HPLC法同時測定美洲大蠊標準湯劑中6種成分含量

吳津麗 高 晗 曾永禎 吳清雨 陳博濤 李軍山,2,3 王亞濤 董博宇 張睿智 孫福仁*

1.神威藥業(yè)集團有限公司,河北 石家莊 051430;2.楚雄神威施普瑞藥物研究有限公司,云南 楚雄 675000; 3.云南省中藥配方顆粒工程研究中心,云南 楚雄 675000

美洲大蠊為蜚蠊科昆蟲美洲蜚蠊Periplanetaamericana(Linnaeus) 的干燥全體。本品味咸，性寒，入心、肝、脾、腎經(jīng)。具有健脾消疳，活血通脈，利水消腫，斂瘡生肌的功效。內用治療脅痛、癥瘕、疳積、心悸、氣喘、水腫；外用治療水火燙傷、各種創(chuàng)傷及潰瘍[1]。美洲大蠊藥材分布廣泛[2]。其富含蛋白質、脂肪酸、核苷類、多糖、昆蟲神經(jīng)肽、異黃酮、油脂等多種化學成分[3-8]。

核苷類物質是構成RNA和DNA的前體物質，也是抗腫瘤和抗病毒藥物的中間體[8]。核苷類物質檢測是美洲大蠊藥材及加工品檢測的主要指標，溫慧敏等[9]采用HPLC法測定美洲大蠊飲片中尿嘧啶、肌苷的含量；黃博等[10]利用HPLC法同時測定美洲大蠊藥材中尿嘧啶、肌苷、次黃嘌呤三種成分；趙從琪等[11]對美洲大蠊藥材脫脂處理并測定5種核苷類成分；馬雪偉等[12]建立HPLC法測定美洲大蠊提取物凍干粉中9種核苷類成分。上述文獻的研究對象集中于美洲大蠊藥材及其提取物，尚未有關于美洲大蠊標準湯劑的相關報道。本文以不同產(chǎn)地的美洲大蠊飲片為原料，制備了10批美洲大蠊標準湯劑。采用HPLC法同時測定尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、原兒茶酸6種成分含量，為美洲大蠊配方顆粒質量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 WATERS Symmetry Shield C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；島津高效液相色譜儀：LC-20AT泵，SPD-M20A型檢測器，SIL-20A自動進樣器，CTO-20AC柱溫箱，島津LabSolutions色譜工作站；CPA225D型電子分析天平(北京賽多利斯)；JM-A5002型電子天平(余姚市紀銘稱重校驗設備有限公司)；KH-7200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；R502B旋轉蒸發(fā)儀(上海申科生物技術有限公司)；LGJ-12壓蓋型真空冷凍干燥機(河南兄弟儀器設備有限公司)；榮事達養(yǎng)生藥膳壺(合肥榮事達小家電有限公司)；0.45 μm有機系/水系針頭式濾器(ASC，AMERICAN SCIENTIFIC)；

1.2 對照品 尿嘧啶(上海源葉生物科技有限公司，批號：T14A8X33880，純度≥98%)；尿苷(中國食品藥品檢定研究院，批號：110887-202104，純度為99.6%)；鳥苷(中國食品藥品檢定研究院，批號：111977-201501，純度為93.6%)；次黃嘌呤(樂美天醫(yī)藥/德思特生物，批號：DST200305，純度≥98%)；肌苷(中國食品藥品檢定研究院，批號：140669-202007，純度為99.2%)；原兒茶酸(中國食品藥品檢定研究院，批號：110809-201906，純度為97.7%)。甲醇(MeOH)、乙腈(ACN)均為HPLC級(美國ACS公司)；水為純化水；其他試劑均為分析純。

1.3 藥材來源及標準湯劑制備方法

1.3.1 藥材 10批美洲大蠊飲片來源于云南、四川、安徽、山東4個產(chǎn)區(qū)，經(jīng)原河北省藥品檢驗所孫寶惠老師鑒定，為蜚蠊科昆蟲美洲蜚蠊Periplanetaamericana(Linnaeus) 的干燥全體。

1.3.2 標準湯劑 根據(jù)《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求(征求意見稿)》中相關規(guī)定，確定美洲大蠊標準湯劑制備工藝為：取飲片100 g，加水煎煮二次，一煎加8倍水，浸泡30 min，煮沸，保持微沸煎煮30 min，200目篩網(wǎng)過濾，立即冷卻至室溫；二煎加6倍水，煮沸，保持微沸煎煮20 min，200目篩網(wǎng)過濾，合并兩次煎液，立即冷卻至室溫，低溫真空濃縮，濃縮液冷凍干燥，密封包裝，即得。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 WATERS Symmetry Shield C18(柱長為250 mm，內徑為4.6 mm，粒徑為5.0 μm)；以甲醇為流動相A，0.1%磷酸水為流動相B，梯度洗脫(0～9 min，0%～0%A；9～10 min，0%～2%A；10～15 min，2%～2%A；15～20 min，2%～5%A；20～35 min，5%～6%A；35～55 min，6%～10%A；55～60 min，10%～11%A)；柱溫20℃；體積流速0.6 mL/min；進樣量10 μL；檢測波長為254 nm。理論板數(shù)按肌苷峰計算應不低于10000。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、原兒茶酸對照品2.13 mg、8.11 mg、4.20 mg、11.54 mg、6.76 mg、13.70 mg，分別置于25 mL、10 mL、25 mL、10 mL、50 mL、25 mL容量瓶中，加30%甲醇定容至刻度，制成儲備液。再精密量取各成分儲備液4 mL、1 mL、1 mL、2 mL、1 mL、2 mL，置于25 mL容量瓶中，加30%甲醇定容至刻度，制成每 1 mL含尿嘧啶13.63 μg、次黃嘌呤32.44 μg、尿苷6.72 μg、肌苷92.32μg、鳥苷5.41 μg、原兒茶酸43.84 μg的混合溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取美洲大蠊標準湯劑粉末，精密稱取0.5 g，置25 mL量瓶中，加入適量30%甲醇(V/V)，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，用30%甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性樣品溶液的制備 取30%甲醇(V/V)適量，加入25 mL量瓶中，用30%甲醇(V/V)定容至刻度，即得陰性樣品溶液。

2.5 專屬性實驗 分別吸取對照品溶液、供試品、陰性樣品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀測定。結果顯示，供試品溶液在與尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、原兒茶酸對照品的相同保留時間處有色譜峰，而陰性樣品溶液中未見色譜峰，表明其對測定結果無干擾，且樣品中尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、原兒茶酸色譜峰分離度均大于1.5，符合含量測定要求。如圖1所示。

(A)對照品溶液

(B)陰性對照

(C)美洲大蠊標準湯劑樣品1.尿嘧啶；2.次黃嘌呤；3.尿苷；4.肌苷；5.鳥苷；6.原兒茶酸圖1 含量測定色譜圖

2.6 線性關系考察分別精密吸取混合對照品溶液3 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL，在“2.1”項色譜方法下測定，以峰面積積分值為縱坐標(Y)，進樣量(μg)為橫坐標(X)繪制標準曲線，計算回歸方程。結果見表1，各成分在各自規(guī)定范圍內線性關系良好。

表1 線性范圍及回歸方程表

2.7 精密度試驗 在“2.1”項色譜條件下，精密吸取對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，測定、記錄峰面積積分值。經(jīng)計算，尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、原兒茶酸峰面積RSD值分別為0.78%、1.15%、0.85%、0.21%、0.46%、0.55%，結果說明儀器精密度良好。

2.8 重復性試驗 取同一批美洲大蠊標準湯劑S10干膏粉適量，分別稱取6份，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項下色譜條件測定，測得供試品溶液中尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、原兒茶酸含量的RSD值分別為0.91%、1.42%、0.98%、1.12%、0.77%、1.24%(n=6)，說明方法重現(xiàn)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗 取美洲大蠊標準湯劑S10干膏粉適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進樣測定，測得尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、原兒茶酸含量的RSD值分別為1.24%、1.75%、1.64%、1.57%、1.28%、0.94%(n=6)，表明供試品在溶液狀態(tài)下24 h內基本穩(wěn)定。

2.10 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的美洲大蠊標準湯劑干膏粉(S10)0.25 g，置于25 mL容量瓶中，共計6份，分別精密加入等量尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、原兒茶酸對照品溶液，按“2.3”項下供試品溶液制備方法制備，按“2.1”項色譜條件測定，分別計算尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、原兒茶酸回收率。測定結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果表

2.11 樣品測定 取10批美洲大蠊標準湯劑干膏粉適量，按照“2.3”項下制備供試品溶液。按“2.1”項下色譜條件測定，計算含量。結果見表3。

表3 10批美洲大蠊標準湯劑含量測定結果表 (mg/g)

由表3可知，不同產(chǎn)地美洲大蠊標準湯劑中6種成分的含量測定值有一定差異。根據(jù)《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求(征求意見稿)》中相關要求，以10批標準湯劑中6種成分測定值均值加減30%范圍為限度，評價10批標準湯劑是否有異常值。

10批美洲大蠊標準湯劑中肌苷成分含量范圍為2.17～3.15 mg/g，平均含量為2.63 mg/g，SD為0.36，RSD為13.69%。肌苷含量平均值的70%～130%的范圍為1.84～3.42 mg/g，10批美洲大蠊標準湯劑中肌苷含量處于規(guī)定范圍內，沒有異常值。其余5種成分含量值范圍同樣處于均值的70%～130%范圍內。

3 討論

本文以美洲大蠊飲片，根據(jù)《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求(征求意見稿)》中相關規(guī)定制備了10批美洲大蠊標準湯劑，制定含量測定方法，測定6種成分的含量。

3.1 色譜柱考察 本文以美洲大蠊標準湯劑中尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、原兒茶酸6種成分為分析對象。通過色譜柱篩選，發(fā)現(xiàn)WATERS Symmetry Shield C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱適合美洲大蠊標準湯劑中極性成分的分析，該色譜柱能夠耐受100%水相，且在水相比例大于95%的條件下，對待分析成分仍有分離作用，因此，確定使用WATERS Symmetry Shield C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。

3.2 流動相考察 考察了甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.1%乙酸、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸不同種類的流動相系統(tǒng)，結果表明：采用甲醇-0.1%磷酸為流動相進行梯度洗脫時，6個待測成分色譜峰峰形較好，分離度高，因此，選擇甲醇-0.1%磷酸為流動相系統(tǒng)。

3.3 柱溫考察 分別設定柱溫為20 ℃、25 ℃、30 ℃測定供試品中待測成分含量，結果表明，柱溫設定20 ℃時，6種待測成分分離度達到含量測定要求，因此，確定柱溫為20 ℃。

3.4 檢測波長考察 通過PDA檢測器210～400 nm全波長掃描，發(fā)現(xiàn)波長設定254 nm時，各色譜峰數(shù)量、分離度均較好，能夠反映出美洲大蠊中水溶性成分的多樣性，所以選擇254 nm作為檢測波長。

3.5 供試品溶液制備考察 供試品溶液的提取溶劑分別考察采用水及30%、50%、70%甲醇，結果發(fā)現(xiàn)30%甲醇為溶劑時，6種待測成分含量最高，故選擇30%甲醇為提取溶媒。

4 結語

本文以美洲大蠊飲片為原料，按照標準湯劑制備方法制備了10批美洲大蠊標準湯劑。應用HPLC液相色譜法建立美洲大蠊標準湯劑的含量測定方法，可同時測定尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷、原兒茶酸6種成分。6種成分均屬于水中溶解度較高的成分，符合美洲大蠊標準湯劑以水為提取溶媒的制備特點。其中，尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷為核苷類成分。經(jīng)方法學考察，各色譜峰分離度均達到1.5以上，線性、加樣回收率等均符合含量測定要求。

美洲大蠊標準湯劑含量測定方法的建立可為美洲大蠊配方顆粒質量控制提供參考。且本文在文獻資料的基礎上，重新建立含量測定方法，同時測定6種化學成分，質量控制更加全面。