滇重樓組織培養(yǎng)初代培養(yǎng)體系初探

李金月 陳志怡

(畢節(jié)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 畢節(jié) 551700)

滇重樓(Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.)即云南重樓，是我國(guó)重要的藥用植物，收錄于歷版《中國(guó)藥典》[1]。重樓屬植物我國(guó)種類最多，為該屬植物的分布中心之一，約有20種，變種10種，全國(guó)大部分地區(qū)有分布，主產(chǎn)于云南、四川、貴州、廣西等地[2]。貴州重樓屬藥用植物資源共有9變種1變型，其中有2個(gè)變種為貴州特有[3]。重樓具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚的功效，用于治療臃腫、咽喉腫痛、毒蛇咬傷、跌打傷痛、涼風(fēng)抽搐等癥[4]。重樓是云南白藥、四川白藥、宮血寧、奪命丹等一些重要中成藥和新藥的主要原料之一[2,5]。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)是目前人們最為關(guān)注的解決重樓無(wú)性快速繁育瓶頸的途徑之一。侯玉平[6]等對(duì)滇重樓切塊繁殖不定芽發(fā)生的組織學(xué)研究認(rèn)為，滇重樓切塊繁殖時(shí)不定芽起源于薄壁組織細(xì)胞脫分化，為多細(xì)胞起源，不經(jīng)過(guò)愈傷組織階段，為直接發(fā)生。鑒于此，本文以滇重樓根狀莖為試材，進(jìn)行滇重樓組織培養(yǎng)初代培養(yǎng)體系研究，以期為重樓屬植物組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)選取生長(zhǎng)健康、無(wú)病蟲(chóng)害的二年生滇重樓根狀莖的第1節(jié)間為外植體。

1.2 方法

1.2.1 外植體處理方式

選取生長(zhǎng)狀況良好、無(wú)病蟲(chóng)害的滇重樓二年生根狀莖，用自來(lái)水和洗衣粉將其表面泥土洗凈，流水沖洗1.5h，然后放入濃度為0.5%的消清靈溶液中浸泡30min，取出洗凈后的外植體在陰涼處晾干備用。

經(jīng)過(guò)處理的外植體，在超凈臺(tái)上先用75%的酒精溶液消毒1min，無(wú)菌水沖洗3次，然后用0.1%升汞消毒處理8min，再用無(wú)菌水沖洗4次，用無(wú)菌濾紙吸干材料表面的水分備用。

消毒處理后的根狀莖，切取根狀莖上第1個(gè)節(jié)間作為外植體。

1.2.2 初代培養(yǎng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分的篩選

以MS加6g·L-1瓊脂加30g·L-1蔗糖，pH5.8為基本培養(yǎng)基，試驗(yàn)設(shè)計(jì)參照表1所示L16(43)正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行，具體植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑與抗生素濃度配比見(jiàn)表2。

將1.2.1中消毒處理并切好的外植體，按照每處理3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)10瓶，每瓶2～3個(gè)外植體，接種于表2所示植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑與抗生素配比的培養(yǎng)基上。在光照時(shí)間10h·d-1、光照強(qiáng)度2500lx，培養(yǎng)溫度(25±2)℃條件下培養(yǎng)80d，記錄培養(yǎng)材料綜合生長(zhǎng)情況，計(jì)算各處理的啟動(dòng)率、褐化率、污染率等。通過(guò)數(shù)據(jù)處理確定滇重樓初代培養(yǎng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的最佳成分。

表1 L16(43)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表2 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑與抗生素配比表

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度6-BA處理對(duì)滇重樓組培的影響

從表3可以看出，MS加2,4-D 1.0mg·L-1培養(yǎng)基添加不同濃度6-BA對(duì)外植體啟動(dòng)率、褐化率、啟動(dòng)培養(yǎng)時(shí)間、叢生芽形成時(shí)間等都有影響。

外植體啟動(dòng)率隨著6-BA濃度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，以6-BA濃度為2.5mg·L-1時(shí)啟動(dòng)率最高，為63.66%。

外植體褐化率隨著6-BA濃度的升高呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，以6-BA濃度為3.5mg·L-1時(shí)褐化率最高，為56.08%。

外植體接種以后都有不同程度的污染，5d以后基本穩(wěn)定，沒(méi)有出現(xiàn)新的污染。接種后20d開(kāi)始，在切口處陸續(xù)有瘤狀物出現(xiàn)，瘤狀物出現(xiàn)早晚隨著6-BA的升高呈現(xiàn)先晚后早又晚的現(xiàn)象。以6-BA濃度為2.5mg·L-1時(shí)瘤狀物出現(xiàn)最早，為接種后21d左右開(kāi)始出現(xiàn)。以6-BA濃度為0.5mg·L-1時(shí)瘤狀物出現(xiàn)最晚，為接種后41d左右開(kāi)始出現(xiàn)。

外植體誘導(dǎo)形成叢生芽的時(shí)間，以6-BA濃度為2.5mg·L-1時(shí)最早，為接種后53d左右；以6-BA濃度為0.5mg·L-1時(shí)最晚，為接種后76d左右。

苗的質(zhì)量以6-BA濃度為2.5mg·L-1時(shí)最高，不僅苗量多，而且顏色深綠、生長(zhǎng)健壯。

因此，在以二年生滇重樓根狀莖的第1節(jié)間為外植體，以MS加2,4-D 1.0mg·L-1為培養(yǎng)基時(shí)，建議添加2.5mg·L-1的6-BA。

2.2 不同濃度2,4-D處理對(duì)滇重樓組培的影響

在植物組織培養(yǎng)培養(yǎng)中，2,4-D對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)非常有效，但往往抑制芽的形成，影響器官發(fā)育[7]。

表3 不同濃度6-BA處理對(duì)滇重樓外植體誘導(dǎo)的影響

如表4所示，MS加6-BA 2.5m·L-1培養(yǎng)基添加不同濃度2,4-D，對(duì)外植體啟動(dòng)率、褐化率、啟動(dòng)培養(yǎng)時(shí)間等影響不太明顯，但是對(duì)外植體再生途徑有影響。隨著2,4-D濃度的升高，外植體趨向誘導(dǎo)形成愈傷組織，叢生芽生長(zhǎng)受到抑制。隨著6-BA與2,4-D濃度比值的下降，外植體形成的愈傷組織增加，而叢生芽減少。

由于植物組織培養(yǎng)中叢生芽途徑具有遺傳性狀穩(wěn)定，繁殖速度快的特點(diǎn)[7]，在滇重樓快速繁殖中應(yīng)該優(yōu)先考慮此途徑。因此，建議在以二年生滇重樓根狀莖的第1節(jié)間為外植體進(jìn)行快速繁殖時(shí)，培養(yǎng)基中盡量少添加2,4-D，控制6-BA與2,4-D的濃度比大于1，或者不添加2,4-D。

2.3 不同濃度鹽酸特比萘芬處理對(duì)滇重樓組培的影響

在MS加6-BA 2.5mg·L-1加MS加2,4-D 1.0mg·L-1培養(yǎng)基中添加不同濃度的鹽酸特比萘芬，對(duì)外植體的誘導(dǎo)率、污染率、啟動(dòng)時(shí)間等都有影響。

外植體的啟動(dòng)隨著鹽酸特比萘芬濃度的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)，以鹽酸特比萘芬濃度為150mg·L-1時(shí)最高，為68.34%；外植體的污染率隨著鹽酸特比萘芬濃度的升高呈先上升后下降的趨勢(shì),以鹽酸特比萘芬濃度為150mg·L-1時(shí)最低，為26.73%。

外植體的啟動(dòng)時(shí)間在鹽酸特比萘芬濃度低時(shí)變化不大，當(dāng)其濃度達(dá)到250mg·L-1時(shí)，啟動(dòng)時(shí)間推后；隨著鹽酸特比萘芬濃度的升高，叢生芽形成時(shí)間與外植體的啟動(dòng)時(shí)間呈相同的趨勢(shì)。

因此，建議在滇重樓的初代培養(yǎng)中添加低濃度的鹽酸特比萘芬，可以減少外植體的真菌污染。

表4 不同濃度2,4-D處理對(duì)滇重樓外植體誘導(dǎo)的影響

表5 不同濃度鹽酸特比萘芬處理對(duì)滇重樓外植體誘導(dǎo)的影響

3 結(jié)論

本文以二年生滇重樓根狀莖的第1節(jié)間為外植體，研究了在初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加不同濃度6-BA、2,4-D和鹽酸特比萘芬對(duì)外植體啟動(dòng)率、褐化率、啟動(dòng)培養(yǎng)時(shí)間、形成叢生芽時(shí)間、外植體再生途徑等方面的影響。

侯玉平[6]等研究認(rèn)為，滇重樓切塊繁殖時(shí)可以不經(jīng)過(guò)愈傷組織階段，直接形成苗。在植物組織培養(yǎng)中，植物生長(zhǎng)調(diào)劑的添加至關(guān)重要，決定了外植體的再生途徑。細(xì)胞分裂素類有利于芽的形成，生長(zhǎng)素類有利于根的形成和誘導(dǎo)形成愈傷組織。而植物組織培養(yǎng)中叢生芽途徑具有遺傳性狀穩(wěn)定、繁殖速度快的特點(diǎn)[7]。細(xì)胞分裂素類與生長(zhǎng)素類配比濃度比值高時(shí)有利于芽的形成。

因此，為了加快滇重樓快速繁殖體系的建立，建議選擇二年生滇重樓根狀莖的第一節(jié)間為外植體，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂素類與生長(zhǎng)素類配比濃度，使其經(jīng)過(guò)叢生芽途徑快速成苗。