細(xì)胞自噬與豬流行性腹瀉病毒相互作用的研究進(jìn)展

藍(lán)小媛，徐 瑤，張 偉，高 崧，郇長超

（揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009）

1 自噬

細(xì)胞自噬（Autophagy）是一種廣泛存在真核生物中的細(xì)胞內(nèi)降解過程，并在進(jìn)化上高度保守（張林琳等，2021），其中產(chǎn)生自噬體能將長壽的蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)聚集物和受損的細(xì)胞器運(yùn)送到溶酶體進(jìn)行降解和循環(huán)。根據(jù)細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)送到溶酶體的方式，自噬可以分為三種類型：巨自噬、微自噬和伴侶介導(dǎo)的自噬（Yu，2014），而通常說的自噬指的是巨自噬。細(xì)胞自噬的發(fā)生具有復(fù)雜性和動態(tài)性，與環(huán)境相關(guān)并受到嚴(yán)格的調(diào)控反應(yīng)，涉及許多上游信號調(diào)控通路。自噬主要通過磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路進(jìn)行誘導(dǎo)，而其他調(diào)控信號則是直接或間接通過這兩條通路發(fā)揮作用。多種細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的刺激均可以誘導(dǎo)自噬（Miller等，2020），比如營養(yǎng)饑餓、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、病原體相關(guān)分子模式和病毒感染等過程。在病毒生命周期和疾病發(fā)病機(jī)制中病毒與宿主之間的相互作用起著重要作用，而巨自噬/自噬等細(xì)胞途徑被證明對病毒的復(fù)制和成熟是有害或有益的（Miller等，2020）。對機(jī)體是保護(hù)還是損害主要取決于應(yīng)激的性質(zhì)、細(xì)胞的類型和狀態(tài)。自噬在維持細(xì)胞平衡和內(nèi)穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著重要的作用，研究已表明，自噬參與天然免疫應(yīng)答和特異性免疫應(yīng)答（高書峰等，2017），并且證明自噬基因的突變與各種疾病的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)（Yu，2020）。

2 豬流行性腹瀉病毒

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）是冠狀病毒科甲型冠狀病毒屬的一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，可引起新生仔豬發(fā)生急性水樣腹瀉、嘔吐、脫水和高死亡率的高度傳染性疾病 （Jung等，2020），其主要感染豬小腸上皮細(xì)胞（Krishna等，2020）。PEDV的基因組長度約為28 kb，有一個(gè)5'帽和一個(gè)3'聚腺苷化的尾巴，其包含至少7個(gè)開放閱讀框（Kong等，2020；Yu等，2020），其中2/3的基因組包含兩個(gè)重疊的ORF，分別是ORF1a和ORF1b，它們編碼指導(dǎo)基因組復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和病毒多蛋白加工的非結(jié)構(gòu)蛋白，其余的PEDV基因組包含5個(gè)ORF，編碼4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和一個(gè)附屬蛋白（Lin等，2016），結(jié)構(gòu)蛋白包括糖基化刺突（S）、包膜（E）、糖基化膜（M）和RNA結(jié)合核衣殼（N）蛋白（黃宗洋等，2022）。研究表明，S是最大的結(jié)構(gòu)蛋白，其氨基酸的變化會影響PEDV的毒力和致病性，而且S基因突變廣泛，因此常被用作病毒遺傳變異分析的靶基因（Yu等，2020）。N蛋白是病毒顆粒中含量最豐富的蛋白質(zhì)，其為病毒基因組周圍的螺旋核衣殼提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，N蛋白參與病毒的多種生物和免疫活動。M和E蛋白通過組裝形成病毒包膜。

3 自噬與豬流行性腹瀉病毒的相互作用

3.1 豬流行性腹瀉病毒誘導(dǎo)自噬 自噬不僅是一種自我降解的生理細(xì)胞途徑，也是一種保護(hù)宿主細(xì)胞免受病原體感染的防御機(jī)制，當(dāng)病原體入侵機(jī)體，細(xì)胞通過將病原體運(yùn)輸?shù)饺苊阁w進(jìn)行清除。研究發(fā)現(xiàn)PEDV的結(jié)構(gòu)蛋白（S、M、E、N）不足以觸發(fā)自噬，而PEDV的非結(jié)構(gòu)蛋白6（nsp6）和ORF3能夠誘導(dǎo)豬腸上皮細(xì)胞（IPEC-J2）發(fā)生明顯的自噬（Lin等，2020）。因此，nsp6和ORF3是PEDV誘導(dǎo)自噬的兩個(gè)關(guān)鍵因子。

3.1.1 PEDV通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)自噬 錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)積累，觸發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）以恢復(fù)穩(wěn)態(tài)，這種情況被定義為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（黃宗洋等，2022）。許多冠狀病毒科在復(fù)制過程中，會產(chǎn)生大量的病毒跨膜糖蛋白來誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)（Xu等，2013；Minakshi等，2009），Zou等（2019）啟動了多種表達(dá)PEDV的ORF3蛋白的重組質(zhì)粒的構(gòu)建，并發(fā)現(xiàn)ORF3以聚集的方式定位于細(xì)胞質(zhì)中，PEDV的ORF3蛋白也是一種定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的跨膜蛋白。Sun等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，PEDV感染可以誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并通過蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）、肌醇依賴酶（IRE）信號通路激活自噬，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬在機(jī)制上是相互關(guān)聯(lián)的。經(jīng)研究證明ORF3通過上調(diào)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）和激活PERK-真核翻譯起始因子2α（eIF2α）信號通路觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，同時(shí)PEDV的ORF3蛋白可以通過誘導(dǎo)LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化來誘導(dǎo)自噬，相比之下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA可顯著抑制LC3-I/LC3-II的轉(zhuǎn)化，說明PEDV的ORF3蛋白誘導(dǎo)的自噬依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)（Zou等，2019）。同時(shí)累積的活性氧（ROS）在PEDV感染過程中調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的自噬發(fā)揮了重要作用（Surviladze等，2013）。

3.1.2 PEDV通過PI3K/Akt/mTOR誘導(dǎo)自噬PEDV屬于冠狀病毒科甲型冠狀病毒屬，冠狀病毒nsp6是一種完整的膜蛋白，被認(rèn)為參與了雙膜囊泡（DMV）的形成，冠狀病毒nsp6蛋白通過一個(gè)巨大的中間體從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)產(chǎn)生自噬體，并激活自噬（Cottam等，2011），已有研究表明，nsp6也可促進(jìn)PEDV自噬，但nsp6誘導(dǎo)自噬的機(jī)制尚不清楚。研究表明，PI3K/Akt/mTOR信號通路在自噬過程中起著至關(guān)重要的作用（Surviladze等，2013；Saiki等，2011）。Lin等（2016）通過分析nsp6表達(dá)的IPEC-J2細(xì)胞中未磷酸化和磷酸化的mTOR、P70S6激酶（p70S6K）和p53的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，nsp6通過PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導(dǎo)自噬，通過干擾RNA實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了自噬與PEDV復(fù)制的關(guān)系。內(nèi)源性p53基因被特異性沉默，與模擬處理組相比，干擾RNA介導(dǎo)的p53表達(dá)沉默降低了病毒滴度。這些數(shù)據(jù)也證明PEDV觸發(fā)的自噬是通過PI3K/Akt/mTOR信號通路進(jìn)行的 （Cottam等，2011）。

3.2 自噬促進(jìn)豬流行性腹瀉病毒復(fù)制 自噬是一種內(nèi)在的宿主防御機(jī)制，但隨著病毒的進(jìn)化，已經(jīng)發(fā)展出許多機(jī)制來阻止自噬，甚至利用自噬使其有利于自身的發(fā)展，如今自噬被認(rèn)為是病毒復(fù)制的平臺（Guo等，2017）。冠狀病毒科成員的復(fù)制機(jī)制各不相同，例如傳染性支氣管炎病毒能夠誘導(dǎo)自噬，但不需要自噬來進(jìn)行復(fù)制（Maier等，2013）；傳染性胃腸炎病毒感染誘導(dǎo)自噬，自噬負(fù)調(diào)控其復(fù)制（Guo等，2016）。

為了確定自噬與PEDV復(fù)制的關(guān)系，Lin等（2020）使用自噬增強(qiáng)劑和自噬抑制劑來檢測自噬對PEDV復(fù)制的影響。羥基氯喹可以通過阻斷自噬體與溶酶體的融合來抑制自噬，早期用羥氯喹抑制自噬可抑制PEDV感染，雷帕霉素通過抑制mTOR信號通路誘導(dǎo)自噬，而雷帕霉素誘導(dǎo)自噬可使病毒滴度升高。這些結(jié)果表明，自噬增強(qiáng)了PEDV在IPEC-J2細(xì)胞中的復(fù)制（范浩天，2019；Cottam等，2011），因此自噬有助于PEDV復(fù)制。Surviladze等（2013）以自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素（1 μM）和自噬抑制劑3-MA（5 mM）作為對照，應(yīng)用PERK和肌醇依賴酶1（IRE1）抑制劑驗(yàn)證內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的自噬對PEDV復(fù)制的影響，結(jié)果表明PEDV通過PERK和IRE1通路誘導(dǎo)自噬從而促進(jìn)病毒復(fù)制（Surviladze等，2013）。細(xì)胞自噬如何促進(jìn)PEDV復(fù)制的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

4 小結(jié)

自噬是一種必要的細(xì)胞自降解過程，在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和能量平衡發(fā)揮著重要的作用，還與多種疾病的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)。目前對自噬的研究范圍非常廣泛，涉及腫瘤學(xué)、神經(jīng)病學(xué)、心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌、外科、泌尿系和消化系統(tǒng)等。自噬一方面具有抗病毒和抗炎作用，但另一方面它們被病毒進(jìn)化來抑制、逃逸或操縱各自的宿主成分，病毒可能會出于自身優(yōu)勢而觸發(fā)自噬促進(jìn)復(fù)制。PEDV作為一種豬腸道冠狀病毒，具有高度傳染性，給全球養(yǎng)豬場帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前研究證明PEDV主要是通過非結(jié)構(gòu)蛋白nsp6和ORF3誘導(dǎo)自噬，nsp6通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)自噬，ORF3通過PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導(dǎo)自噬，目前關(guān)于自噬與PEDV之間的相互作用機(jī)制研究較少，研究自噬與PEDV感染之間的相互作用，進(jìn)一步了解PEDV的致病機(jī)制，為PEDV的治療和抗病毒藥物的研發(fā)提供新的解決途徑和思路。同樣屬于冠狀病毒科的新型嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2型（SARS-CoV-2），在2019年引發(fā)全球爆發(fā)新型冠狀病毒肺炎（COVID-19），極大的影響了醫(yī)療和社會經(jīng)濟(jì)，給人類帶來了極大的挑戰(zhàn)，迅速成為全球公共衛(wèi)生緊急事件（Mijaljica等，2020）。直到現(xiàn)在仍然沒有研制出有效的抗擊新冠肺炎藥物，研究表明自噬與SARSCoV-2同樣具有復(fù)雜的關(guān)系，自噬可以作為抗SARS-CoV-2感染的一種新策略，為治療新冠肺炎提供新的方法和思路。