聚丙烯酰胺凝膠Sephacryl在多糖分離純化中的應用進展*

王 雨，孫延平，喬威杰，楊炳友，匡海學

（黑龍江中醫(yī)藥大學 教育部北藥基礎與應用研究重點實驗室黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質基礎研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

多糖廣泛存在于生物體中，具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤、抗病毒、降血糖及免疫調節(jié)等多種藥理活性[1]。多個研究結果表明，多糖分子量與其生物活性密切相關[2]。迄今針對不同分子量段多糖的常用分離純化方法主要有分級醇沉法、超濾分離法和凝膠柱層析法。其中凝膠柱層析法是通用的分離純化多糖方法之一，具有分子篩的性質，多應用于多糖的精細分離[3]。常用的固定相凝膠填料主要有Sephadex葡聚糖凝膠、Sepharose瓊脂糖凝膠和Sephacryl系列聚丙烯酰胺凝膠[4]。與前兩種凝膠稍有不同，Sephacryl系列凝膠可選的型號類型較多，可根據不同多糖樣品的分子量大小分布特點，達到最佳分離效果，同時還具有分離范圍廣，化學穩(wěn)定性高，機械性能好等優(yōu)點[5]。然而，目前針對聚丙烯酰胺凝膠（Sephacryl）在多糖的分離純化中應用方面的系統(tǒng)綜述較少。因此，本文選取Sephacryl凝膠作為研究對象，對其性質特點、使用方法及系列柱層析在活性多糖分離純化中的應用情況進行概述，為多糖研究工作者提供參考。

1 Sephacryl凝膠性質特點

聚丙烯酰胺凝膠（Sephacryl）是一種烯丙基葡聚糖和N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯共聚物，屬于通用型凝膠過濾介質，粒徑大小范圍為25～75μm。凝膠填料pH值保持在3～11范圍內，適合于長時間放置；pH值保持在2～13范圍內，適合于短期內再生、原地清洗等過程，其化學穩(wěn)定性高于其他傳統(tǒng)凝膠?？稍?21°C，pH值為7，30min的條件下進行高壓滅菌。其親水剛性基質可最大限度地減少非特異性吸附，提高回收率，同時增加了基體的剛性，確?？焖倭鲃犹匦院透叻直媛?。

2 Sephacryl凝膠使用方法

2.1 填料裝柱前處理及裝柱

將儲存于20%乙醇溶液中的Sephacryl凝膠放入去離子水內，重復洗滌3次，浸泡過夜。裝柱后使凝膠在柱內自由沉降，平衡液上柱前，須進行脫氣處理?？捎萌鋭颖眉訅鹤屃魉倬S持穩(wěn)定，但需注意壓力不要超過填料最大耐壓。一般平衡層析柱至少5～10個柱體積后再進行上樣。

2.2 樣品前處理及填料儲存

多糖樣品溶液用平衡液進行配制，所有樣品溶液及平衡溶液在上柱使用前應離心或過濾（0.45μm），上樣量不超過柱體積的5%。新購置的Sephacryl凝膠密封儲存在4～25℃的20%乙醇保存溶液中，所處環(huán)境保持通風、干燥、清潔，不能冷凍。用過的凝膠填料儲存在4℃的20%乙醇保存溶液中，保質期一般不超過2年。

3 Sephacryl凝膠在活性多糖分離純化中的應用

根據不同分離范圍Sephacryl凝膠可分為S-100～500系列，結合具體在活性多糖分離純化中的應用實例（見表1），除了多糖還適用于肽類、激素類、蛋白、DNA片段等樣品的分離。

3.1 免疫活性多糖的分離

免疫失調是在一部分誘因，如過度飲酒，過敏源等刺激影響下，引發(fā)許多基因、蛋白質以及細胞的作用，會導致包括免疫系統(tǒng)受損及變態(tài)反應等在內的大量相關疾病的發(fā)生。隨著愈來愈多的多糖被發(fā)現顯示出免疫調節(jié)活性，其免疫作用機理、功效因子也越加清楚和確切[16]。Shi等[8]采用陰離子交換柱層析法和凝膠過濾柱層析法對石耳樣品進行純化，用超純水作為流動相通過DEAE-Cellulose色譜柱得到洗脫組分UP1，UP1再經Sephacryl S-200柱（1.0cm×80cm）進一步分離純化，以0.2mL·min-1為流速繼續(xù)采用超純水洗脫，得到分子量為2.81×105Da的高純度多糖UP1-1。藥理結果表明，UP1-1能呈劑量依賴性地促進RAW 264.7細胞的吞噬活性和NO的產生，具有良好的免疫刺激活性。Zhang等[10]將紅參粗多糖樣品裝入DEAE-52層析柱，用蒸餾水洗脫，得到RGRP-1洗脫組分，采用Sephacryl S-300 HR色譜柱（80cm×1.5cm）進一步純化RGRP-1，得到平均分子量分別為2.13×104Da和1.02×104Da的均一多糖RGRP-1a和RGRP-1b，藥理結果表明，RGRP-1b具有明顯的生物學活性，可通過巨噬細胞活化促進巨噬細胞產生NO、TNF-α、IL-6和IL-12，促進HuH7細胞凋亡，具有很強的免疫調節(jié)活性。Zhang等[15]采用水提梯度醇沉的方法從正紅菇子實體中提取分離得到3種主要沉淀。使用Sephacryl S-500 HR色譜柱，在A KTA純化系統(tǒng)上進一步純化這些乙醇沉淀物以除去共沉淀物，不同組分樣品以2mg·mL-1的濃度進入色譜柱。用PBS緩沖液（pH值7.4，50 mmol·L-1）洗脫，流速為1.3mL·min-1，最終得到Mw分別為2.18×106、3.92×105、9.36×104Da的純化組分，藥理結果表明，其中純化組分WRP-1具有較強的免疫刺激作用。

表1 常用Sephacryl凝膠類型、分離范圍及在活性多糖分離應用中的實例Tab.1 Type and separation range of commonly used Sephacryl gel and its application in the isolation of active polysaccharides

3.2 抗氧化活性多糖的分離

過多的自由基會引起衰老、腫瘤以及其它各類疾病的產生，近20年發(fā)現天然來源的多糖具有顯著抗氧化活性，深受學者追捧[17]。Cheng等[6]以落葉松木屑粗多糖AGD水溶液經Sephacryl S-100 HR凝膠柱（1.6cm×60cm）進行純化，流動相為0.05mol·L-1PBS緩沖液（含0.15mol·L-1NaCl，pH值7.0），流速為0.5mL·min-1，分離得到了分子量為3.7×103Da的AGD2。實驗顯示，AGD2具有羥自由基清除活性，此外，AGD2能更好地促進促炎細胞因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）的分泌。Wu等[9]用DEAE Sephose FF色譜柱分離得到的超純水洗脫組分浙江金線蘭多糖AZP-1，再經Sephacryl S-200 HR凝膠滲透柱（2.6cm×95cm）進一步純化。用去離子水以0.3mL·2min-1的流速洗脫，得到Mw分別為3.41×104Da和4.568×10-3Da的浙江金線蘭均一多糖AZP-1a和AZP-1d，藥理實驗表明，這兩種多糖均對CCl4誘導的肝細胞氧化損傷有保護作用。Teng等[11]經DEAE Sepharose Fast Flow色譜柱洗脫得到藜麥多糖樣品QAP，根據分子量的差異，用Sephacryl S-300 HR色譜柱（2.6cm×100cm）進一步純化，分離得到兩種多糖SQAP-1和SQAP-2，其中SQAP-2抗氧化活性顯著高于SQAP-1。Sun等[1]從駱駝刺內生細菌NX-11中提取粗多糖，用DEAE纖維素分離得到兩個NaCl溶液洗脫組分，在Sephacryl S-500 HR色譜柱（16mm×40cm）上進一步純化，以超純水為洗脫劑，流速為0.2mL·min-1，分別得到平均分子量為1.326×106Da和1.959×106Da的PAPS1和PAPS2，藥理活性表明，均具有較強的抗氧化能力。

3.3 抗骨質疏松活性多糖的分離

骨質疏松癥是最普遍的一種全身性代謝性骨病，其特點是骨量和骨質量的衰退，因骨質疏松引發(fā)的脆性骨折發(fā)病率和死亡率逐年增加[18]。迄今已有大量研究表明，一些多糖可通過平衡骨吸收和骨形成而發(fā)揮抗骨質疏松作用。Zheng等[13]將淫羊藿粗多糖樣品溶液置于DEAE-52纖維素柱，得到蒸餾水洗脫組分CEBP1。CEBP1再經Sephacryl S-400凝膠柱（2.5cm×100cm）用0.1M NaCl以0.5mL·min-1的流速洗脫，得到分子量約為2×104Da的均一多糖EBP，體外藥理實驗表明，EBP呈現對糖皮質激素性骨質疏松癥的體外保護作用。Ye等[7]將駱駝刺粗多糖水溶液裝入DEAE-52纖維素柱，得到0.05M NaCl洗脫組分，再裝入Sephacryl S-100柱（1.6cm×100cm）重復分離洗脫，得到分子量為5.9×103Da的純化均一多糖APP90-2，藥理實驗結果表明，APP90-2可顯著促進MC3T3-E1細胞的增殖、分化和礦化，表明APP90-2具有明顯的成骨活性。

3.4 調節(jié)腸道微生物活性多糖的分離

人體腸道內存在著數量巨大、種類千差萬別的微生物，稱之為腸道菌群。腸道菌群失調，可觸發(fā)和加重各類疾病的發(fā)生。多糖中無法被立刻分解的成分與發(fā)酵所產生的短鏈脂肪酸，繼而調節(jié)腸道菌群的組成，改進腸道生理功能，調控抗腫瘤、抗炎、抗病原微生物等基因表達，從而實現疾病治療目標[19]。Cui等[12]用Sepharose 6B柱分離得到褐藻馬尾藻海帶多糖組分，經Sephacryl S-300 HR柱（2.2cm×100cm）進一步純化，得到分子量為8.4×103Da的均一多糖SHNP，體外發(fā)酵實驗結果表明，腸道中短鏈脂肪酸總量、乙酸、丙酸和正丁酸顯著增加。此外，SHNP刺激腸桿菌科細菌的生長，同時消耗副流感嗜血桿菌和福爾米格芽孢桿菌。這些結果表明，SHNP具有潛在參與調節(jié)腸道微生物的作用。

3.5 α-葡萄糖苷酶抑制活性多糖的分離

通過抑制α-葡萄糖苷酶，減緩淀粉分解的速率，降低和推遲小腸對葡萄糖的吸收，從而降低血糖。目前，相當多一部分多糖也顯示出相關的α-葡萄糖苷酶抑制活性，對于糖尿病糖代謝、病理的改善以及對α-糖苷酶的抑制中發(fā)揮了多種生理作用[20]。Lv等[14]從麥麩中分級醇沉得到兩個粗多糖級分裝入DEAE Cellulose-52陰離子交換柱，用0.1M NaCl溶液洗脫得到的兩個主要組分（W2和A2），再分別用Sephacryl S-400凝膠滲透色譜柱進一步純化，以0.2mL·min-1流速得到分子量分別為1.93×105Da和1.07×105Da的超純水洗脫組分WXA-1和AXA-1。藥理實驗結果表明，AXA-1對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用強于WXA-1，其中AXA-1對α-淀粉酶呈競爭性抑制，對α葡萄糖苷酶呈混合型非競爭性抑制。

4 結論

綜上所述，聚丙烯酰胺凝膠Sephacryl在多糖的分離純化中發(fā)揮著重要作用。除大量應用于多糖類化合物外，Sephacryl還對肽類、激素類、蛋白、DNA片段等也有分離純化的應用。當前研究中，Sephacryl不僅分離范圍廣，還具有多選擇性和化學穩(wěn)定性高等特性。再配備密封柱、加壓泵、自動收集器甚至A KTA純化系統(tǒng)等儀器設備，Sephacryl分離純化系統(tǒng)具備更加完善的自動化機械性能，不僅擴充了其使用領域，還優(yōu)化了純化效果。Sephacryl凝膠系列的廣泛使用為活性多糖的構效關系研究、藥效機制研究提供更加有效可靠的分離純化工藝，對多糖分離純化方法的革新也起到較好的促進作用。