機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，低溫缺血再灌注心律失常大鼠心室肌Cx43 下調(diào)可能與STIP1 的下調(diào)有關(guān)，STIP1 可能通過(guò)調(diào)節(jié)Cx43 表達(dá)影響低溫缺血再灌注后心室肌電傳導(dǎo)，STIP1 可能是探究再灌注心律失常的新靶點(diǎn)。