白芥子誘導(dǎo)的雞內(nèi)源性芥子堿降解菌的篩選、鑒定及酶活測定

鄧 卉，余 丹，范景勝，屈 東，鄒成義，李 斌，殷 勤，鄭鈺嘉，倪青松，汪林書

（四川省畜牧科學(xué)研究院，動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川成都 610066）

我國優(yōu)質(zhì)飼料原料高度依賴進口，2020年進口大豆超1億t，在新冠疫情和中美貿(mào)易戰(zhàn)的雙重壓力下，原料價格進一步飛漲。由此，《國務(wù)院辦公廳關(guān)于促進畜牧業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的意見》（國辦發(fā)〔2020〕31號）中明確提出促進菜籽粕等非糧飼料資源高效利用，促進豆粕減量替代。芥子堿作為菜籽粕、白芥子等十字花科類植物原料的重要抗營養(yǎng)因子，極大限制了該類原料在工業(yè)飼料中的應(yīng)用。利用微生物自身分泌的酶降解芥子堿的生物技術(shù)方法是目前最安全、最有效的手段之一，本研究通過白芥子誘導(dǎo)試驗，從雞的盲腸中篩選出一株能有效降解芥子堿的細菌，經(jīng)鑒定為大腸桿菌，并進一步考察了該菌及其功能酶漆酶在不同培養(yǎng)時間對芥子堿的降解效果，為高效利用十字花科類非糧型飼料原料提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基 芥子堿液體培養(yǎng)基，由（NH4）2SO4、NaCl、K2HPO4、MgSO4.7H2O、KCl、FeSO4、芥子堿硫氰酸鹽和蒸餾水組成；伊紅美藍固體培養(yǎng)基；LB液體培養(yǎng)基；芥子堿+LB液體培養(yǎng)基（芥子堿：LB=3：2）。

1.2 菌株篩選與鑒定

1.2.1 動物試驗日糧及采樣 在藏香雞基礎(chǔ)日糧中添加20%白芥子飼喂28 d后，無菌條件下分別采集雞空腸、回腸、盲腸內(nèi)容物存放于無菌生理鹽水中，待分離培養(yǎng)目標菌株。基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平

1.2.2 分離培養(yǎng)目標菌株 將采集的雞空腸、回腸、盲腸內(nèi)容物分別接種于芥子堿+LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)48 h。取芥子堿+LB培養(yǎng)液在伊紅美藍固體培養(yǎng)基上劃線，37℃恒溫培養(yǎng)24 h。挑取伊紅美藍培養(yǎng)基上單個菌落到芥子堿液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)72 h。再取芥子堿培養(yǎng)液在伊紅美藍固體培養(yǎng)基上劃線，37℃恒溫培養(yǎng)36 h。最后挑取伊紅美藍培養(yǎng)基單個菌落到LB液體培養(yǎng)基中，于37℃富集培養(yǎng)12 h，將獲得的純化菌株凍存-20℃冰箱備用。

1.2.3 菌株種屬鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定：采用形態(tài)學(xué)鑒定法觀察伊紅美藍培養(yǎng)基上菌株的培養(yǎng)特征和菌落形態(tài)，并結(jié)合革蘭氏染色法在100×顯微鏡下觀察菌株染色形態(tài)特征。參照《伯杰細菌鑒定手冊》初步鑒定其種屬。

分子生物學(xué)鑒定：提取獲得菌株基因組DNA，以通用引物進行PCR擴增。引物序列為27F：AGTTTGATCMTGGCTCAG；1492R：GGTTACCTTG TTACGACTT。PCR反應(yīng)條件為：98℃3 min；98℃10 s，55℃15 s，72℃10～15 s/kb，39個循環(huán)；72℃5 min。擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分離、檢測，切膠純化后送至北京擎科生物科技有限公司測序，所得16SrDNA基因序列在GenBank里進行序列比對，下載GenBank中同源性較高序列，并利用MEGA-X軟件的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 測定獲得菌株降解芥子堿效果 將獲得菌株接種到芥子堿液體培養(yǎng)基中，空氣搖床37℃培養(yǎng)72 h。從第0 h開始，每隔8 h測定培養(yǎng)液中芥子堿的含量，比較獲得菌株在不同培養(yǎng)時間對芥子堿的降解效果。設(shè)置3個重復(fù)，結(jié)果取平均值。

采用紫外分光光度法測定芥子堿含量：精密稱取芥子堿硫氰酸鹽對照品（含量≥98.0%）37.0 mg，溶于10 mL蒸餾水中制成溶液。分別精密吸取上述溶液3、4、5、6、8、10、15、20μL，用水稀釋至3 mL，搖勻后即得濃度分別為0.0037、0.0049、0.0062、0.0074、0.0099、0.0123、0.0185、0.0247 mg/mL的芥子堿對照品溶液，以蒸餾水為空白對照，在326 nm波長處測定吸光度。以吸光度A為縱坐標，濃度C為橫坐標繪制標準曲線并進行線性回歸分析。取樣品培養(yǎng)液15μL加蒸餾水稀釋至3 mL，搖勻后在326 nm波長下測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算出培養(yǎng)液芥子堿含量。

1.4 測定獲得菌株漆酶活力 以2，2'-連氮基-雙（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）為底物，分別在第8、16、24、32、40、48 h采用可見分光光度計在420 nm下測定培養(yǎng)液漆酶活力。以每毫克蛋白每分鐘氧化1 nmoL底物ABTS所需的酶量為一個酶活力單位（U）。

1.5 統(tǒng)計分析 運用Excel對相關(guān)數(shù)據(jù)繪制回歸曲線、建立回歸方程以及確立復(fù)相關(guān)指數(shù)R2，再采用SPSS 17.0軟件對回歸方程進行方差分析（ANOVA），以P＜0.05作為差異顯著的判斷標準，以P＜0.01作為差異極顯著的判斷標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選 初步篩選結(jié)果顯示，在腸道不同位置取樣會影響目標菌的培養(yǎng)，本試驗條件下，盲腸中培養(yǎng)出的目標菌明顯多于空腸和回腸（表2）。

表2 雞腸道不同取樣位置條件下目標菌的培養(yǎng)情況

選擇篩選數(shù)最多的盲腸段目標菌繼續(xù)培養(yǎng)觀察，發(fā)現(xiàn)上述盲腸中篩選出的9株菌均能夠利用芥子堿作為營養(yǎng)物質(zhì)生長，肉眼觀察其中1株目標菌在芥子堿培養(yǎng)液中渾濁度明顯高于其他8株，并且在伊紅美藍培養(yǎng)基上的生長情況明顯優(yōu)于其他8株，將該菌株命名為SDB2（Sinapine-degrading bacteria 2）。

2.2 SDB2種屬鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 在伊紅美藍培養(yǎng)基上，菌株SDB2長滿整個平板，菌落呈圓形、突起、邊緣規(guī)則的形狀且?guī)в写渚G色金屬光澤，初步判定為典型的大腸桿菌菌落。采用革蘭氏染色法對單菌落染色后在100×顯微鏡下觀察后判定該菌為革蘭氏陰性短桿菌。

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定 由圖1可知，菌株SDB2屬于Escherichia sp，273-c菌株。因此將SDB2菌株鑒定為變形菌門；γ-變形菌綱；腸桿菌目；腸桿菌科；大腸埃希菌。

圖1 基于16S rDNA序列構(gòu)建SDB2菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 SDB2降解芥子堿效果研究 由圖2可知，吸光度A與濃度C建立的線性回歸方程為A=54.1106C+0.0329，復(fù)相關(guān)指數(shù)R2=0.9989。

圖2 芥子堿對照品標準曲線

由表3可知，芥子堿濃度隨培養(yǎng)時間增加，總體上呈降低趨勢，第72 h濃度最低，降低幅度達50%。

表3 SDB2菌株不同培養(yǎng)時間對芥子堿濃度的影響

進一步對芥子堿濃度與培養(yǎng)時間建立回歸方程并做方差分析，結(jié)果如圖3和表4所示。芥子堿濃度與SDB2菌株培養(yǎng)時間存在極顯著的線性回歸關(guān)系（P<0.01），復(fù)相關(guān)指數(shù)R2=0.9368，芥子堿濃度隨培養(yǎng)時間增加而降低。

表4 芥子堿濃度與SDB2菌株培養(yǎng)時間建立回歸方程的方差分析

圖3 芥子堿濃度與SDB2菌株培養(yǎng)時間的線性回歸關(guān)系

2.4 SDB2漆酶活力 分別在第8、16、24、32、40、48 h測定芥子堿培養(yǎng)液的漆酶酶活，結(jié)果由表5可知，SDB2菌株漆酶活力第8 h最高，達7.38 U/mL，之后漆酶活力逐漸降低，第48 h最低。

表5 不同培養(yǎng)時間對SDB2菌株漆酶活力的影響

進一步對漆酶活力與培養(yǎng)時間兩者建立回歸方程并做方差分析，結(jié)果如圖4和表6所示。漆酶活力與培養(yǎng)時間存在極顯著的線性回歸關(guān)系（P<0.01），復(fù)相關(guān)指數(shù)R2=0.9957，漆酶活力隨SDB2菌株培養(yǎng)時間增加而降低。

圖4 SDB2菌株漆酶活力與培養(yǎng)時間的線性回歸關(guān)系

表6 SDB2菌株漆酶活力與培養(yǎng)時間建立回歸方程的方差分析

對漆酶活力與芥子堿濃度兩者建立回歸方程并做方差分析，結(jié)果如圖5和表7所示。漆酶活力與芥子堿濃度存在極顯著的線性回歸關(guān)系（P<0.01），復(fù)相關(guān)指數(shù)R2=0.9630，漆酶活力與芥子堿濃度呈正相關(guān)，芥子堿濃度高，則漆酶活力高，反之芥子堿濃度低，則漆酶活力低。

圖5 漆酶活力與芥子堿濃度的線性回歸關(guān)系

表7 漆酶活力與芥子堿濃度建立回歸方程的方差分析

3 結(jié)論與討論

本研究通過白芥子誘導(dǎo)試驗，從雞盲腸中篩選出一株能有效降解芥子堿的菌株SDB2，鑒定為大腸桿菌。將該菌株接種到芥子堿液體培養(yǎng)基中能有效降解芥子堿。芥子堿濃度與培養(yǎng)時間存在極顯著的線性回歸關(guān)系，芥子堿濃度隨培養(yǎng)時間增加而降低，芥子堿在72 h內(nèi)的降解率可達50%；SDB2功能酶漆酶活力與培養(yǎng)時間存在極顯著的線性回歸關(guān)系，漆酶活力隨培養(yǎng)時間增加而降低；漆酶活力與芥子堿濃度存在極顯著的線性回歸關(guān)系，漆酶活力與芥子堿濃度呈正相關(guān)，芥子堿濃度高，則漆酶活力高，反之芥子堿濃度低，則漆酶活力低。

前人為降低菜籽粕、白芥子等十字花科類植物原料中芥子堿的含量也做了一些嘗試，Lucht（1998）采用化學(xué)法使芥子堿含量降低至檢測限以下，但菜籽粕中賴氨酸的含量下降了20%；Thiyam等（2006）用含水甲醇、乙醇等作為溶劑去提取芥子堿，存在溶劑損耗大、污染環(huán)境等問題，不利于生產(chǎn)應(yīng)用；Mailer等（2009）和Mittasch等（2010）開展了利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)特異性地沉默芥子堿在植物中生物合成代謝，從而降低芥子堿含量的品種選育研究，但至今尚無商品化品種出現(xiàn)，并且此舉會使芥子堿在十字花科類植物所發(fā)揮的生理代謝調(diào)控、提高植物抗病性和改善營養(yǎng)品質(zhì)的重要功能喪失，無法統(tǒng)籌考慮芥子堿在生長植物中的營養(yǎng)功能角色和飼料原料中的抗營養(yǎng)因子角色。

采用生物技術(shù)方法降解芥子堿是目前最先進、最安全的技術(shù)手段之一，其原理是利用微生物自身分泌的功能性生物酶破壞芥子堿的分子結(jié)構(gòu)，從而達到降解芥子堿的目的。芥子堿屬于簡單酚類物質(zhì)，有關(guān)研究報道，多酚氧化酶、酪氨酸酶、阿魏酸酯酶、β-葡萄糖苷酶等能有效降解芥子堿（柯木根等，2007）。Lacki等（1996）發(fā)現(xiàn)，采用白腐真菌分泌的酶（多酚氧化酶為主）在水溶液中可酶解98%以上的芥子堿和芥子酸；鈕琰星（2013）報道，蘑菇中提取的酪氨酸酶是一種一元酚氧化酶，能在30～40℃水解芥子堿，最終分解成苯醌或者其他衍生物，并在反應(yīng)過程中發(fā)現(xiàn)有色物質(zhì)的產(chǎn)生；Qiao等（2002）發(fā)現(xiàn)，阿魏酸酯酶可在50～60℃水解芥子堿，但不能繼續(xù)分解其降解產(chǎn)物芥子酸；周浩宇等（2011）發(fā)現(xiàn)，β-葡萄糖苷酶對芥子堿具有一定的降解作用，降解率達17%。而漆酶作為一種多酚氧化酶，多存在于微生物中，其催化范圍廣，可催化氧化鄰、對苯二酚等多元酚及其衍生物，催化氧化底物類型已達250個，但目前關(guān)于漆酶降解芥子堿的研究鮮見報道。Yu等（2016）發(fā)現(xiàn)，篩選出的芥子堿降解菌YD-1和YD-2的胞外產(chǎn)物含有蛋白酶、淀粉酶和脲酶；余丹等（2020）發(fā)現(xiàn)，篩選出的芥子堿降解菌SDB1具有漆酶、淀粉酶、多酚氧化酶、乙酰膽堿酯酶和脂肪酶的活性，不具有β-葡萄糖苷酶的活性。本研究采用雞盲腸中篩選出的優(yōu)勢大腸桿菌SDB2去降解芥子堿，結(jié)果表明降解效果非常顯著，同時也發(fā)現(xiàn)SDB2對芥子堿的降解與其所含漆酶的活性密切相關(guān)，漆酶活性與芥子堿濃度呈正相關(guān)，提示SDB2以芥子堿為營養(yǎng)物質(zhì)分泌漆酶，芥子堿濃度高呈正營養(yǎng)狀態(tài)時，則漆酶活性高，而隨著漆酶對芥子堿的降解，引起芥子堿濃度降低呈現(xiàn)負營養(yǎng)狀態(tài)，因此漆酶活性降低。余丹等（2020）篩選出的SDB1屬于肺炎克雷伯氏菌屬，該研究表明在培養(yǎng)液中分別添加0.40 g/L和0.80 g/L的芥子堿均可以提高SDB1漆酶活力，而本研究在培養(yǎng)過程中沒有添加芥子堿作為營養(yǎng)補充，結(jié)合此前研究結(jié)果推測此為引起漆酶活力下降的原因，可為后續(xù)研究方法提供參考依據(jù)。

綜上所述，為提高菜籽粕等非糧飼料資源的高效利用，本文采用安全有效的微生物發(fā)酵酶解技術(shù)去降解芥子堿等抗營養(yǎng)因子，在新冠疫情和中美貿(mào)易的雙重壓力下，具有十分重要的意義和廣闊的應(yīng)用前景。