傳統(tǒng)富源酸菜中優(yōu)質(zhì)乳酸菌的篩選及應(yīng)用

黃慧福，寧丹，楊誠睿

（1.曲靖師范學(xué)院生物資源與食品工程學(xué)院，云南 曲靖 655011；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

傳統(tǒng)酸菜是生鮮菜上固有微生物在一定條件下發(fā)酵產(chǎn)生乳酸及各種風(fēng)味物質(zhì)而成[1-2]。乳酸菌群在酸菜的發(fā)酵體系中發(fā)揮主導(dǎo)作用[3]，其發(fā)酵產(chǎn)生的酸、醇、酯等呈味物質(zhì)，賦予了酸菜特有的風(fēng)味及口感[4]；乳酸菌代謝產(chǎn)生的乳酸和細(xì)菌素等物質(zhì)可以抑制發(fā)酵體系中腐敗菌的生長(zhǎng)[5]；酸菜中的乳酸菌及其代謝物還具有助消化、調(diào)節(jié)腸道菌群、降血脂等生理功效[6-7]；酸菜中的乳酸菌還可以降解亞硝酸鹽[8]。但是自然發(fā)酵的酸菜，因?yàn)閰⑴c作用的微生物種類多，缺少性能優(yōu)良的專用乳酸菌酸菜發(fā)酵劑，產(chǎn)品易出現(xiàn)不穩(wěn)定、腐爛率高、亞硝酸鹽含量偏高等問題[9-11]。

富源酸菜是云南省富源縣境內(nèi)特有的一種酸菜，以蘿卜或小油菜為主要原料，添加玉米面和飲用水，經(jīng)發(fā)酵而成的具有地方風(fēng)味的水酸菜，其加工方式與其他地方的酸菜有所不同，產(chǎn)品具有發(fā)酵周期短、酸絲長(zhǎng)、黏稠滑膩和酸度高等特點(diǎn)，可直接食用或作為酸菜豬腳、紅豆酸湯的配料，備受當(dāng)?shù)厝讼矏郏?016年被列入曲靖市非物質(zhì)文化遺產(chǎn)名錄[12]。目前富源酸菜生產(chǎn)仍以自然發(fā)酵為主，也同樣存在自然發(fā)酵酸菜共性的問題，嚴(yán)重制約了富源酸菜推廣和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。相關(guān)研究顯示，直投式乳酸菌發(fā)酵的富源酸菜可以在一定程度上解決以上問題[13]，但是不同區(qū)域的不同菌種和菌株發(fā)酵特性存在顯著差異[14-15]，而乳酸菌性能決定了酸菜的品質(zhì)，尤其在酸菜發(fā)酵中產(chǎn)酸、耐酸耐鹽和降解亞硝酸鹽的能力[16]，所以選擇適合的富源酸菜發(fā)酵菌種很關(guān)鍵。因此，從傳統(tǒng)自然發(fā)酵富源酸菜中篩選本土優(yōu)質(zhì)的乳酸菌菌種，既能保證富源酸菜特殊的風(fēng)味，又能提升富源酸菜的質(zhì)量安全和推動(dòng)其標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。

本研究通過對(duì)云南富源縣境自然發(fā)酵酸菜發(fā)酵液進(jìn)行乳酸菌分離、純化、發(fā)酵性能試驗(yàn)及鑒定，以期獲得適合于富源酸菜標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的菌種，為實(shí)現(xiàn)富源酸菜高品質(zhì)規(guī)模化生產(chǎn)提供菌種資源和研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌源：云南富源縣竹園鎮(zhèn)及老廠鎮(zhèn)自然發(fā)酵的紅蘿卜絲黏酸菜、白蘿卜絲黏酸菜、小油菜黏酸菜。

MRS液體培養(yǎng)基:北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、Qiagen凝膠回收試劑盒、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑和引物：上海生工生物工程股份有限公司；氯化鈉、亞硝酸鈉、碳酸鈣（均為分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

TU1900紫外可見分光光度儀：北京普析通用儀器有限公司；PHS-3C型pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；ME103電子分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；UPT-I-20T超純水機(jī)：上海優(yōu)普實(shí)業(yè)有限公司；TH2-C恒溫?fù)u床：太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；3730XL測(cè)序儀、2720 thermal cycler PCR儀:美國(guó)Applied Biosystems公司；DYCP-31DN DNA電泳槽、DYY-5穩(wěn)壓電泳儀：北京六一儀器廠；FR980凝膠成像儀：上海復(fù)日科技儀器有限公司；5415D高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 方法

參考羅強(qiáng)等[17]的方法，采集樣品6份：選擇發(fā)酵品質(zhì)良好的酸菜，將壇中蘿卜絲或小油菜與汁液充分混勻后，用無菌移液槍將汁液轉(zhuǎn)移至滅菌瓶中，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1 菌株分離及形態(tài)鑒定

參照王鑫宇[18]的方法，采用稀釋涂布平板法，取1mL酸菜汁用0.85%無菌生理鹽水梯度稀釋10-1～10-6制備系列濃度的酸菜汁，混合均勻。依次選擇10-3～10-6的稀釋樣品，分別取1 mL用涂布器涂布于MRS-CaCO3固體培養(yǎng)基，在38℃無氧條件下恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h～72 h，從MRS-CaCO3固體培養(yǎng)基上挑出有明顯溶鈣圈的單菌落，再經(jīng)過3次劃線分離培養(yǎng)；用革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗(yàn)法，將分離后無雜菌的菌株涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，在38℃無氧條件下恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h～36 h，觀察長(zhǎng)出的單菌落形態(tài)，挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗(yàn)，將革蘭氏染色陽性和過氧化氫酶陰性的細(xì)菌在顯微鏡下觀察其菌株形態(tài)特征并記錄。得到的菌株經(jīng)過3次劃線分離，直到菌落鏡檢無雜菌，用MRS液體培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)。同時(shí)接種在MRS斜面培養(yǎng)基上于4℃冰箱保存菌種備用。

1.3.2 菌株發(fā)酵性能測(cè)定

1.3.2.1 乳酸菌產(chǎn)酸速度和產(chǎn)酸量的測(cè)定

將傳代培養(yǎng)后的乳酸菌在MRS液態(tài)培養(yǎng)基中活化至109CFU/mL，以0.2%的接種量轉(zhuǎn)接到MRS液體培養(yǎng)基中，在38℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用pH計(jì)測(cè)量pH值，以空白MRS液體培養(yǎng)基作為對(duì)照。產(chǎn)酸量測(cè)定按照GB 12456—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中總酸的測(cè)定》[19]。

1.3.2.2 乳酸菌降解亞硝酸鹽能力的測(cè)定

將活化的菌株按照2%的接種量接入5 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含有200 μg/mL亞硝酸鈉并且已滅菌，38℃培養(yǎng)24 h，參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.33—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中硝酸鹽與亞硝酸鹽的測(cè)定》[20]測(cè)定亞硝酸鈉含量。計(jì)算菌株的亞硝酸鹽降解率。

1.3.2.3 乳酸菌耐酸的生長(zhǎng)測(cè)定

參照李小艷等[21]的方法，將MRS液體培養(yǎng)基pH值分別調(diào)為 2、3、4、5、6，將經(jīng)過活化的菌株按照 2%的接種量接入上述的MRS液體培養(yǎng)基中，在38℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在600 nm波長(zhǎng)的吸光度（OD600）。

1.3.2.4 乳酸菌耐鹽的生長(zhǎng)測(cè)定

將MRS液體培養(yǎng)基中分別添加NaCl，使其濃度分別為 0.02、0.04、0.06、0.08 mg/mL，將經(jīng)過活化的菌株按照2%的接種量接種上述的MRS液體培養(yǎng)基中，在38℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD600值。

1.3.3 菌株分子生物學(xué)鑒定

參照丁馮玲等[22]的方法，采用16S rDNA序列同源相似性分析做菌種鑒定，測(cè)序引物序列如表1所示。

表1 測(cè)序引物序列Table 1 Sequence of the primer

1.3.4 優(yōu)質(zhì)菌株的應(yīng)用

將篩選出來的優(yōu)質(zhì)菌株進(jìn)行純種發(fā)酵試驗(yàn)，并與自然發(fā)酵的富源酸菜進(jìn)行比較。

富源酸菜純種發(fā)酵的工藝流程：蘿卜清洗、切絲→入缸→倒入玉米面、山泉水的混合物（已滅菌）→接入菌種→密封發(fā)酵→成品。

乳酸菌接種量為蘿卜質(zhì)量的0.2%，在38℃接種，保溫發(fā)酵5 h后移至常溫發(fā)酵7 d。每天測(cè)定酸菜發(fā)酵液的總酸、pH值、亞硝酸鹽含量，并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。請(qǐng)10位專業(yè)人員參照表2進(jìn)行感官評(píng)分，理化檢測(cè)參考文獻(xiàn)[19-20]的方法。

表2 酸菜的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Standards of sensory evaluation of Fuyuan pickle

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)進(jìn)行3次，結(jié)果取平均值。用Excel 2010繪制圖表，用SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離純化

6份酸菜汁樣品中經(jīng)過分離培養(yǎng)、革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗(yàn)，菌落形態(tài)和生物學(xué)鑒定結(jié)果見表3。

表3 乳酸菌菌落形態(tài)及生物學(xué)鑒定Table 3 Colony morphology of the isolated strains and biological identification

根據(jù)《乳酸菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[23]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[24]，6個(gè)樣品中均有4株菌落特征類似的菌株，經(jīng)生物學(xué)初步鑒定均為乳酸菌。

2.2 菌株產(chǎn)酸速度和產(chǎn)酸量的測(cè)定

將N1、N2、N3、N4 4個(gè)菌株以2%接種量接種24 h后的pH值變化如圖1所示。

圖1 菌株接種24 h的pH值變化Fig.1 pH value of the liquid of the pickle fermented with different strains for 24 h

由圖1可知，菌株pH值均下降，空白對(duì)照的pH值為5.95，其中N1菌株pH值最小，為4.01，N3菌株pH值在4個(gè)菌株中最大，為5.03。說明N1菌株產(chǎn)酸速度快。

將N1、N2、N3、N4 4個(gè)菌株以2%接種量接種24 h后的產(chǎn)酸量如圖2所示。

圖2 接種24 h菌株的產(chǎn)酸量Fig.2 Acid production of strains inoculated for 24 h

由圖2可知，其中N1菌株產(chǎn)酸量最大，達(dá)到1.10%，N3菌株產(chǎn)酸量最小，為0.51%。說明N1菌株產(chǎn)酸速度快，產(chǎn)酸量高。

2.3 菌株降解亞硝酸鹽能力的測(cè)定

將N1、N2、N3、N44個(gè)菌株用含有亞硝酸鈉的MRS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，降解亞硝酸效果如圖3所示。

圖3 菌株降解亞硝酸鹽的量Fig.3 Amount of nitrite degraded by strains

由圖3可知，不同種類的乳酸菌降解能力不一樣，其中N1菌株降解效果最好，可以將亞硝酸鹽含量降低到28.18 μg/mL，降解率為85.91%，降解率最大；N3菌株可以將亞硝酸鹽含量降低到31.27 μg/mL，降解率為84.37%，降解率最小。

2.4 菌株耐酸的生長(zhǎng)測(cè)定

菌株接種24 h后的OD600值如圖4。

圖4 菌株耐受pH值的OD600值Fig.4 OD600of strains under different pH

由圖4可知，不同的菌株耐酸程度不同，所有菌株在pH2時(shí)OD600值最小，在pH5時(shí)OD600值最大。pH值低于3.0以下生長(zhǎng)緩慢，其OD600值基本不變；pH值在3.0～5.0之間，菌株生長(zhǎng)迅速；在pH值為5.0～6.0時(shí)，對(duì)菌株生長(zhǎng)影響不大。總體菌株對(duì)強(qiáng)酸的耐受力不強(qiáng)，對(duì)弱酸的耐受力較強(qiáng)。N1菌株在pH3～6之間的MRS液體培養(yǎng)基中OD600值明顯高于其他菌株。

2.5 乳酸菌耐鹽的生長(zhǎng)情況

菌株接種24 h后的OD600值如圖5。

圖5 菌株耐受氯化鈉的OD600值Fig.5 OD600of strains in the presence of NaCl at different concentration

由圖5可知，氯化鈉濃度低于0.04 mg/mL時(shí)，4個(gè)菌株的OD600值隨濃度變化很小，說明菌株均可在低于0.04 mg/mL氯化鈉溶液中很好地生長(zhǎng)；當(dāng)氯化鈉濃度大于0.04 mg/mL時(shí)，OD600值開始減小，之后呈上升趨勢(shì)。但在整個(gè)試驗(yàn)中，4個(gè)菌株的耐鹽性不同，N1菌株生長(zhǎng)受鹽濃度影響不大，其他3個(gè)菌株受鹽濃度的影響較為明顯。

2.6 16S rDNA序列分析

綜合以上發(fā)酵性能試驗(yàn)結(jié)果，選取表現(xiàn)較為優(yōu)異的N1菌種進(jìn)行16S rDNA序列分析，結(jié)果見圖6。

圖6 N1的16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.6 Electrophoretogram of PCR product of 16S rDNA of strain N1

由圖6可知，所制備的PCR產(chǎn)物條帶清晰，片段長(zhǎng)為1493 bp，具有典型的16S rDNA特征，符合測(cè)序要求。

利用NCBI的BLAST軟件，將N1的16S rDNA與GenBank數(shù)據(jù)庫中的16S rDNA基因序列進(jìn)行了比對(duì)，結(jié)果見表4。

表4 N1菌株的16S rDNA序列同源相似性分析Table 4 Homology of 16S rDNA sequence of strain N1

由表4可知，該菌株被鑒定為L(zhǎng)actobacillus（乳桿菌屬），Lactobacillus buchneri（布氏乳桿菌）。

2.7 優(yōu)質(zhì)菌株的應(yīng)用

優(yōu)質(zhì)菌株純種發(fā)酵與自然發(fā)酵7 d內(nèi)pH值、總酸、亞硝酸鹽的變化如圖7～圖9所示。

圖7 發(fā)酵7 d內(nèi)pH值變化Fig.7 Change of pH value within 7 days of fermentation

圖8 發(fā)酵7 d內(nèi)總酸含量變化Fig.8 Change of total acid content within 7 days of fermentation

圖9 發(fā)酵7 d內(nèi)亞硝酸鹽含量變化Fig.9 Change of nitrite content within 7 days of fermentation

添加N1菌株的酸菜與自然發(fā)酵相比，顏色透亮，有光澤，有獨(dú)特的酸菜香味，香氣濃郁且純正，脆度高，質(zhì)量均勻，產(chǎn)酸速度快、產(chǎn)酸量高，亞硝酸鹽含量低，亞硝酸鹽峰值提前，7 d內(nèi)能使亞硝酸鹽達(dá)到安全的水平，比GB 2762—2022《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》中關(guān)于醬腌菜的規(guī)定（20 mg/kg）低[25]。

3 結(jié)論

本研究從傳統(tǒng)自然發(fā)酵法制作的富源酸菜中分離純化后獲得4株乳酸菌；通過產(chǎn)酸、降解亞硝酸鹽、耐鹽、耐酸等發(fā)酵性能篩選，其中N1菌株性能最優(yōu)。N1菌株經(jīng)分子生物學(xué)16S rDNA鑒定為乳桿菌屬（Lactobacillus），布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）。將優(yōu)異菌株N1應(yīng)用于富源酸菜進(jìn)行純種發(fā)酵，與自然發(fā)酵相比，感官評(píng)分更高、pH值更低、總酸含量更多、亞硝酸含量更少，并且亞硝酸峰值提前，說明篩選出的優(yōu)異菌株N1能夠有效縮短發(fā)酵周期，并且提高富源水酸菜的質(zhì)量和安全性，發(fā)酵特性優(yōu)質(zhì)。本研究結(jié)果可為傳統(tǒng)富源酸菜品質(zhì)改良和優(yōu)質(zhì)菌種資源開發(fā)提供參考依據(jù)和技術(shù)支持。