枸櫞酸莫沙必利片雜質(zhì)研究*

劉阿利，王 雪，張貴民

（1.魯南貝特制藥有限公司，山東 臨沂 276006；2.國(guó)家手性制藥工程技術(shù)研究中心，山東 臨沂 276006；3.藥物新制劑研發(fā)山東省工程研究中心，山東 臨沂 276006）

枸櫞酸莫沙必利為選擇性5-羥色胺4（5-HT4）受體激動(dòng)劑，可增強(qiáng)上消化道的胃排空和蠕動(dòng)，促進(jìn)腸道膽堿能神經(jīng)元釋放乙酰膽堿，刺激胃腸道而發(fā)揮促動(dòng)力作用［1］。其選擇性強(qiáng)，不良反應(yīng)少，耐受性較好，促胃動(dòng)力作用強(qiáng)，主要用于緩解慢性胃炎伴有的消化系統(tǒng)癥狀，也可用于胃食管反流性疾病、糖尿病性胃輕癱及部分胃切除患者的胃功能障礙［2-5］。該制劑1998 年在日本上市，商品名Gasmotin?；2001 年在中國(guó)上市，中文名加斯清?［6］。目前，中國(guó)、歐洲、美國(guó)等的藥典均未收載，日本藥典（JP17 版）雖有收載，但也未對(duì)特定雜質(zhì)作明確規(guī)定。一致性評(píng)價(jià)參照日本藥典（JP17 版）“Mosapride Citrate Tablets”質(zhì) 量 標(biāo) 準(zhǔn)［7］及 日 本IF 文件［8］，建立本品有關(guān)物質(zhì)檢查方法，主要對(duì)5種特定雜質(zhì)進(jìn)行研究，結(jié)果特定雜質(zhì)莫沙必利檸檬酰胺在液相色譜圖中顯示2個(gè)色譜峰，但是否均為莫沙必利檸檬酰胺，雙峰出現(xiàn)的原因以及是否影響該雜質(zhì)含量的計(jì)算等問(wèn)題仍需進(jìn)一步研究。本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法和超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC -Q-TOF-MS）法對(duì)莫沙必利檸檬酰胺在有關(guān)物質(zhì)液相檢測(cè)條件下顯示的2個(gè)色譜峰進(jìn)行研究，為枸櫞酸莫沙必利片后續(xù)相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters ACQ -2489 型高效液相色譜儀，配備紫外檢測(cè)器（美國(guó)Waters 公司）；超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀，包括1290 型超高壓液相色譜系統(tǒng)（配備DAD 檢測(cè)器）、6540BQ-TOF 型四極桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)（配備電噴霧離子源）、Mass Hunter工作站軟件（美國(guó)Agilent 公司）；XS105 型電子天平、S210型酸度計(jì)（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 試藥

枸櫞酸莫沙必利片（自制，批號(hào)分別為170701，170702，170703）；莫沙必利檸檬酰胺對(duì)照品（加拿大TRC 公司，批號(hào)為15 -THT -139 -2，含量94.54%）；甲酸、乙酸銨、乙腈均為色譜純；其余試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測(cè)條件

2.1.1 HPLC 條件

色譜柱：Agilent C18柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；流動(dòng)相：枸櫞酸鹽溶液（A，取枸櫞酸鈉8.82 g，加水800 mL 使溶解，用稀鹽酸調(diào)pH 至4.0，加水至1 000 mL）-乙腈（B），梯度洗脫（洗脫程序見(jiàn)表1）；流速：1.0 mL/ min；檢測(cè)波長(zhǎng)：274 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按莫沙必利峰計(jì)應(yīng)不低于40 000。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program

2.1.2 UPLC-Q-TOF-MS 條件

色譜條件：色譜柱為YMC-Triant C18柱（150 mm×2.1 mm，1.9 μm）；檢測(cè)器為DAD 檢測(cè)器；流動(dòng)相為含0.1%甲酸的10 mmol/L 乙酸銨（A）-乙腈（B），梯度洗脫（洗脫程序見(jiàn)表2）；流速為0.5 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為274 nm；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為0.5 μL。

表2 梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution program

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子掃描模式（ESI+）；二級(jí)質(zhì)譜碰撞能量30 eV；毛細(xì)管電壓4 kV；錐孔電壓45 V；碎裂電壓60 V；干燥氣流速8 mL/min；干燥氣溫度300 ℃；霧化氣壓力35 psi；掃描模式MS/MS；掃描范圍m/z50～700。

2.2 溶液制備

取樣品細(xì)粉適量，精密稱定，加乙腈-水（40∶60，V/V）溶解并稀釋，制成每1 mL 中約含枸櫞酸莫沙必利1 mg 的溶液，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。精密量取適量供試品溶液，用乙腈-水（40∶60，V/V）定量稀釋，制成每1 mL 中約含5 μg 的溶液，即得對(duì)照溶液。取莫沙必利檸檬酰胺對(duì)照品約10 mg，精密稱定，置20 mL容量瓶中，加乙腈-水（40∶60，V/V）溶解并定容，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

2.3 有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)

精密量取2.2 項(xiàng)下對(duì)照溶液適量，按2.1.1 項(xiàng)下HPLC 條件進(jìn)樣，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分色譜峰的峰高為滿量程的10%～20%；再精密量取2.2 項(xiàng)下供試品溶液和對(duì)照溶液，按2.1.1 項(xiàng)下HPLC 條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1，分別按保留時(shí)間定位主峰及各雜質(zhì)峰?？梢?jiàn)，莫沙必利檸檬酰胺峰定位處顯示2 個(gè)明顯的色譜峰，保留時(shí)間分別為8.434 min 和8.665 min。有文獻(xiàn)指出，莫沙必利檸檬酰胺為一對(duì)對(duì)映異構(gòu)體，在色譜行為上表現(xiàn)為2個(gè)峰［9］。但從莫沙必利檸檬酰胺結(jié)構(gòu)看并非如此（因不含手性中心）。因此，其色譜圖中出現(xiàn)雙峰的原因仍需進(jìn)一步研究。

圖1 樣品有關(guān)物質(zhì)高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of related substances in samples

2.4 雙峰質(zhì)譜解析

取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按2.1.2項(xiàng)下UPLCQ -TOF -MS 條件進(jìn)樣分析，記錄液相色譜圖及一級(jí)（MS1）和二級(jí)（MS2）質(zhì)譜圖，見(jiàn)圖2和圖3。

圖2 對(duì)照品溶液高效液相色譜圖1，2.Mosapride citric amideFig.2 HPLC chromatogram of reference substance

圖3 對(duì)照品溶液質(zhì)譜圖1，2.Mosapride citric amideA，C.MS1 B，D.MS2Fig.3 Mass spectra of reference substance

液相色譜圖中在12.70 min 和12.76 min 處各出現(xiàn)1 個(gè)峰，分別命名為1 號(hào)峰和2 號(hào)峰。2 個(gè)峰一級(jí)質(zhì)譜分子量均與莫沙必利檸檬酰胺相當(dāng)，二級(jí)質(zhì)譜主要碎片峰離子豐度相當(dāng)，峰形相似，分子量均高度一致。初步推斷兩個(gè)色譜峰均為莫沙必利檸檬酰胺。

解析質(zhì)譜，推斷莫沙必利檸檬酰胺可能有多種裂解途徑（如圖4）。按途徑a 進(jìn)行碎裂，失去右側(cè)C20H26ClFN3O9基團(tuán)后生成碎片m/z109.04，元素組成為C7H6F+。另外可能按途徑b 失去左側(cè)C12H17FN2O 基團(tuán)后生成碎片m/z372.05，進(jìn)而繼續(xù)破裂，生成1 個(gè)碎片m/z175.02，元素組成為C6H7O6+；另一碎片獲得1 個(gè)氫得到碎片m/z198.03，元素組成為C9H9ClNO2+。莫沙必利檸檬酰胺可能的裂解碎片分子量與質(zhì)譜圖中二級(jí)碎片離子分子量一致，吻合度較高，因此進(jìn)一步確定2個(gè)峰均為莫沙必利檸檬酰胺。

圖4 莫沙必利檸檬酰胺可能的裂解途徑Fig.4 Possible fragmentation pathway of mosapride citric amide

2.5 雙峰存在型式確認(rèn)

本研究中所用的莫沙必利檸檬酰胺對(duì)照品為莫沙必利檸檬酰胺二鈉鹽，羧酸鈉鹽為弱酸強(qiáng)堿鹽，溶液狀態(tài)時(shí)存在解離現(xiàn)象，在流動(dòng)相pH 環(huán)境中可能有3 種存在型式，各型式之間存在解離平衡，見(jiàn)圖5。調(diào)節(jié)流動(dòng)相A的pH 分別為2.5，3.0，3.5，3.8，4.0，4.2，4.5，5.0，5.5，6.5，取2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按2.1.1 項(xiàng)下HPLC條件進(jìn)樣分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同流動(dòng)相pH下莫沙必利檸檬酰胺對(duì)照品溶液峰面積Tab.3 The peak area of mosapride citric amide reference substance under different pH values and mobile phases

圖5 莫沙必利檸檬酰胺對(duì)照品溶液可能存在的解離平衡Fig.5 Possible dissociation equilibrium of mosapride citric amide reference substance

根據(jù)莫沙必利檸檬酰胺分子結(jié)構(gòu)特征推測(cè)，其未解離型式（Ⅰ）僅在低pH 環(huán)境中穩(wěn)定存在。在有關(guān)物質(zhì)色譜項(xiàng)下的pH 環(huán)境中，主要以Ⅱ和Ⅲ兩種型式存在。在不同pH 環(huán)境中，Ⅱ和Ⅲ的比例不同，出峰時(shí)間略有差異，液相色譜圖峰面積比例也發(fā)生顯著變化。當(dāng)流動(dòng)相A 的pH 在2.5～5.0 范圍內(nèi)，液相譜圖中莫沙必利檸檬酰胺始終表現(xiàn)為雙峰，即以Ⅱ和Ⅲ兩種型式存在；隨著流動(dòng)相pH 的升高，型式Ⅲ的峰面積相對(duì)增大，而型式Ⅱ的峰面積相對(duì)減小；當(dāng)流動(dòng)相A 的pH ≥5.5時(shí)，莫沙必利檸檬酰胺液相色譜圖由雙峰變成單峰，此時(shí)2 個(gè)羧酸根已完全解離，主要以解離的型式（Ⅲ）存在。因此，莫沙必利檸檬酰胺在有關(guān)物質(zhì)檢查液相色譜條件下（pH 4.0）顯示雙峰。

2.6 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密量取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液5 mL，置50 mL 容量瓶中，加乙腈-水（40∶60，V/V）定容，搖勻，即得對(duì)照品貯備液；精密量取0.1，0.3，0.6，0.8，1.0，1.5，2.0 mL，分別置10 mL 容量瓶中，加乙腈-水（40∶60，V/V）定容，搖勻，制得系列對(duì)照品溶液。按2.1.1 項(xiàng)下HPLC 條件進(jìn)樣分析，以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，莫沙必利檸檬酰胺質(zhì)量濃度（C，μg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=12 926.72C-926.87（r=0.999 7，n=7）。結(jié)果表明，莫沙必利檸檬酰胺質(zhì)量濃度在0.35～7.00 μg/ mL（相當(dāng)于供試品溶液0.035%～0.70%）范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。根據(jù)線性回歸方程中的斜率，計(jì)算莫沙必利檸檬酰胺校正因子為1.10，在0.9～1.1范圍內(nèi)，可采用不加校正因子的主成分自身對(duì)照法計(jì)算該雜質(zhì)含量。

強(qiáng)制降解試驗(yàn)：稱取樣品細(xì)粉適量（約相當(dāng)于枸櫞酸莫沙必利10 mg），精密稱定，置10 mL容量瓶中，平行5 份，分別進(jìn)行熱降解（80 ℃烘箱下放置48 h，溶劑定容）、酸降解（2 mL 溶劑，1 mL 1 mol/ L HCl，90 ℃加熱30 min，冷卻中和，溶劑定容）、氧化降解（2 mL 溶劑，2 mL 3%H2O2，90 ℃加熱5 min，冷卻，溶劑定容）、堿降解（2 mL溶劑，1 mL 0.1 mol/L NaOH，90 ℃加熱10 min，冷卻中和，溶劑定容）、光降解（溶劑定容，4 500 lx 光照箱中照射64 h）試驗(yàn)。按2.1.1 項(xiàng)下HPLC 條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果表明在該色譜條件下主峰與相鄰雜質(zhì)峰之間的分離度符合要求。

定量限和檢測(cè)限考察：取2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，逐級(jí)稀釋，按2.1.1 項(xiàng)下HPLC 條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以信噪比（S/N）約為3 或10 時(shí)待測(cè)成分的進(jìn)樣量分別作為檢測(cè)限與定量限，結(jié)果莫沙必利檸檬酰胺的檢測(cè)限為0.70 ng，定量限為2.8 ng。

精密度試驗(yàn)：精密量取2.6項(xiàng)下對(duì)照品貯備液0.2，1.0，1.5 mL，分別置10 mL 容量瓶中，加乙腈-水（40∶60，V/V）定容，搖勻，作為精密度20%，100%，150%的供試品溶液，各平行3 份，按2.1.1 項(xiàng)下HPLC條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果莫沙必利檸檬酰胺峰面積的RSD分別為3.96%、0.07%、0.45%（n=3），表明在20%～150% 體積分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)儀器精密度較好。

耐用性考察：取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按2.1.1項(xiàng)下HPLC 條件進(jìn)樣分析。調(diào)節(jié)流動(dòng)相A 的pH 為3.8，4.0，4.2，記錄莫沙必利檸檬酰胺峰面積之和的變化，考察方法耐用性。結(jié)果，流動(dòng)相A 的pH 在3.8～4.2 范圍內(nèi)變化時(shí)，莫沙必利檸檬酰胺雙峰總面積的RSD為0.38%，證明該方法耐用性良好。

2.7 樣品含量測(cè)定

取3批樣品適量，各平行3份，分別按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項(xiàng)下HPLC 條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果批號(hào)170701，170702，170703 樣品中莫沙必利檸檬酰胺含量分別為0.006%，0.005%，0.007%。

3 討論

3.1 雙峰定性

雜質(zhì)檢測(cè)是藥物質(zhì)量控制的關(guān)鍵。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在雜質(zhì)譜分析中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，可推測(cè)藥物中存在的未知雜質(zhì)結(jié)構(gòu)［10-12］。本研究中建立的UPLC-QTOF-MS 法可有效地對(duì)枸櫞酸莫沙必利片有關(guān)物質(zhì)色譜圖中莫沙必利檸檬酰胺的2個(gè)峰進(jìn)行定性研究，可推導(dǎo)出兩個(gè)峰的結(jié)構(gòu)。通過(guò)一級(jí)質(zhì)譜圖可知，兩個(gè)峰的分子量均與莫沙必利檸檬酰胺一致；進(jìn)一步推測(cè)莫沙必利檸檬酰胺可能的裂解途徑，各裂解碎片離子分子量與二級(jí)質(zhì)譜圖中二級(jí)碎片離子分子量相當(dāng)，確定色譜圖中雙峰均為莫沙必利檸檬酰胺峰。

3.2 雙峰分析

從莫沙必利檸檬酰胺結(jié)構(gòu)看，其含有2 個(gè)羧酸基團(tuán)，進(jìn)入液相后，與流動(dòng)相中的鈉離子生成羧酸鈉鹽，羧酸鈉鹽為弱酸強(qiáng)堿鹽，在不同pH 流動(dòng)相中發(fā)生解離，可能存在保留時(shí)間各異的未解離（Ⅰ）、部分解離（Ⅱ）及完全解離（Ⅲ）3 種型式。隨著pH 的改變，各型式之間相互轉(zhuǎn)化，液相色譜圖中各峰面積的比例也發(fā)生顯著變化［13］。確定莫沙必利檸檬酰胺雙峰現(xiàn)象為其羧酸鈉鹽的不完全解離所致，液相譜圖中雙峰為莫沙必利檸檬酰胺的兩種存在型式（Ⅱ和Ⅲ），各型式之間存在解離平衡，在一定pH 條件下可相互轉(zhuǎn)化。這在一定程度上可為“色譜圖中，同一物質(zhì)出現(xiàn)雙峰”的研究提供新的思路。

3.3 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立了枸櫞酸莫沙必利片有關(guān)物質(zhì)檢查的UPLC-Q-TOF-MS 法，并以此對(duì)特定雜質(zhì)莫沙必利檸檬酰胺進(jìn)行研究。采用不加校正因子的主成分自身對(duì)照法能快速、有效地檢出該雜質(zhì)。色譜圖中雙峰均為莫沙必利檸檬酰胺，定量時(shí)以兩個(gè)峰面積之和計(jì)算，不會(huì)影響該雜質(zhì)校正因子計(jì)算和檢測(cè)結(jié)果。因此，本研究可為枸櫞酸莫沙必利片雜質(zhì)研究及其質(zhì)量控制提供參考。