KRAS、NRAS 及BRAF 基因突變與結直腸癌肝轉移的關系

茍海梅 ，方 莉 ，鐘曉武

（1）川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，四川 南充 637000;2）川北醫(yī)學院檢驗系;3）轉化醫(yī)學研究中心，四川 南充 637007）

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見的消化道系統(tǒng)惡性腫瘤，在全球范圍內其發(fā)病率和病死率位居所有惡性腫瘤的第3 位和第2 位[1]，目前其發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢[2]。CRC 較易發(fā)生遠處轉移，肝臟是其遠處轉移最主要的靶器官，約15%～25%的CRC 患者在確診時出現肝轉移，既同時性結直腸癌肝轉移（synchronous colorectal liver metastasis，synCRLM），約15%～25%的患者在CRC 原發(fā)灶根治術后發(fā)生肝轉移，既異時性結直腸癌肝轉移（metachronous colorectal liver metastasis，metCRLM）[3]。結直腸癌肝轉移（colorectal liver metastases，CRLM）是CRC 患者最主要的死亡原因，不經任何治療的肝轉移患者中位生存期僅僅約為7 個月，無法手術切除的患者5 a 生存率小于5%[3]。

隨著對腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制的深入研究，與CRC 發(fā)病和治療相關的基因也越來越多被發(fā)現，一些針對特定基因靶點的分子靶向藥物不斷問世，CRC 治療也進入了靶向個體化治療時代。KRAS、NRAS 和BRAF 基因是表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）所介導信號通路下游的重要調控分子，參與調控細胞生長、分化及增殖，其突變狀態(tài)與CRC 能否從靶向藥物抗EGFR 的單克隆抗體獲益密切相關。KRAS、NRAS 和BRAF 基因突變后會引起EGFR 依賴的RAS-RAF-MAPK 信號通路持續(xù)激活，引起不依賴于表皮生長因子刺激的細胞異常增殖和腫瘤產生，導致抗EGFR 單抗治療無效[4]。此外，KRAS、NRAS 和BRAF 基因突變狀態(tài)與CRC 預后密切相關，是CRC 預后不良獨立預測指標[5-7]。

目前國內外多項臨床指南推薦原發(fā)性或轉移性CRC 患者均應進行KRAS、NRAS 和BRAF 基因突變檢測，對預后進行分層，指導臨床用藥[3,8-10]。但KRAS、NRAS 和BRAF 基因與CRLM的關系尚不清楚，且鮮有報道，因此本研究旨在分析KRAS、NRAS 和BRAF 基因突變與CRLM的關系，為CRC 患者精準診治提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 病理資料

選取川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院2019 年1 月至2021 年10 月間經手術切除后確診CRC 的組織標本246 例，進行KRAS、NRAS 和BRAF 基因聯合檢測，并收集每例患者臨床資料包括對應的肝轉移情況、腫瘤部位、組織學類型、大體類型、分化程度、腫瘤大小直徑、TNM 分期、乙肝感染情況等。其中男148 例，女98 例；年齡22～85 歲，中位年齡57 歲。

1.2 檢測方法

采用離心柱法應用FFPE-DNA 樣品核酸提取試劑盒（艾德，廈門）提取組織基因組DNA，采用紫外分光光度計檢測DNA 的濃度和純度，并將提取好的DNA 稀釋至1 ng/μL 備用?；贏RMS 法和熒光PCR 技術，采用KRAS/NRAS/BRAF 基因突變聯合檢測試劑盒（艾德，廈門），應用SLAN-96P 全自動熒光定量PCR 儀（宏石，上海）進行KRAS、NRAS 和BRAF 基因突變檢測?；驒z測位點，見表1。

表1 246 例結直腸癌患者 KRAS、NRAS 和BRAF 基因突變分析Tab.1 Analysis of KRAS，NRAS and BRAF gene mutations in 246 CRC patients

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS17.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計數資料以百分率（%）表示，采用χ2檢驗進行組間數據比較，采用二元Logistic 回歸分析與CRLM 有關聯的因素，以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 KRAS、NRAS 和BRAF 基因突變分析

246 例CRC 患者中，KRAS 突變率最高，突變率為45.93%（113/246）；其次為NRAS，突變率為6.10%（15/246）；BRAF 突變率最低，突變率為4.87%（12/246）。在所有突變類型中，以KRAS 基因G12S、G12D 突變類型最為常見。KRAS 和NRAS 檢測區(qū)域均包含了2 號外顯子、3 號外顯子和4 號外顯子，其中均以2 號外顯子的檢出率最高，2 號外顯子在KRAS 總突變中占86.72%（98/113），在NRAS 總突變中占66.67%（10/15）。此外，共發(fā)現雙基因突變3 例，分別為KRAS 和NRAS 共同突變、KRAS 和BRAF 共同突變，以及NRAS 和BRAF 共同突變。有2 例存在KRAS雙位點突變，分別為G12C、G12R、G12V、G12A、G13C 突變合并Q61L、Q61R、Q61H 突變，G12S、G12D 突變合并G13D 突變。

2.2 KRAS、NRAS 和BRAF 基因與結直腸癌TNM 分期相關性分析

為了探討KRAS、NRAS 和BRAF 基因與結直腸癌轉移的關系，本研究分析KRAS、NRAS 和BRAF 基因突變狀態(tài)與結直腸癌初診時TNM 分期的相關性（表2），結果顯示NRAS 基因在Ⅳ期的突變率顯著高于Ⅰ～Ⅲ期（P=0.004），且有遠處轉移患者的突變率顯著高于沒有遠處轉移的患者（P=0.001），提示NRAS 突變狀態(tài)與初診時結直腸癌遠處轉移密切相關。未發(fā)現KRAS 和BRAF基因與TNM 分期具有相關性（P＞ 0.05）。

表2 KRAS、NRAS 和BRAF 基因突變與結直腸癌TNM 分期的關系[n（%）]Tab.2 Relationship between TNM staging and KRAS，NRAS and BRAF gene mutations in CRC [n（%）]

2.3 KRAS、NRAS 和BRAF 基因與結直腸癌肝轉移相關性分析

本研究246 例CRC 患者中，26.02%（64/246）的CRC 患者在確診時發(fā)生了肝轉移，既synCRLM。對研究病例進行隨訪，分析CRC 患者從確診到病程至1 a 的肝轉移情況，共計200 例CRC 患者獲得隨訪資料，其中1 a 內發(fā)生肝轉移的比率為46.00%（92/200）。

KRAS、NRAS 和BRAF 基因突變與CRLM 分析結果顯示，NRAS 突變與synCRLM 相關，在NRAS 突變組發(fā)生synCRLM 頻率高于NRAS 野生組（P=0.005），見表3，但隨著病程時間延長，1 a 內發(fā)生CRLM 在NRAS 突變組和野生組未見明顯差異（P=0.155）。KRAS 和BRAF 突變與CRLM無明顯相關性（P＞ 0.05）。

表3 結直腸癌肝轉移相關影響因素[n（%）]Tab.3 Related influencing factors of colorectal liver metastases [n（%）]

為了進一步明確CRLM 的影響因素，本研究分析了性別、年齡、CRC 病理特征及乙肝感染狀況與CRLM 的相關性，研究結果顯示，CRLM 與CRC 大體類型具有相關性，浸潤型CRC 患者發(fā)生synCRLM 頻率高于潰瘍型及隆起型患者（P=0.011），但隨著病程時間延長，不同大體類型組1a 內發(fā)生CRLM 未見明顯差異（P＞ 0.05），見表3。CRLM 與性別、年齡、腫瘤位置、乙肝感染、分化程度、組織學類型及腫瘤直徑大小均無明顯相關性（P＞ 0.05）。

將NRAS 突變狀態(tài)和大體類型納入二元Logistic 回歸模型，結果顯示NRAS 突變是synCRLM 的獨立危險因素（OR=9.974，95%CI=1.838～54.130，P=0.008）；潰瘍型（OR=0.253，95%CI=0.085～0.754，P=0.014）和隆起型（OR=0.167，95%CI=0.039～0.709，P=0.015）較浸潤型CRC 發(fā)生synCRLM 的風險低。

3 討論

CRC 的發(fā)生發(fā)展是環(huán)境因素及遺傳因素等共同作用的多階段、多步驟的復雜生物學過程，受多種基因突變、基因表達紊亂及表觀遺傳改變等的影響。KRAS、NRAS 和BRAF 作為EGFR 信號通路的關鍵調控基因，在CRC 患者的靶向治療中具有重要的指導作用，并可作為CRC 預后的標志物[5-10]。

本研究結果顯示KRAS、NRAS 和BRAF 的突變率分別為45.93%（113/246）、6.10%（15/246）和4.87%（12/246），其突變頻率與國內外研究報道相似[11-13]，且均以KRAS 基因的突變頻率最高。目前一些相關研究認為KRAS/NRAS 與BRAF 突變是互斥的[14]，但本研究檢出KRAS/BRAF 雙突變以及NRAS/BRAF 雙突變各1 例，此外，Guo[7]等和白楊等[11]也檢出KRAS/BRAF 雙突變或NRAS/BRAF 雙突變，提示KRAS 及NRAS 與BRAF 突變并非完全互斥，其共同突變可存在于少數病例中。

肝臟是結直腸癌血行轉移最主要的靶器官，CRLM 是CRC 預后不良和死亡的主要原因，如何盡早確診或預測CRLM，仍面臨重要挑戰(zhàn)，KRAS、NRAS 和BRAF 能否作為CRLM 診斷指標目前鮮有相關研究報道。本研究結果顯示NRAS 基因突變與synCRLM 相關，synCRLM 在NRAS 突變組發(fā)生頻率較高（P=0.005），但隨著病程時間延長，1 a 內發(fā)生CRLM 在NRAS 突變組和野生組未見明顯差異（P=0.155）。二元Logistic 回歸模型結果顯示NRAS 突變是synCRLM 的獨立危險因素，提示NRAS 基因突變患者早期較易出現CRLM。在與CRC 確診時TNM 分期分析中，NRAS 基因突變與遠處轉移具有相關性，其突變更易出現在有遠處轉移或Ⅳ期的CRC 患者，進一步提示NRAS基因可能參與CRC 的早期轉移。RAS 基因是機體腫瘤中常發(fā)生差異突變的主要驅動致癌基因，其致瘤潛能主要歸因于自主促進腫瘤細胞增殖和存活，但最近的證據表明RAS 原癌基因通過向內皮細胞和髓細胞發(fā)出的不同趨化因子集信號介導腫瘤轉移[15-16]。尤其是NRAS 基因，其突變在高度轉移性癌癥中較為常見，如原發(fā)部位不明的轉移性腫瘤和黑色素瘤。Adler 等[17]報道NRAS 突變的皮膚黑色素瘤患者肝轉移、中樞神經體統(tǒng)、肺轉移的幾率增加。Giannou 等[16]研究發(fā)現突變或過表達NRAS 通過調節(jié)白細胞介素-8 相關趨化因子的表達促進多種腫瘤細胞肺定植，并認為白細胞介素-8 相關趨化因子可能是對抗其他器官癌癥肺轉移的重要治療靶點。因此筆者推測，NRAS基因可能通過調節(jié)趨化因子的表達促進CRC 的早期肝轉移或其他遠處轉移。

盡管KRAS 與NRAS 同屬RAS 基因，但本研究結果顯示KRAS 突變與CRLM 無明顯相關性（P均 ＞ 0.05）?？赡芘c其在CRC 中涉及的轉移機制不同相關。Tie 等[18]研究發(fā)現CRC 肝轉移率在KRAS 突變型與KRAS 野生型組無顯著差別，與本研究相符，但該團隊發(fā)現KRAS 突變的晚期CRC 患者肺轉移率及腦轉移率更高。此外，本研究結果顯示BRAF 突變與CRLM 不具有相關性；CRC 大體類型與早期CRLM 相關，浸潤型CRC患者發(fā)生synCRLM 頻率相對較高。

綜上所述，NRAS 突變與synCRLM 相關，NRAS 突變的CRC 患者早期較易出現CRLM，且NRAS 突變是synCRLM 的獨立危險因素。KRAS和BRAF 突變與CRLM 不具有相關性。對NRAS進行檢測不僅在靶向治療中具有重要的指導作用，在早期CRLM 評估中也具有重要的臨床指導價值。