LncRNA H19調(diào)控腎小球足細(xì)胞焦亡中作用

汪樂新 劉超 馬天龍 楊安寧，3 熊建團(tuán)，3 吳凱，3焦運(yùn) 白志剛，3 姜怡鄧，3 馬勝超，3 張旭 盧冠軍，

寧夏醫(yī)科大學(xué)1臨床醫(yī)學(xué)院，2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（銀川 750004）；3國家衛(wèi)生健康委員會代謝性心血管疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（銀川 750004）；4寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院泌尿外科（銀川 750004）；5中國人民解放軍總醫(yī)院泌尿外科（北京 100000）

糖尿病腎病是一種嚴(yán)重的微血管病變，早期癥狀不明顯，隱匿性發(fā)展，中晚期發(fā)病率占糖尿病整體的20%～40%，具有較高致死率及致殘率，也是全世界范圍內(nèi)導(dǎo)致終末期腎病、腎功能衰竭的主要病因之一［1］。目前治療糖尿病腎病的手段較依賴血液透析、腹膜透析、腎臟代替治療（腎移植）等，對于糖尿病腎病的治療還沒有特效的方法，且個(gè)體差異度大。因此需要深入對糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入探究，以便尋找更優(yōu)化的治療手段［2］。長非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是一類具有多種層面調(diào)控基因表達(dá)且不具備蛋白編碼功能的RNA，在真核細(xì)胞中l(wèi)ncRNA 調(diào)控基因表達(dá)方式多種多樣，如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子上調(diào)或下調(diào)基因表達(dá)、通過調(diào)控DNA 甲基化或組蛋白修飾、染色質(zhì)重構(gòu)致基因表達(dá)或沉默，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞增殖、焦亡及細(xì)胞周期變化，其異常轉(zhuǎn)錄可引起下游通路和蛋白異常表［3-4］；lncRNA H19是長非編碼RNA 中的一種，據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)研究表明，lncRNA H19 參與多種疾病的進(jìn)展，例如糖尿病和心肌心力衰竭等方面的相關(guān)疾?。?-4］。已有研究證明［5-6］，lncRNA H19 可通過PI3K/AKT 通路抑制HIBD 新生大鼠心肌細(xì)胞凋亡；沉默lncRNA H19 通過靶向上調(diào)調(diào)控miR-214 的表達(dá)，抑制Caspase-1表達(dá)，達(dá)到抑制心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，減輕心力衰竭癥狀。喬家明等［7］研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA H19通過Wnt/β-catenin/OSX 軸調(diào)節(jié)動脈鈣化。徐靜琳等［8］研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)LncRNA H19 能夠靶向調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)，從而對糖尿病腎病足細(xì)胞起到保護(hù)作用。鑒于越來越多學(xué)者關(guān)注到lncRNA H19 異常表達(dá)是影響腎足細(xì)胞活性關(guān)鍵因素之一，而lncRNA H19 異常表達(dá)引起腎足細(xì)胞焦亡損傷罕見報(bào)道［9-10］。本研究以在高糖因素影響下的lncRNA H19 誘導(dǎo)腎足細(xì)胞焦亡為主軸，闡明lncRNA H19 具有調(diào)控腎足細(xì)胞焦亡表達(dá)，為深入研究糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 小鼠腎臟足細(xì)胞株（MPC-5）（中國深圳華拓生物有限公司）；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco 公司）；葡萄糖粉末（中國天津大茂化學(xué)試劑廠），蛋白提取試劑盒（中國上海凱基生物技術(shù)有限公司）；NLRP3、Caspase-1、IL-1β 和β-actin 抗體（英國Abcam 公司）；總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光PCR 試劑盒（中國北京天根公司），LncRNA 上下游引物（中國上海生物生工程公司）合成；蛋白上樣緩沖液（上海碧云天有限公司）；化學(xué)發(fā)光顯色劑（中國新賽美公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（德國Eppendorf 公司）；便攜迷你離心機(jī)購買于Eppendorf 公司；純水儀（美國Millipore 公司）；共聚焦細(xì)胞培養(yǎng)皿（德國賽默飛公司）；激光共聚焦顯微鏡（德國ZEISS 公司）；電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、Model680 全自動酶標(biāo)儀（美國BioRad 公司）；超凈工作臺（中國蘇州安泰有限公司）；CO2培養(yǎng)箱和5415D 型微量臺式離心機(jī)（美國Eppendorf 公司）；制冰機(jī)（美國AF10 SCOTSMAN 公司）。

1.2 細(xì)胞模型建立與分組 用含有10%體積的胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)腎足細(xì)胞（MPC5），置于37 ℃、5%CO2濃度培養(yǎng)箱中，2 d 傳代1 次，取對數(shù)增長期，第3 ～ 4 代用于實(shí)驗(yàn)，取生長狀態(tài)良好，密度適中的MPC5 分別在30 mmol/L HG 干預(yù)足細(xì)胞48 h 因此當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%干預(yù)細(xì)胞，以終濃度為0 mmol/L 為Control 組，以終濃度為30 mmol/L為HG 組，分別干預(yù)48 h 后收集細(xì)胞以便后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 根據(jù)LipofectamineTM2000說明書將Ad-lncRNA H19 及si-lncRNA H19 轉(zhuǎn)染腎足細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染Ad-lncRNA H19 后Western blot 分組為對照組（不做處理）、高糖組、lncRNA H19 過表達(dá)對照+高糖組、lncRNA H19 過表達(dá)+高糖組，轉(zhuǎn)染si-lncRNA H19 后Western blot 分組為對照組（不做處理）、高糖組、lncRNA H19 干擾對照+高糖組、lncRNA H19 干擾+高糖組；轉(zhuǎn)染Ad lncRNA H19 及si lncRNA H19 后qRT-PCR 分組為對照組（不做處理）、lncRNA H19 過表達(dá)陰性對照組、lncRNA H19 過表達(dá)組；對照組（不做處理）、lncRNA H19 干擾對照組和lncRNA H19 干擾組（si-lncRNA H19-1、si-lncRNA H19-2、si-lncRNA H19-3），轉(zhuǎn)染前1 d，在250 μL 的DMEM 培養(yǎng)基中接種2 × 105個(gè)細(xì)胞。A 液：250 μL DMEM 純培養(yǎng)基與Ad-lncRNA H19、si-lncRNA H19 5 μL 混合，吹打2～3 次混勻。B 液：250 μL DMEM純培養(yǎng)基與6 μL LipofectamineTM2000 混合，吹打2～3 次混勻，靜置5 min。A 液加B液混勻吹打2～3次，于室溫下靜置20 min。加入3.5 mL 純培養(yǎng)基混勻。將培養(yǎng)瓶置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，8 h 后更換培養(yǎng)液，HG 干預(yù)48 h 后收細(xì)胞，以便進(jìn)行后續(xù)其他實(shí)驗(yàn)。

1.4 用qRT-PCR 方法檢測lncRNA H19的mRNA的表達(dá) 根據(jù)總RNA 試劑盒說明書提取各組腎足細(xì)胞的總RNA，通過NCBI 查詢lncRNA H19 的ID 序列號，經(jīng)Gene Bank 查詢上下游引物序列，委托上海生物生工公司合成lncRNA H19 上游引物：5'-GAACAGAAGCATTCTAGGCTGG-3'下游引物5'-TTCTAAGTGAATTACGGTGGGTG-3'逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：Prime SCript Buffer For Real Time 2 μL、Oligo Diprimer 1 μL、Random 1 μL、Prime Script RT En-Lyme MlxI 1 μL、H2O 與RNA 總體積13 μL、PCR反應(yīng)體系：TB Green 10 μL、上下游引物各0.8 μL、H2O 6.4 μL、逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL 熒光定量PCR 擴(kuò)增：95 ℃30 s、95 ℃5 s、60 ℃34 s，共45 個(gè)循環(huán)，以小鼠GADPH 內(nèi)參為對照，目的基因擴(kuò)增后，通過目的基因相對量公式分析2-△△Ct，△△Ct =［Ct 目的基因（待測樣本）-Ct GAPDH（待測樣本）］-［Ct 目的基因（校正樣本）-Ct GAPDH（校正樣本）］。

1.5 用Western blot 檢測NLRP3、Caspase-1、IL-1β、Nephrin、Podocin 蛋白表達(dá) 收刮足細(xì)胞，5 000 r/min 離心5 min，棄上清，根據(jù)凱基蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白，用BCA 法測定濃度定量，加50 mL 蛋白上樣緩沖液，金屬浴99 ℃煮沸5 min 變性，經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳90 V 20 min，120 V 30 min 濕轉(zhuǎn)2 h 轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，用稀釋比1∶1 000 的兔抗NLRP3、兔抗Caspase-1、兔抗IL-1β、兔抗Nephrin 及兔抗Podocin抗體4 ℃孵育過夜，PBST 液洗膜3 次，每次10 min，用稀釋比1∶1 000 的兔二抗孵育2 h，PBST 液洗膜3 次，每次10 min，通過Image Lab 圖像分析進(jìn)行掃描采取圖像，以β-action 為內(nèi)參，計(jì)算NLRP3、Caspase-1、IL-1β、Nephrin、Podocin 與β-action 內(nèi)參灰度值的比值做定量分析。

1.6 免疫熒光檢測NLRP3、Caspase-1、IL-1β 蛋白表達(dá) 細(xì)胞傳代時(shí)把生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，鋪到共聚焦小皿中，密度適中，干預(yù)48 h 后收取共聚焦小皿，PBS 液清洗小皿，3 次5 min，4%的多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，PBS 清洗3 次5 min，0.2%TritonX-100 溶液通透20 min，PBS 3 次5 min，山羊血清封閉30 min，1∶100 配置NLRP3、Caspase-1 及IL-1β 抗體，4 ℃過夜孵育，隔天取出小皿，PBS 3 次5 min，加熒光488 標(biāo)記綠光二抗，37 ℃1 h 避光孵育二抗，PBS 3 次5 min 后，加入DAPI 液避光孵育5 min ，PBS 清洗3 次5 min 清，封片淬滅劑封片后用激光共聚焦采取圖像。

1.7 過表達(dá)及干擾lncRNA H19 對高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞焦亡的影響 為進(jìn)一步探討lncRNA H19 對高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞焦亡是否有調(diào)控作用，轉(zhuǎn)染Ad lncRNA H19 及si lncRNA H19 后qRT-PCR 分 組：（1）對照組（不做處理）、lncRNA H19 過表達(dá)陰性對照組、lncRNA H19 過表達(dá)組；（2）對照組（不做處理）、lncRNA H19 干擾陰性對照組和lncRNA H19 干擾組（si-lncRNA H19-1、si-lncRNA H19-2、si-lncRNA H19-3）采用qRT-PCR 檢測lncRNA H19的mRNA表達(dá)水平；轉(zhuǎn)染Ad-lncRNA H19后Western blot 分組；（3）對照組（不做處理）、高糖組、lncRNA H19 過表達(dá)對照+高糖組、lncRNA H19 過表達(dá)+高糖組；轉(zhuǎn)染si-lncRNA H19 后Western blot 分組；（4）對照組（不做處理）、高糖組、lncRNA H19 干擾對照+高糖組及l(fā)ncRNA H19 干擾+高糖組，采用Western blot 方法檢測NLRP3、Caspase-1、及IL-1β蛋白表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用Graphpad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多樣本比較采用單因素方差分析，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HG 誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷與LncRNA H19 表達(dá)情況 為了探討lncRNA H19 在高糖中表達(dá)情況，采用qRT-PCR 方法檢測lncRNA 的mRNA 表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比lncRNA H19 表達(dá)降低，兩組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），結(jié)合相關(guān)實(shí)驗(yàn)分析，在高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷時(shí)lncRNA H19 表達(dá)水平降低，見圖1。

圖1 lncRNA H19 在高糖干預(yù)足細(xì)胞中低表達(dá)Fig.1 LncRNA H19 is low-expressed in high-glycemic intervention podium

2.2 HG誘導(dǎo)腎足細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1及IL-1β 蛋白表達(dá)情況 為了探討高糖致足細(xì)胞焦亡影響，采用Western blot 方法檢測焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、Caspase-1 及IL-1β 表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對照組相比高糖組中NLRP3、Caspase-1 及IL-1β蛋白水平明顯增加，兩組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），提示高糖可誘導(dǎo)足細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞焦亡，見圖2。

圖2 HG 引起焦亡相關(guān)蛋白Caspase-1、NLRP3、IL-1β 表達(dá)水平增加（40×）Fig.2 HG causes increased expression levels of Caspase-1，NLRP3 and IL-1β related proteins（40×）

2.3 HG 誘導(dǎo)腎足細(xì)胞中Nephrin、Podocin 蛋白情況 為了探討高糖干預(yù)刺激下?lián)p傷腎足細(xì)胞，采用Western blot 方法檢測腎足細(xì)胞中結(jié)構(gòu)性相關(guān)蛋白Nephrin、Podocin 表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，高糖組中Nephrin、Podocin 蛋白表達(dá)水平降低，兩組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示高糖可誘導(dǎo)足細(xì)胞發(fā)生損傷。見圖3。

圖3 HG 引起腎足細(xì)胞結(jié)構(gòu)性相關(guān)蛋白Nephrin 及Podocin 表達(dá)降低Fig.3 HG causes decreased expression of Nephrin and Podocin proteins related to nephrocytes

2.4 過表達(dá)及干擾lncRNA H19 對高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞焦亡的影響 結(jié)果提示，轉(zhuǎn)染Ad-lncRNA H19后，與lncRNA H19 過表達(dá)陰性對照組相比lncRNA H19 mRNA 表達(dá)上調(diào)（P< 0.05），與lncRNA H19 過表達(dá)對照+高糖組相比，焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-1β 表達(dá)水平降低（P<0.05）；轉(zhuǎn)染silncRNA H19 后，與lncRNA H19 干擾陰性對照組相比，lncRNA H19 mRNA 表達(dá)下調(diào)（P< 0.05），且silncRNA H19-2 干擾效果最佳，與lncRNA H19 干擾對照+高糖組，焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-1β 表達(dá)水平增高（P< 0.05），提示lncRNA H19具有調(diào)控焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)作用，過表達(dá)lncRNA H19 后降低焦亡相關(guān)蛋白水平表達(dá)保護(hù)腎足細(xì)胞，而干擾lncRNA H19 后細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白水平表達(dá)增高，損傷腎足細(xì)胞，見圖4。

圖4 LncRNA H19 調(diào)控焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-1β 表達(dá)水平Fig.4 LncRNA H19 regulates the expression levels of coke-dead-related proteins NLRP3，Caspase-1，and IL-1β

3 討論

隨著糖尿病的發(fā)病率、致死率逐年增加，而糖尿病腎病是以長期高血糖，慢性腎功能損傷為特征的嚴(yán)重微血管病變，作為糖尿病患者致殘、致死中重要因素之一，其探究糖尿病腎病的致病機(jī)制成為目前研究的熱點(diǎn)［11］。而糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，且其無特效的治療手段，為了尋找更好的治療手段，需更加深入探究糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制［12］。

近年來有關(guān)學(xué)者認(rèn)為，細(xì)胞焦亡作為一種新型的程序性死亡方式，常伴隨慢性炎癥的發(fā)生，細(xì)胞焦亡的炎性因子過度激活可能是糖尿病腎病重要的發(fā)病機(jī)制［13］。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道提示［11］：糖尿病腎病發(fā)展過程中伴隨大量炎性因子的釋放，當(dāng)抑制RHoA/ROCK1/NF-κB 信號通路，有效降低下游炎性因子表達(dá)，而益腎化濕顆粒能夠有效的抑制RHoA/ROCK1/NF-κB 信號通路的過度激活，拮抗糖尿病腎病炎癥損傷，從而改善腎功能，減緩糖尿病腎病進(jìn)程。丁寶珠等［12］研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3-Caspase-1-GSDMD 是細(xì)胞焦亡經(jīng)典通路，在高糖誘導(dǎo)損傷過程中導(dǎo)致胞內(nèi)細(xì)胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）異常增加，增加傳遞信號的模式識別受體，如NOD 樣受體蛋白3（NOD-like erceptor protein 3，NLRP3）炎癥小體激活，引起下游凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）表達(dá)增加并活化半胱氨酸蛋白酶-1（caspase-1），切割焦亡效應(yīng)物Gasdermin D（GSDMD）穿透細(xì)胞膜形成孔道，內(nèi)容物釋放導(dǎo)致IL-1β 炎癥因子損傷腎足細(xì)胞［12-13］，而SJTR（腎消解毒通絡(luò)方）可有效阻斷NLRP3-Caspase-1-GSDMD經(jīng)典途徑激活，抑制細(xì)胞焦亡發(fā)生。毛彥穩(wěn)等［13］發(fā)現(xiàn)，NEDD4L（泛素連接酶）與Caspase-11 蛋白結(jié)合，在泛素化降解Caspase-11 蛋白表達(dá)活性減輕細(xì)胞焦亡損傷的同時(shí)，又能夠抑制EMT（上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化）以及ECM（細(xì)胞外基質(zhì)）沉積，緩解由細(xì)胞焦亡損傷引起的糖尿病腎病進(jìn)展。左熠等［14］報(bào)道指出，高糖作為一種危險(xiǎn)因素，其可誘導(dǎo)腎足細(xì)胞焦亡、自噬、凋亡、氧化應(yīng)激發(fā)在，且可能與MALAT1/NRF2/miR-200c 信號通路有關(guān)，而恰巧的是，阿托伐他汀作為一種能有效抑制細(xì)胞焦亡，拮抗炎性的藥物通過MALAT1/NRF2/miR-200c 信號通路抑制下游焦亡炎性因子釋放，而本文研究發(fā)現(xiàn)，在高糖模型中腎結(jié)構(gòu)蛋白Nephrin、Podocin 低表達(dá)，而焦亡相關(guān)指標(biāo)NLRP3、Caspase-1 及IL-1β 表達(dá)水平增加，表明焦亡炎癥因子的過度激活是損傷腎足細(xì)胞正常生理功能導(dǎo)致糖尿病腎病的原因之一［15-23］。近年來，越來越多的學(xué)者認(rèn)為，在糖尿病腎病中細(xì)胞焦亡是一個(gè)誘導(dǎo)疾病加重的因素，是研究緩解細(xì)胞焦亡是緩解腎功能損傷的重要環(huán)節(jié)，而藥物可明顯緩解糖尿病腎病的進(jìn)展，如阿托伐他汀、腎消解毒通絡(luò)方、益腎化濕顆粒等，為進(jìn)一步研究糖尿病腎病的相關(guān)發(fā)病機(jī)制及臨床診斷、治療提供方向及基礎(chǔ)［23-26］。張靜等［15］在基因?qū)哟窝芯堪l(fā)現(xiàn)，高糖可誘導(dǎo)足細(xì)胞焦亡、足細(xì)胞自噬及足細(xì)胞凋亡發(fā)生，而miR-29a 可以直接靶向下調(diào)調(diào)控足細(xì)胞凋亡、焦亡并且上調(diào)足細(xì)胞自噬，足細(xì)胞自噬表達(dá)過度激活拮抗足細(xì)胞焦亡、凋亡的炎性損傷，從而保護(hù)腎臟。但是鮮有報(bào)道lncRNA H19 在糖尿病腎病中是否具有調(diào)控細(xì)胞焦亡炎性表達(dá)作用，緩解糖尿病腎病的進(jìn)展。故推測lncRNA H19 在基因?qū)用嫔峡赡芫哂幸欢ㄕ{(diào)控細(xì)胞焦亡的功能，這值得進(jìn)一步深入探討。

據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，lncRNA 是一類長度大于200 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，廣泛參與人體生理調(diào)節(jié)，參與細(xì)胞增殖、分化、焦亡、凋亡等生物學(xué)過程，在調(diào)控疾病發(fā)生發(fā)展均發(fā)揮著重要作用［26］。有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，lncRNA H19 在許多疾病均有調(diào)控功能，且在疾病中扮演的重要角色及其發(fā)病機(jī)制，例如GUO 等［27］發(fā)現(xiàn)，在脊髓缺血在灌注損傷中，lncRNA H19 通過海綿吸附作用鉚釘miR-181a-5p并增加下游靶基因HMGB1（高遷移率族蛋白1）表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄翻譯，加速分泌炎癥因子，促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞焦亡發(fā)生發(fā)展，過表達(dá)lncRNA H19后有效抑制HMGB1 蛋白分泌，緩解神經(jīng)元細(xì)胞焦亡。QU 等［28］發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜缺血在灌注時(shí)lncRNA H19 是I/R 誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞焦亡炎的關(guān)鍵，且lncRNA H19 在視網(wǎng)膜缺血在灌注中呈低表達(dá)，炎性因子NLRP3 呈高表達(dá)，提示在視網(wǎng)膜缺血在灌注損傷中l(wèi)ncRNA H19 與炎癥因子NLRP3 存在負(fù)相關(guān)性，共同加速疾病進(jìn)展發(fā)生［29］。張學(xué)麗等［29］報(bào)道，心肌梗死是威脅中老年人健康主要疾病之一，而lncRNA H19 在MI（急性心肌梗死）中異常表達(dá)，而lncRNA H19 與NGF（分泌神經(jīng)生長因子）表達(dá)具有一定關(guān)聯(lián)性，lncRNA H19 在MI 中呈高表達(dá)，沉默H19 降低NGF 可明顯抑制MI 后的心律失常。不僅如此，在大部分腫瘤進(jìn)展過程中l(wèi)ncRNA H19促進(jìn)癌癥增殖、遷移，例如MA 等［30］發(fā)現(xiàn)，lncRNA H19 在卵巢癌表達(dá)增加，增加卵巢癌的增殖。張學(xué)麗等［31］研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA H19 可促進(jìn)肺癌增殖、遷移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。截至目前報(bào)道當(dāng)中，在其他疾病報(bào)道較多，如心血管疾病等，但在糖尿病腎病進(jìn)展過程中l(wèi)ncRNA H19 調(diào)控細(xì)胞焦亡研究報(bào)道較少［31-32］。目前研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA H19 充當(dāng)明星標(biāo)記，在眾多疾病具有表達(dá)調(diào)控作用，故猜測lncRNA H19 在腎臟中也有一定調(diào)控作用［32-35］。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，lncRNA H19 的表達(dá)水平可作為誘導(dǎo)或緩解腎足細(xì)胞細(xì)胞焦亡的一種調(diào)控標(biāo)志，在高糖細(xì)胞模型中，lncRNA H19 在高血糖損傷腎足細(xì)胞時(shí)表達(dá)降低，與腎足細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白Nephrin、Podocin 表達(dá)呈正相關(guān)性，且又對細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、Caspase-1 及IL-1β 蛋白水平表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性，提示：lncRNA H19 在糖尿病腎病疾病中存在差異表達(dá)，而lncRNA H19 的低表達(dá)可能通過促進(jìn)細(xì)胞焦亡方式損傷腎足細(xì)胞，進(jìn)而加重糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展［36-39］。利用AdRNA 上調(diào)lncRNA H19 表達(dá)后，抑制炎性釋放，NOD 樣受體蛋白3 炎癥小體（NLRP3）激活減少，下游凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白激活減少，導(dǎo)致活化半胱氨酸蛋白酶-1（caspase-1）活性降低，引起IL-1β炎癥因子釋放減少，焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-1β 蛋白水平表達(dá)下降保護(hù)腎足細(xì)胞，利用siRNA 下調(diào)足細(xì)胞系中l(wèi)ncRNA H19 后，促進(jìn)炎性釋放，NOD 樣受體蛋白3 炎癥小體大量激活，激活活化半胱氨酸蛋白酶-1（caspase-1）活性大量增多，炎癥因子大量釋放導(dǎo)致細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、Caspase-1及IL-1β 表達(dá)水平增高，正常細(xì)胞生理功能受到損害，加速糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展［40-42］。實(shí)驗(yàn)結(jié)論也證實(shí)了腎足細(xì)胞損傷是發(fā)生糖尿病腎病的基礎(chǔ)，而lncRNA H19 作為一種具有調(diào)控腎足細(xì)胞焦亡的長非編碼RNA，以NLRP3-Caspase-1-IL-1β 焦亡通路為主軸參與調(diào)控，增加lncRNA H19 表達(dá)有效降低細(xì)胞焦亡炎性因子釋放，降低lncRNA H19 則促進(jìn)細(xì)胞焦亡炎性因子的釋放，lncRNA H19 可調(diào)控細(xì)胞焦亡表達(dá)，同時(shí)作為一種新型預(yù)測糖尿病腎病手段，又為臨床治療糖尿病腎病提供一種潛在的新方法。

綜上所述，lncRNA H19 與糖尿病腎病中生物學(xué)行為調(diào)節(jié)存在密切相關(guān)性［42-43］。且本文首次通過探究lncRNA H19 可調(diào)控細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、Caspase-1 及IL-1β 表達(dá)水平，緩解糖尿病腎病進(jìn)展，為本研究中最大創(chuàng)新點(diǎn)，首次揭示lncRNA H19 可作為糖尿病腎病新型標(biāo)志物，但是考慮本研究條件有限，有一定局限性，無動物模型驗(yàn)證lncRNA H19 調(diào)控腎足細(xì)胞焦亡，且lncRNA H19是否還存在海綿吸附調(diào)控下游miRNA 介導(dǎo)加重糖尿病腎病病情發(fā)展，lncRNA H19 的異常表達(dá)是否還會引起腎足細(xì)胞鐵死亡、胞葬等加重疾病進(jìn)展，這仍需進(jìn)一步通過動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行補(bǔ)充論證深入探討，同時(shí)這也為深入研究lncRNA H19 引起腎足細(xì)胞焦亡提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)［44-46］。