黑木耳液體培養(yǎng)基篩選及其發(fā)酵件優(yōu)化

劉陽(yáng) ,黨文麗 ,曹建剛 ,邵 鵬 ,楊 喬 ,張 昊

（1.商洛市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，陜西 商洛 726000；2.商洛市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，陜西 商洛 726000；3.商洛市鄉(xiāng)村發(fā)展服務(wù)中心，陜西 商洛 726000；4.商洛市特色產(chǎn)業(yè)與休閑農(nóng)業(yè)指導(dǎo)中心，陜西 商洛 726000；5.延安市技術(shù)轉(zhuǎn)移中心，陜西 延安，716000）

黑木耳（Auricularia auricula）屬擔(dān)子菌綱、木耳目、木耳科、木耳屬，又名樹(shù)耳、樹(shù)蕈、木蛾、黑耳、云耳，單生或群生[1]。黑木耳口味獨(dú)特，脆嫩爽口，營(yíng)養(yǎng)豐富，《本草綱目》中記載木耳治痔、性平、味甘、補(bǔ)氣血、止血活血，有滋潤(rùn)、強(qiáng)壯、通便的功效，被現(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)學(xué)家譽(yù)為“素中之葷”，世界上稱之為“中餐中的黑色瑰寶”[2-3]。由于黑木耳具有食藥兼?zhèn)涞墓δ?，市?chǎng)需求量日益增大，栽培規(guī)模也日益擴(kuò)大。

近年來(lái)，隨著黑木耳產(chǎn)業(yè)設(shè)施化、集約化、規(guī)?；降奶岣?，液體菌種的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，工廠化生產(chǎn)對(duì)液體菌種培養(yǎng)技術(shù)的要求越來(lái)越高[4-5]。為篩選出優(yōu)質(zhì)的黑木耳液體菌種培養(yǎng)基配方及最佳培養(yǎng)條件，以黑木耳菌絲體生物量為主要考察指標(biāo)，對(duì)黑木耳液體發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化研究，以篩選出最優(yōu)培養(yǎng)基配比和最適培養(yǎng)條件，旨在為黑木耳液體菌種進(jìn)一步應(yīng)用生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株：黑威15，由商洛市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所食用菌研究室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 碳源篩選 選用蛋白胨8 g、磷酸二氫鉀2 g、硫酸鎂1.5 g、水1 000 mL為碳源篩選試驗(yàn)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。分別以葡萄糖、蔗糖、白糖、果糖、D-麥芽糖、玉米淀粉作為碳源，各取20 g 加入碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，制作液體培養(yǎng)基進(jìn)行碳源篩選試驗(yàn)。取100 mL 供試培養(yǎng)基于250 mL 錐形瓶中，121℃高壓滅菌30 min，冷卻，備用。無(wú)菌條件下取0.3 cm3大小活化母種進(jìn)行接種，于26℃，150 r/min搖恒溫床培養(yǎng)8 d，將培養(yǎng)好的菌絲體移入離心管中，10 000 r/min 離心5 min，棄上清液，于60℃烘干至恒重，稱量，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，測(cè)得菌絲體生物量[6]，取平均值。

1.2.2 氮源篩選 選用葡萄糖20 g、酸二氫鉀2 g、硫酸鎂1.5 g、水1 000 mL為氮源篩選試驗(yàn)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。分別以蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硝酸銨、硫酸銨、尿素、麩皮作為氮源，各取8 g 加入氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，制作液體培養(yǎng)基進(jìn)行篩選試驗(yàn)。取100 mL 供試培養(yǎng)基于250 mL 錐形瓶中，121℃高壓滅菌30 min，冷卻，備用。測(cè)定菌絲體生物量，方法同1.2.1。

1.2.3 液體菌種培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選擇最佳碳源、氮源及磷酸二氫鉀、硫酸鎂4 個(gè)因素為研究對(duì)象[3]，每個(gè)因素設(shè)定3水平，采用L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，對(duì)黑木耳液體培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，其因素水平見(jiàn)表1。

表1 黑木耳液體培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)因素水平 g/L

1.2.4 液體菌種培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

用優(yōu)化所得培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)。基礎(chǔ)培養(yǎng)條件為25℃、150 r/min、pH 7、接種量3 mL 于恒溫?fù)u床培養(yǎng)7 d。分別設(shè)定不同的轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)溫度、pH、接種量[7-9]，采用L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，對(duì)黑木耳液體菌種發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)方法同1.2.1。其因素水平見(jiàn)表2。

表2 黑木耳液體菌種培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素水平

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 22.0 對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源黑木耳的菌絲體生物量

由圖1 可知，葡萄糖、蔗糖、白糖、果糖、D-麥芽糖、玉米淀粉6 種碳源均能使黑木耳菌絲生長(zhǎng)，不同碳源條件下，黑木耳的菌絲體生物量表現(xiàn)為葡萄糖＞玉米淀粉＞蔗糖＞D-麥芽糖＞白糖＞果糖，其中以葡萄糖為碳源得到菌絲生物量最多，為1.02 g/100mL，玉米淀粉次之。葡萄糖、果糖為單糖，白糖、蔗糖、麥芽糖為雙糖，玉米淀粉是高分子多糖，可見(jiàn)黑木耳菌絲適合在以多羥基醛糖為碳源的條件下生長(zhǎng)，且為單糖時(shí)更利于菌絲生長(zhǎng)，因此，選擇葡萄糖作為黑木耳液體培養(yǎng)基的最佳碳源。

圖1 不同碳源黑木耳的菌絲體生物量

2.2 不同氮源黑木耳的菌絲體生物量

由圖2 可知，蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硝酸銨、硫酸銨、尿素、麩皮7種氮源均能使黑木耳菌絲生長(zhǎng)，不同氮源條件下，黑木耳的菌絲體生物量表現(xiàn)為蛋白胨＞麩皮＞酵母膏＞牛肉膏＞硫酸銨＞硝酸銨＞尿素，其中以蛋白胨為氮源得的菌絲生物量最高，為1.12 g/100mL，麩皮次之。蛋白胨是一種復(fù)雜的多肽混合物，營(yíng)養(yǎng)全面，因此，選擇蛋白胨作為黑木耳液體培養(yǎng)基的氮源。

圖2 不同氮源黑木耳的菌絲體生物量

2.3 黑木耳液體培養(yǎng)基最佳配方

由表3可知，正交試驗(yàn)不同處理的菌絲體生物量，以處理6 最多，其黑木耳菌絲體生物量為1.193 g/100 mL。經(jīng)極差分析和直觀分析得出，4 個(gè)因素對(duì)黑木耳菌絲體生長(zhǎng)的影響依次是A＞B＞C＞D，適合黑木耳液體菌種的最佳組合為A2B3C2D2，按此培養(yǎng)基配方進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3 次，得到菌絲體生物量最高，為1.21 g/100 mL。因此確定適合黑木耳液體菌種生長(zhǎng)的培養(yǎng)基為葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，硫酸鎂1.5 g/L。

表3 黑木耳液體培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

2.4 黑木耳液體菌種的最佳培養(yǎng)條件

由表4可看出，正交試驗(yàn)不同處理的菌絲體生物量，以處理5 最多，其黑木耳菌絲體生物量為1.211 g/100mL。經(jīng)極差分析和直觀分析得出，4 個(gè)因素對(duì)黑木耳菌絲體生長(zhǎng)的影響依次是A＞C＞D＞B，適合黑木耳液體菌種培養(yǎng)條件最佳組合為A2B2C3D2，按此培養(yǎng)條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3 次，得到菌絲體生物量最高，為1.22 g/100mL。因此確定適合黑木耳液體菌種培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)條件為轉(zhuǎn)速150 r/min，pH 6，溫度26℃，接種量為3 mL/100mL。

表4 黑木耳液體菌種培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

通過(guò)對(duì)6 種碳源和7 種氮源進(jìn)行篩選，得到最適合黑木耳生長(zhǎng)的碳源為葡萄糖，最適合黑木耳生長(zhǎng)的氮源為蛋白胨；通過(guò)L9（34）正交試驗(yàn)，得到適合黑木耳液體菌種培養(yǎng)的最佳方案為葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，硫酸鎂1.5 g/L，pH 6，按照此配方制作培養(yǎng)基，接種量3 mL/100 mL，于恒溫?fù)u床150 r/min，26℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，黑木耳菌絲體生物量最高，為1.22 g/100 mL。目前，液體菌種發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)是食用菌生產(chǎn)中一項(xiàng)新型制作方式，是生物發(fā)酵技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用。與固體菌種相比，液體菌種具有菌種生產(chǎn)周期短、菌齡整齊一致、菌絲活力強(qiáng)、接種方便、不宜感染雜菌等優(yōu)點(diǎn)，接于固體培養(yǎng)料內(nèi)，流動(dòng)性好，萌發(fā)點(diǎn)多，具有很好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景[10]。

菌絲生長(zhǎng)不僅需要碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子等營(yíng)養(yǎng)成分，還需要溫度、pH 等外因條件共同作用才能健康生長(zhǎng)[11-12]，研究?jī)H從常見(jiàn)物質(zhì)中選取了部分作為碳源、氮源對(duì)一種黑木耳（黑威15）進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化試驗(yàn)，尚未對(duì)其他碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子進(jìn)行研究，也未對(duì)無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌絲生長(zhǎng)發(fā)育的作用機(jī)理進(jìn)行研究，日后應(yīng)對(duì)此進(jìn)行深入研究。