大花卷丹繁殖方法及脫毒技術(shù)的研究

于新海 李濛 周紅昕

(吉林省生物研究所，吉林 長(zhǎng)春 130000)

百合(Lilium brownii var.viridulum Baker)又名番韭、山丹、倒仙等，是百合科百合屬(Lilium)多年生草本球根類植物，目前全球共發(fā)現(xiàn)120個(gè)種，我國有55個(gè)種，36個(gè)特有種。長(zhǎng)白山區(qū)的百合種源數(shù)較少，有9個(gè)種，2個(gè)變種[1]。由于特殊的地理位置和氣候條件，長(zhǎng)白山區(qū)的野生百合無論從株型花色、生長(zhǎng)條件和營養(yǎng)成分含量上都具有不可替代的作用。百合屬藥食同源植物，在潤肺止咳、清心安神，補(bǔ)中益氣等方面有著顯著功效[2]，尤其是大花卷丹，近年來在吉林省廣泛種植，成為吉林省部分地區(qū)帶動(dòng)農(nóng)戶致富的經(jīng)濟(jì)作物，對(duì)吉林省特色經(jīng)濟(jì)提升具有十分重要的推動(dòng)意義。

吉林省長(zhǎng)白山區(qū)野生百合的開發(fā)和利用處于起步期，對(duì)長(zhǎng)白山區(qū)野生百合的引種種植沒有形成規(guī)?；谑秤冒俸戏N植方面，全省種植面積在50hm2左右，分布在蛟河、靖宇、伊通和通化。散戶種植數(shù)量幾乎沒有，多以小規(guī)模個(gè)體農(nóng)場(chǎng)、小型農(nóng)業(yè)公司在種植。其原因歸結(jié)于2方面，對(duì)長(zhǎng)白山區(qū)野生百合品種的應(yīng)用方向了解不夠，不能準(zhǔn)確定位長(zhǎng)白山野生百合品種的市場(chǎng)前景和應(yīng)用方向；長(zhǎng)白山區(qū)野生百合的數(shù)量有限，人工栽培需要大量種球或種苗，因未解決種球繁殖培育技術(shù)，限制了長(zhǎng)白山區(qū)野生百合的種植推廣。

同時(shí)，由于森林銳減、濕地開墾、隨意采挖、鐵路公路建設(shè)、開礦及周邊環(huán)境污染、放牧及野生動(dòng)物啃食鱗莖、人工造林(包括外來樹種、物種引入)等，有些長(zhǎng)白山野生百合品種已經(jīng)成為瀕危品種，如垂花百合已被列入國家二級(jí)保護(hù)品種(第2批)。所以，僅依靠野生百合種源已經(jīng)無法支撐吉林省百合種植產(chǎn)業(yè)的需求[3]。

因此，對(duì)大花卷丹繁殖技術(shù)的研究，不僅可以為企業(yè)提供成熟優(yōu)質(zhì)、無毒種球的培育方法，避免在種植過程中面臨無種可種的“卡脖子”問題在吉林省發(fā)生，還可以有效推動(dòng)吉林省百合產(chǎn)業(yè)的大發(fā)展和野生百合資源保護(hù)、開發(fā)及利用。

1 大花卷丹的傳統(tǒng)繁殖方法

大花卷丹的傳統(tǒng)繁殖方式主要有無性繁殖和有性繁殖2種，主要以種球移栽、鱗片扦插以及種子播種等方式進(jìn)行培育[4]。

1.1 有性繁殖

為了增加大花卷丹的產(chǎn)量，在種植過程中通常采取去花處理，但為了保證大花卷丹的優(yōu)良性狀和種植的觀賞性，在提純復(fù)壯過程中會(huì)留一部分進(jìn)行留花留種，這樣在花期后形成的蒴果中可以得到大量種子，在北方的9月10—20日種子成熟后便可以采收。

采收后的蒴果去殼后晾干儲(chǔ)存，千粒重約3.7g。入冬后，將采收后的種子用80%含量的多菌靈可濕性粉劑稀釋800倍液后浸泡20min，再入清水浸泡20min，與3倍體積清洗后的細(xì)河沙混勻后分包入冷庫沙藏，儲(chǔ)藏條件為溫度-5～-1℃，濕度為70%～80%。第2年5月進(jìn)行旋耕整地做畦，標(biāo)準(zhǔn)為畦面寬120cm，作業(yè)道60cm，在畦面上進(jìn)行播種，均勻播撒約500?！-2種子，覆蓋細(xì)土3～5cm，用薄草簾覆蓋并噴水保濕。10～15d便可出苗，出苗后去除草簾，進(jìn)行田間管理，2a后便可進(jìn)行種球收獲移栽[5]。

1.2 無性繁殖

1.2.1 鱗片的扦插

北方地區(qū)，大花卷丹在9月10—20日地上部分已經(jīng)返黃干枯，這時(shí)對(duì)大花卷丹進(jìn)行采收，采收后的商品鱗莖通常會(huì)進(jìn)行去除外層鱗片，抽真空塑封后進(jìn)行銷售。在去除的外層鱗片中，篩選出無病斑、無腐爛的正常鱗片作為扦插鱗片。不僅充分利用剝離的外層鱗片，避免浪費(fèi)，而且有利于扦插鱗片的出苗和生根后的幼苗生長(zhǎng)。

將篩選出的外圍鱗片用80%含量的多菌靈可濕性粉劑稀釋800倍液后浸泡20min，入清水浸泡5min，取出后晾干表面水分備用。另選扦插用地，避免重茬，進(jìn)行旋耕整地做畦，標(biāo)準(zhǔn)為畦面寬120cm，作業(yè)道60cm，在畦面做行距10cm、深5cm的壟溝，將準(zhǔn)備好的鱗片，基部沾取溶解后的生根粉溶劑，凹面向上斜插入壟溝內(nèi)，覆蓋細(xì)土后，用薄草簾覆蓋保濕，此時(shí)秋季溫度在20℃左右，鱗片在土壤中萌發(fā)，生根，但不會(huì)出苗，進(jìn)入冬季后休眠，第2年春季出苗后去除草簾，進(jìn)行田間管理。秋季進(jìn)行收獲種球分級(jí)移栽[6]。

1.2.2 種球分級(jí)移栽

近幾年，大花卷丹在東北地區(qū)的種植面積不斷擴(kuò)大，根據(jù)大花卷丹的生長(zhǎng)特性，每株大花卷丹地下根莖橫走并生長(zhǎng)出多個(gè)鱗莖，通過對(duì)繁殖的小鱗莖即種球的分級(jí)移栽，可有效控制移栽的種植密度，避免大小種球混栽出現(xiàn)株距不足、長(zhǎng)勢(shì)不一致而導(dǎo)致管理不便、養(yǎng)分不足、土地浪費(fèi)等現(xiàn)象[7]。通過對(duì)種球品質(zhì)的篩選，有利于種植過程中病害的防治及種源的提純復(fù)壯[8]。

秋季對(duì)大花卷丹進(jìn)行收獲時(shí)，根據(jù)鱗莖的大小將收獲的種球分為商品球、一級(jí)種球(20～30g)、二級(jí)種球(15～20g)和三級(jí)種球(15g以下)。分級(jí)后的種球，用80%含量的多菌靈可濕性粉劑稀釋800倍液后浸泡20min，晾干表面水分。另選種植用地，避免重茬，進(jìn)行旋耕整地做畦，標(biāo)準(zhǔn)為畦面寬120cm，作業(yè)道60cm，一級(jí)種球株行距15cm×15cm，二級(jí)種球株行距10cm×10cm，三級(jí)種球選擇播撒的方式，以250kg·667m-2的標(biāo)準(zhǔn)均勻播撒在畦面上，覆蓋細(xì)土7～10cm即可。定植后用玉米秸稈碎屑或者松針覆蓋，澆透水，第2年出苗后進(jìn)行田間管理[9]。

2 大花卷丹的組織培養(yǎng)及脫毒

在百合種植過程中，由于多年輪作，對(duì)種源質(zhì)量把控不嚴(yán)，出現(xiàn)種源嚴(yán)重退化現(xiàn)象，現(xiàn)已檢測(cè)出吉林省百合多攜帶黃瓜花葉病毒(CMV)，對(duì)百合的產(chǎn)量造成了嚴(yán)重的損失，成為限制吉林省百合大規(guī)模種植的關(guān)鍵因素之一。百合斑駁病毒(LMoV)、黃瓜花葉病毒(CMV)與百合無癥病毒(LSV)是最易感染百合、危害最大的3種病毒[10]。其中，黃瓜花葉病毒會(huì)造成葉萎縮黃化、變皺、莖變形等病癥[11]。然而，上述3種病毒常伴隨出現(xiàn)，導(dǎo)致百合花葉斑駁、花葉變形、植株矮化或無主桿、百合切花或鱗莖品質(zhì)不合格[12]，在種植生產(chǎn)上，百合的繁殖方式主要靠無性繁殖技術(shù)——扦插、分球等，這種方式會(huì)使感染百合的病毒不斷傳代，在開放環(huán)境下擴(kuò)散感染其他植株，擴(kuò)大病毒傳播范圍，對(duì)百合種植業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[13]。因此，百合脫毒苗制備技術(shù)對(duì)切斷病毒傳播、減少經(jīng)濟(jì)損失至關(guān)重要。

2.1 大花卷丹的組織培養(yǎng)

大花卷丹經(jīng)過多代的種植常伴有種源退化和病毒積累等現(xiàn)象，所以目前通過組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)大花卷丹進(jìn)行快速繁殖，既可以滿足吉林省在大花卷丹種植生產(chǎn)上對(duì)種源的迫切需要，又能在組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)上對(duì)侵染病毒的植株進(jìn)行脫毒[14]。成海鐘等研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加0.1mg·L-16-BA或KT可顯著提高百合繼代培養(yǎng)中芽的增殖效果，6-BA的效果優(yōu)于KT的效果[15]；石印等研究發(fā)現(xiàn)，大花卷丹組織培養(yǎng)啟動(dòng)階段添加6-BA和NAA可獲得較好的不定芽誘導(dǎo)率，其中，細(xì)胞分裂素6-BA對(duì)大花卷丹的促進(jìn)效果較明顯[16]。

2.1.1 外植體誘導(dǎo)

通過實(shí)驗(yàn)得知，大花卷丹的不定芽誘導(dǎo)率、增殖倍數(shù)與所取鱗莖部位有密切關(guān)系。最佳取材部位為大花卷丹的中層鱗片，用洗衣粉水將鱗片沖洗干凈后，流水沖洗60min，將外植體置于超凈工作臺(tái)中，75%酒精消毒90s，去離子水漂洗3遍，0.1%升汞處理30min，去離子水漂洗3遍，無菌濾紙吸干表面水分，將鱗片縱向切成長(zhǎng)條鱗片(寬0.5～0.7cm)作為外植體接種于MS加NAA 0.1mg·L-1加6-BA 2mg·L-1誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每瓶接種3～4塊切好的鱗片，在培養(yǎng)間內(nèi)觀察并及時(shí)去除染菌培養(yǎng)瓶。培養(yǎng)間條件：溫度23～25℃，光照13～15h·d-1,光強(qiáng)為1500～2000lx。培養(yǎng)周期為25d，此時(shí)誘導(dǎo)率達(dá)75.7%。

2.1.2 不定芽增殖培養(yǎng)

誘導(dǎo)后的叢生芽長(zhǎng)度在2cm以上時(shí)，分切轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)基：MS加NAA 0.2mg·L-1加6-BA 3mg·L-1加GA31mg·L-1，培養(yǎng)周期為22～25d，此時(shí)增殖系數(shù)達(dá)3.56。

2.1.3 小鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)

經(jīng)過增殖培養(yǎng)后將叢生芽分成單株，轉(zhuǎn)入小鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。小鱗莖培養(yǎng)基：MS加NAA 1.0mg·L-1。23d左右膨大，形成小鱗莖后進(jìn)行生根培養(yǎng)，此時(shí)也有部分鱗莖有生根現(xiàn)象。

2.1.4 小鱗莖生根培養(yǎng)

經(jīng)過小鱗莖誘導(dǎo)后，小鱗莖開始膨大，將較大肥厚籽球至少有5個(gè)鱗片的小鱗莖轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)。生根培養(yǎng)基：MS加IAA 0.2mg·L-1。培養(yǎng)10d后小鱗莖開始生根，在20d后基本完成生根，此時(shí)生根率可以達(dá)97.3%，平均每顆小鱗莖生根數(shù)可達(dá)9.2條。

2.1.5 組培苗出瓶移栽

根據(jù)莖葉及根的生長(zhǎng)狀況可以進(jìn)行煉苗出瓶。選擇根長(zhǎng)在1cm以上，莖葉多的組培瓶進(jìn)行開瓶煉苗，移栽至含有基質(zhì)的穴盤內(nèi)?？叟锉乇?，在8d左右開始萌發(fā)新葉，出瓶苗成活率達(dá)96.7%。

2.2 大花卷丹的脫毒

近年來，百合常用的脫毒方法有莖尖培養(yǎng)、珠芽培養(yǎng)、熱處理、化學(xué)藥劑處理等，通常根據(jù)百合植株所攜帶病毒的種類采用不同的方法或者多種方法相結(jié)合對(duì)帶病植株進(jìn)行脫毒和二次脫毒，達(dá)到獲得無毒種苗的目的[17]。本次脫毒實(shí)驗(yàn)是以吉林省目前已檢測(cè)出攜帶黃瓜花葉病毒(CMV)的大花卷丹鱗莖為試材，采取熱處理和莖尖培養(yǎng)相結(jié)合的方法進(jìn)行脫毒，運(yùn)用RT-PCR方法檢測(cè)病毒，獲得無毒植株并進(jìn)行擴(kuò)繁。

通過組培的方法獲得攜帶黃瓜花葉病毒(CMV)的大花卷丹生根組培苗，將組培苗放入光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，溫度設(shè)置為40℃，其它培養(yǎng)條件與培養(yǎng)室條件相同。進(jìn)行熱處理3d后，在超凈工作臺(tái)內(nèi)利用解剖鏡剝?nèi)?.5mm左右莖尖并接種在MS加NAA 1.0mg·L-1培養(yǎng)基上培養(yǎng)。擴(kuò)繁培養(yǎng)單個(gè)莖尖所產(chǎn)生的組培苗并做好分類標(biāo)記，運(yùn)用RT-PCR方法對(duì)各組組培苗檢測(cè)黃瓜花葉病毒(CMV)，淘汰帶毒組，將成功脫毒的大花卷丹進(jìn)行組培擴(kuò)繁，獲得無毒植株。

3 小結(jié)與討論

近年來，吉林省百合產(chǎn)業(yè)正蓬勃發(fā)展，無論是觀賞、食用還是藥用百合種植面積正在逐年擴(kuò)大，尤其是大花卷丹，企業(yè)與種植戶為了最快獲取經(jīng)濟(jì)效益，只采用移栽種球的方法進(jìn)行種植，目前在種植方面已出現(xiàn)大面積黃苗、減產(chǎn)、種源退化現(xiàn)象。為了避免大花卷丹在種植過程中出現(xiàn)種源不足或無種可種的情況在吉林省發(fā)生，通過探究大花卷丹的多種繁殖方式，合理規(guī)劃種植區(qū)域，做好大花卷丹優(yōu)質(zhì)種源的培育工作，是企業(yè)和種植戶持續(xù)獲益的前提，是吉林省百合產(chǎn)業(yè)大發(fā)展的基礎(chǔ)保障。