干擾素治療前后慢性乙型肝炎患者外周血淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞表面CD64表達(dá)變化觀察

尚鵬程，許嬌，鐘晶，畢雷

成都市公共衛(wèi)生臨床醫(yī)療中心檢驗(yàn)科，成都 610000

干擾素治療慢性乙型肝炎（CHB，簡稱慢乙肝）較傳統(tǒng)藥物治療有明顯的優(yōu)勢，但仍有許多需要解決的問題，如缺少用于優(yōu)勢人群篩選、療效評估以及預(yù)后評判的有效實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)等［1］。CD64（FcγRI）是一種免疫球蛋白Fc 受體的跨膜糖蛋白，可以高親和力結(jié)合單體IgG 型抗體，在細(xì)菌感染以及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病患者外周血中性粒細(xì)胞表面表達(dá)上調(diào)，作為細(xì)菌感染性疾病的診斷指標(biāo)在臨床已被廣為使用［2-3］。近年研究［4-5］發(fā)現(xiàn)，在巨細(xì)胞病毒以及HBV等感染患者CD64 的表達(dá)與健康人群不同，但CHB患者外周血細(xì)胞表面CD64 表達(dá)量變化與干擾素治療慢乙肝的療效是否有關(guān)目前仍無文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過比較干擾素治療前后慢乙肝患者外周血不同亞群細(xì)胞表面CD64 表達(dá)量差異，分析干擾素治療不同時(shí)間CHB 患者外周血淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞表面CD64 表達(dá)量與HBV-DNA、ALT、HBsAg 的相關(guān)性，為下一步探討外周血淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞表面CD64 表達(dá)量是否能用于評估干擾素治療效果提供參考資料。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2018年6月—2021年3月在成都市公共衛(wèi)生臨床醫(yī)療中心就診的CHB 患者57 例，納入標(biāo)準(zhǔn)：ALT＞2 ULN、HBV-DNA＜2×108IU/mL、HBsAg 定量＜25 000 IU/mL，且接受干擾素單獨(dú)/聯(lián)合/序貫治療的CHB 患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有肝硬化、肝癌、自身免疫性肝病、肝功能失代償、HCV/HIV 感染以及研究資料缺失。按e 抗原表達(dá)不同分為e 抗原陽性組33 例，男18 例、女15 例，年齡（28.5 ± 10.6）歲，ALT （156.9 ± 132.4）U/L、HBsAg （18 976.5 ± 16 981.7）IU/mL、HBV-DNA（6.8 ± 0.75）lgIU/mL；e 抗原陰性組24 例，男15 例、女9 例，年齡（34.1 ± 13.9）歲，ALT （106.3 ±100.5）U/L、HBsAg（15 643.9 ± 16 324.3）IU/mL、HBV-DNA （5.8 ± 1.5）lgIU/mL；兩組間性別、年齡、ALT、HBsAg以及HBV-DNA差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。收集同期體檢健康人員16例為對照組，男10 例、女6 例，年齡（34.7 ± 12.2）歲。三組年齡性別有可比性。

1.2 外周血淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞表面CD64 檢測 CHB 患者在干擾素治療前，治療8 周、12 周、24周和48 周時(shí)，取晨起空腹EDTA-K2抗凝外周靜脈血50 μL，依次加入試劑（CD3-FITC、CD64-PE、CD14-ECD、CD45-PECY5.5，購自貝克曼庫爾特）各5 μL，混勻后避光孵育15 min，加300 μL 紅細(xì)胞裂解液，避光作用15 min，加300 μL 生理鹽水混勻后上貝克曼庫爾特DxFlex 流式細(xì)胞儀檢測。在SSC-CD45 圖上設(shè)置中性粒細(xì)胞門和淋巴細(xì)胞門、在CD14-CD45圖上設(shè)置單核細(xì)胞門，在CD64-CD45 圖上分析上述三群細(xì)胞表面CD64表達(dá)量。

1.3 外周血ALT、HBsAg、HBeAg 和HBV-DNA 的檢測 CHB 患者在干擾素治療前、8 周、12 周、24 周和48 周時(shí)，分別檢測ALT、HBsAg、HBeAg 和HBVDNA。其中，ALT 采用丙氨酸底物法，使用日立Cobas008As全自動生化分析儀及其配套試劑；HBsAg、HBeAg 采用化學(xué)發(fā)光法，使用萬泰全自動化學(xué)發(fā)光分析儀CARIS200及其配套試劑；HBV-NDA 采用Rt-PCR 法，使用廈門安普利全自動核酸提純及熒光PCR分析系統(tǒng)及其配套試劑。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.02 統(tǒng)計(jì)軟件。正態(tài)性分析采用Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用±s表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Tukey 法；計(jì)數(shù)資料用頻次或百分比表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組干擾素治療不同時(shí)間外周血淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞表面CD64 的表達(dá)量比較 干擾素治療前，CHB 組外周血淋巴細(xì)胞表面CD64 和中性粒細(xì)胞表面CD64 表達(dá)量高于對照組，t值依次為3.318、3.149，P均＜0.05。e抗原陽性組、e抗原陰性組以及對照組間淋巴細(xì)胞表面CD64 表達(dá)量比較，F(xiàn)=3.413，P＜0.05，其中e 抗原陽性組與對照組，e 抗原陰性組與對照組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）；而e 抗原陽性組與e 抗原陰性組間比較，P＞0.05。e 抗原陽性組、e 抗原陰性組以及對照組間中性粒細(xì)胞表面CD64 表達(dá)量比較，F(xiàn)=6.591，P均＜0.05，其中e抗原陽性組與對照組，e抗原陽性組與e抗原陰性組間比較，P均＜0.05；e抗原陰性組與對照組比較，P＞0.05。

與干擾素治療前相比，淋巴細(xì)胞表面CD64 表達(dá)量在CHB 患者中逐漸降低且24 周和48 周水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為1.532 0、0.979 9、3.717 0、10.500 0，P分別為0.146 3、0.346 5、0.002 1、＜0.000 1）；在e抗原陽性組（t分別為0.401 5、1.149 0、2.764 0、5.317 0，P分別為0.692 1、0.265 5、0.003 4、＜0.000 1）和e 抗原陰性組也存在同樣趨勢（t分別為0.755 1、0.796 6、1.411 0、13.260 0，P分別為0.334 1、0.470 3、0.231 1、0.000 2）。中性粒細(xì)胞表面CD64 表達(dá)量在CHB 組（t分別為0.423 1、1.101 0、1.498 0、5.321 0，P分別為0.653 2、0.224 5、0.148 7、＜0.000 1）、e抗原陽性組（t分別為0.826 1、1.152 0、1.939 0、5.072 0，P分別為0.421 7、0.271 8、0.071 6、0.000 2）和e抗原陰性組（t分別為0.280 5、0.242 6、0.474 6、1.922 0，P分別為0.793 0、0.820 3、0.659 8、0.127 0）中也呈現(xiàn)遞減趨勢，但僅在48 周時(shí)，CHB 組和e 抗原陽性組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。干擾素治療不同時(shí)間各組淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞CD64表面表達(dá)量見表1。

表1 干擾素治療不同時(shí)間各組淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞表面CD64表達(dá)量（±s）

表1 干擾素治療不同時(shí)間各組淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞表面CD64表達(dá)量（±s）

組別CHB組淋巴細(xì)胞表面CD64中性粒細(xì)胞表面CD64治療前治療8周治療12周治療24周治療48周e抗原陽性組912.73 ± 103.22 860.79 ± 101.88 874.92 ± 173.85 608.42 ± 293.79 272.65 ± 26.27 3 314.40 ± 945.73 3 480.55 ± 944.66 2 765.05 ± 851.52 2 547.48 ± 943.62 1 190.61 ± 306.75治療前治療8周治療12周治療24周治療48周e抗原陰性組913.91 ± 116.78 834.12 ± 65.64 903.00 ± 197.79 556.16 ± 283.96 280.22 ± 29.48 3 443.73 ± 828.91 3 764.39 ± 617.03 2 809.42 ± 924.18 2 366.09 ± 891.47 1 247.29 ± 305.85治療前治療8周治療12周治療24周治療48周對照組909.50 ± 65.14 940.79 ± 184.49 832.79 ± 191.65 721.98 ± 289.70 257.53 ± 12.56 814.80 ± 71.25 2 958.75 ± 985.94 2 629.05 ± 1 552.30 2 698.49 ± 1 085.07 3 635.81 ± 943.00 1 077.24 ± 388.94 2427.00 ± 742.70

2.2 CHB 患者外周血淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞表面CD64 表達(dá)量與ALT、HBV-DNA、HBsAg 水平的相關(guān)性 CHB 患者干擾素治療前、治療后8、12、24、48周外周血HBV-DNA、ALT、HBsAg 水平見表2。CHB 患者淋巴細(xì)胞表面CD64 表達(dá)量與外周血ALT 和HBsAg 水平存在正相關(guān)性（r分別為0.882 3、0.909 8，P均＜0.05）；中性粒細(xì)胞表面CD64表達(dá)量與外周血ALT和HBsAg水平亦存在正相關(guān)性（r分別為0.899 3、0.902 4，P均＜0.05）。

表2 CHB患者干擾素治療前、治療后8、12、24、48周外周血HBV-DNA、ALT、HBsAg水平（±s）

表2 CHB患者干擾素治療前、治療后8、12、24、48周外周血HBV-DNA、ALT、HBsAg水平（±s）

治療時(shí)間治療前治療8周治療12周治療24周治療48周ALT（U/L）147.2 ± 128.3 119.3 ± 96.8 79.3 ± 68.9 45.2 ± 36.2 16.9 ± 13.3 HBsAg（IU/mL）17827.1 ± 16 981.7 13875.4 ± 11 827.9 10004.5 ± 9 876.2 4293.6 ± 4 018.3 429.3 ± 365.3 HBV-DNA（lgIU/mL）6.5 ± 1.1 4.4 ± 1.3 3.3 ± 1.4 3.2 ± 1.3 2.5 ± 0.8

3 討論

CHB 是HBV 感染慢性化后引起的以肝臟慢性炎癥反應(yīng)為特征的消化系統(tǒng)疾病，是引起肝硬化和肝細(xì)胞癌的重要原因。由于感染HBV 后肝細(xì)胞核內(nèi)形成的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）使得HBV 感染后難以完全根除。目前以核苷類似物和干擾素治療為代表的抗病毒治療可以實(shí)現(xiàn)長期抑制病毒甚至達(dá)到臨床治愈的目標(biāo)。干擾素治療CHB 可以提高HBsAg 清除率和HBeAg 血清轉(zhuǎn)換率。雖然HBsAg 定量用于指導(dǎo)干擾素治療已寫入多個(gè)指南，但在HBsAg 定量臨床應(yīng)用時(shí)仍有許多問題亟需解決，如預(yù)測停用核苷類藥物HBsAg 血清清除的起始治療時(shí)血清HBsAg 濃度和監(jiān)測頻率、預(yù)測HBsAg 清除1年后發(fā)生HBeAg 清除的HBsAg 濃度等。此外，在干擾素治療CHB 優(yōu)勢患者的篩選和過程中治療方式的調(diào)整以及治療結(jié)束后患者遠(yuǎn)期療效的判斷等方面需要有更精確的檢測指標(biāo)。近年研究［6］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)c-FcγR 相互作用在抗體介導(dǎo)的病毒清除中起關(guān)鍵作用，通過對該途徑的進(jìn)一步研究有助于發(fā)現(xiàn)病毒性感染疾病治療的新策略。

CD64即FcγRI型，對IgGFc有高親和性，可以促進(jìn)樹突狀細(xì)胞抗原交叉提呈和T 細(xì)胞活化，介導(dǎo)體內(nèi)的ADCC 以及有助于IgG 依賴的中和作用等。研究［7］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)cγRI可以觸發(fā)各種過敏性和自身免疫性疾病的模型，如過敏反應(yīng)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或氣道炎癥。本研究發(fā)現(xiàn)，CHB 患者外周血淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞表面CD64 表達(dá)量上調(diào)，與FENG 等［8］報(bào)道結(jié)果一致，推測CHB患者在HBV特異抗體的介導(dǎo)下通過上調(diào)CD64 表達(dá)，啟動天然和適應(yīng)免疫的多種機(jī)制（抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、補(bǔ)體溶解或吞噬作用），以清除HBV病毒。

通過分析HBeAg 表達(dá)不同CHB 患者外周血淋巴細(xì)胞表面CD64的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)e抗原陽性組、e抗原陰性組以及對照組間淋巴細(xì)胞表面CD64 的表達(dá)量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。接下來通過對三組間淋巴細(xì)胞表面CD64 表達(dá)量的比較，發(fā)現(xiàn)e 抗原陽性組與對照組，e 抗原陰性組與對照組間均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，e抗原陽性組患者外周血淋巴細(xì)胞表面CD64 表達(dá)量高于e抗原陰性組患者，推測e抗原陽性組患者免疫系統(tǒng)通過上調(diào)淋巴細(xì)胞表面CD64 表達(dá)，利用Fc-FcγR 軸觸發(fā)對HBV 更強(qiáng)的免疫反應(yīng)，能更有效地清除HBV 感染的靶細(xì)胞。而淋巴細(xì)胞表面CD64 表達(dá)量在e 抗原陽性組與e 抗原陰性組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與機(jī)體免疫反應(yīng)較e 抗原的陰轉(zhuǎn)延遲有關(guān)，也有可能與研究對象的數(shù)量較少有關(guān)。對e 抗原表達(dá)不同CHB 患者外周中性粒細(xì)胞表面CD64 表達(dá)量進(jìn)行分析，也發(fā)現(xiàn)e 抗原陽性組的中性粒細(xì)胞表面CD64 高于e 抗原陰性組和對照組，提示e 抗原陽性組患者粒細(xì)胞CD64 表達(dá)上調(diào)，增強(qiáng)粒細(xì)胞及其產(chǎn)物分子誘導(dǎo)機(jī)體對乙肝病毒的適應(yīng)性免疫應(yīng)答，CD64 分子介導(dǎo)的機(jī)體對HBV 免疫應(yīng)答的具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

對干擾素治療不同時(shí)間的淋巴細(xì)胞表面CD64和中性粒細(xì)胞表面CD64 表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)，隨著療程延長，淋巴細(xì)胞表面CD64 和中性粒細(xì)胞表面CD64 表達(dá)量都呈現(xiàn)出下降趨勢，并且與HBsAg 和ALT 均相關(guān)，其中淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞表面CD64與HBsAg 的相關(guān)性與淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞表面CD64 與ALT 相當(dāng)。另外，與干擾素治療前比較，淋巴細(xì)胞表面CD64 表達(dá)量在干擾素治療24 周時(shí)下降，中性粒細(xì)胞表面CD64 表達(dá)量在干擾素治療48周時(shí)下降，提示淋巴細(xì)胞表面CD64 較中性粒細(xì)胞表面CD64 可能更適合用于干擾素療效的評估，其具體應(yīng)用價(jià)值還有待進(jìn)一步研究。淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞表面CD64 與HBV-DNA 未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)性，由于抗病毒治療后HBV-DNA 在4 周時(shí)迅速下降而淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞表面CD64 則分別在24 周和48周時(shí)下降，提示病原學(xué)指標(biāo)較免疫學(xué)指標(biāo)變化快。

綜上所述，CHB 患者外周血淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞表面CD64 表達(dá)量升高，干擾素治療后淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞表面CD64 表達(dá)量下降；淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞表面CD64 表達(dá)量與HBsAg 和ALT 水平正相關(guān)。由于本研究納入的研究對象數(shù)量較少，其結(jié)果對CHB 患者外周血細(xì)胞表面CD64 指導(dǎo)干擾素臨床應(yīng)用的價(jià)值有限，下一步將擴(kuò)大樣本量，觀察干擾素治療不同時(shí)間CHB 患者外周血淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞表面CD64 表達(dá)量，同時(shí)探討CHB 患者外周血細(xì)胞表面CD64 表達(dá)量對干擾素治療CHB 效果的評估效能。