PDZK1基因啟動子區(qū)rs12129861位點基因多態(tài)性與新疆漢族男性人群痛風發(fā)病的關系

何爽，夏依代·圖爾蓀，孫紅光，劉璐，葉飛，王宇婷，李瑞，苗蕾

1 新疆醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，烏魯木齊830000；2 新疆醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院；3 新疆生產建設兵團疾控中心；4 新疆醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院

痛風是一種炎癥性關節(jié)炎，由于血清尿酸（SUA）水平過高，導致關節(jié)內尿酸鈉結晶沉積從而引發(fā)的炎癥性疾?。?］。近年痛風患病率正在逐漸升高［2］，有資料顯示，中國部分地區(qū)的痛風患病率已達2.6%［3］。在所有國家中男性的痛風患病率明顯高于女性，是女性的2～6 倍［4］。痛風受到眾多因素的影響，除了已知的環(huán)境因素如高嘌呤飲食、飲酒和吸煙外，遺傳因素也參與痛風的發(fā)生，識別遺傳因素對于提高痛風的病因診斷和治療是必要的［5］。全基因組關聯(lián)分析（GWAS）研究［6］表明，普通人群的痛風發(fā)展與常見的基因突變有關。單核苷酸多態(tài)性（SNP）是人類可遺傳變異中最為常見的一種，在所有已知的可遺傳變異中占比高達90%，在多因素疾病研究中具有重要意義。大量的研究發(fā)現了與痛風疾病發(fā)病存在相關的許多SNP［7］。

PDZ 蛋白激酶1（PDZK1）是一種已在腎臟、肝臟、小腸和腎上腺皮質中發(fā)現的細胞骨架蛋白，其并不直接參與血尿酸的轉運，而是與許多尿酸轉運蛋白相互作用以控制尿酸轉運［8-9］。人PDZK1 基因位于lq21，存在多個SNP 位點，某些功能性位點的變異可以影響PDZK1 蛋白的表達。rs12129861 位點位于PDZK1 基因上游約2 kb，可能會影響PDZK1的基因表達水平，不同個體rs12129861 基因型的不同可能導致尿酸鹽轉運體轉運效率的不同［10］。GWAS 顯示，，尿酸濃度的個體差異可能使得PDZK1 基因產生變異，從而導致個體間痛風發(fā)病率的不同［10］。以上提示PDZK1 基因啟動子區(qū)rs12129861 位點可能與痛風發(fā)病相關，可能通過影響尿酸轉運體的功能導致尿酸轉運效率的差異。新疆烏魯木齊市漢族男性痛風是否與PDZK1 基因啟動子區(qū)rs12129861 位點的SNP 有關目前仍未見報道，本研究以新疆烏魯木齊市301 例漢族男性痛風患者與514 例漢族男性體檢健康人群作為研究對象，對PDZK1 基因啟動子區(qū)rs12129861（A/G）位點等位基因和基因型分布頻率進行分析，并比較了所有研究對象中不同基因型人群的尿酸濃度，以明確rs12129861（A/G）位點SNP 多態(tài)性是否與痛風發(fā)生存在關聯(lián)，并采用雙熒光素酶報告基因實驗證實啟動子區(qū)rs12129861（A/G）位點是否影響熒光素酶基因的表達。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2018—2020年在新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院、新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院、新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院就診的漢族男性痛風患者301 例（痛風組），年齡（47.64 ± 12.48）歲，入選者符合國際風濕病學會（ACR）2015年制定的痛風分類標準；同時選擇同時期在上述三家醫(yī)院體檢的男性體檢健康者514 例（對照組），年齡（46.15 ± 13.15）歲，兩組間年齡差異無統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。痛風組尿酸（512.85 ± 134.00）μ mol/L、葡萄糖（5.82 ± 1.86）mmol/L、尿素氮（5.72 ±3.68）mmol/L、肌酐（96.22 ± 54.28）μmol/L、甘油三酯（1.99 ± 1.53）mmol/L、總膽固醇（4.57 ±1.11）mmol/L，收縮壓（125.56 ± 13.34）mmHg、舒張壓（81.11 ± 11.12）mmHg。對照組尿酸（344.70 ±55.05）μmol/L、葡萄糖（5.34 ± 1.19）mmol/L、尿素氮（5.83 ± 15.27）mmol/L、肌 酐（85.90 ±13.00）μmol/L、甘油三酯（1.71 ± 1.17）mmol/L、總膽固醇（4.65 ± 0.89）mmol/L，收縮壓（124.66 ±13.31）mmHg、舒張壓（76.25 ± 9.51）mmHg。痛風組尿酸、葡萄糖、肌酐、甘油三酯以及舒張壓值高于對照組（P均＜0.05），兩組尿素氮、總膽固醇以及收縮壓相比較，P均＞0.05。本次研究經新疆醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院倫理委員會批準，所有受試者在納入研究前均給予知情同意。

1.2 PDZK1 基因啟動子區(qū)rs12129861 位點基因型分析 采用多重熒光PCR 法。研究對象禁食12 h后于清晨采集空腹靜脈血2 mL，EDTA 抗凝，采用全血基因組DNA 提取試劑盒（北疆百泰克公司）提取DNA，使用紫外分光光度儀進行定量，瓊脂糖凝膠電泳進行質量檢測，質檢合格的樣本稀釋至50 ng/μL，放于-80 ℃冰箱保存。在NCBI 數據庫中查詢到rs12129861（A/G）位點的序列信息，利用Primer 6.0 軟件設計引物，由上海天昊公司合成。上游引物序列：5′-GCTGTTGTTGTTGTTGTTG-3′，下游引物序列：5′-GGCAGGAGAATCACTTGAA-3′。PCR 反應條件：在20 g/L 瓊脂凝膠電泳中，95 ℃2min→94 ℃ 20 s→65 ℃ 40 s→72 ℃ 1.5 min，共11個循環(huán)，94 ℃ 20 s→59 ℃ 30 s→72 ℃ 1.5 min，24 個循環(huán)，72 ℃ 2 min。擴增結束后，由上海天昊公司采用SNP 分型技術對所有樣本進行rs12129861（A/G）位點基因多態(tài)性及基因的分型分析。

1.3 PDZK1 基因啟動子區(qū)rs12129861（A/G）位點活性的檢測 采用雙熒光素酶報告基因實驗。查閱NCBI 數據庫，得到rs12129861 位點的序列具體信息，采用基因合成法合成基因，然后以合成基因為模板進行基因擴增得到長度大約為1 013 bp 的DNA片段?；驍U增反應條件：95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，55 ℃、2 min，72 ℃、1 min，25個循環(huán)?；驍U增后的產物和pGL3-promotor 質粒用T4DNA 連接酶（TaKa-Ra 公司）置于16 ℃連接0.5～1 h，獲得pGL3-rs12129861（A/G）-promotor 重組質粒。將重組質粒加入裝有TOP10 感受態(tài)細胞的離心管中，在管中加入SOC 液體培養(yǎng)基使細胞復蘇、表達PDZK1 基因rs12129861 位點，然后接種到LB 培養(yǎng)基（含Ap 抗生素）上。培養(yǎng)12～16 h 后篩選菌落進行基因擴增驗證，對目的基因序列進行基因測序，結果證明重組質粒構建成功。將胰酶消化過的HEK293T 細胞用10% DMEM 完全培養(yǎng)基按照每孔0.5×105～2×105個細胞的密度接種在24 孔細胞板上，于含5% CO2的37 ℃溫箱中孵育8～24 h，細胞完全貼壁后可開始瞬時轉染。將1 μg 的rs12129861 位點質粒和200 ng內參照pRL-TK（海腎熒光素酶報告載體）以及2.4 μL TurboFect 混合，加入到200 μL Opti-Medium內，室溫孵育15 min。按照TurboFect 試劑盒（Ther-mo 公司）說明書，配制TurboFect-DNA Mix，將其加入到上述含有單層HEK293T 細胞的培養(yǎng)基中，輕搖混勻，繼續(xù)孵育。37 ℃孵育8～12 h 后，換成含有血清且已經經過37 ℃預熱的培養(yǎng)基。共轉48 h 后，收集細胞，進行熒光素酶活性檢測。每個孔用磷酸鹽緩沖液漂洗細胞1 次后，加入100 μL 裂解液裂解15 min。每個酶標板孔內20 μL 裂解液以及100 μL熒光素酶檢測試劑Ⅱ（PROMEGA 公司），用酶標儀記錄測定值；加入熒光素酶湮滅劑100 μL，記錄測定值。以海腎熒光素酶（Ranilla luciferase）作內參照，消除實驗操作帶來的變化因素，增加可比性。兩次數值的比值為熒光素酶相對活性，重復實驗3次，取平均值。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Dunnett-t檢驗；計數資料用頻次或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗；利用Hardy-Weinberg 平衡性檢驗確認此次所采樣本的群體代表性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PDZK1 基因啟動子區(qū)rs12129861（A/G）位點的基因型和基因頻率與新疆地區(qū)漢族男性人群痛風發(fā)病的關系

2.1.1 痛風組與對照組PDZK1 基因啟動子區(qū)rs12129861（A/G）位點的基因型和基因頻率比較PDZK1 基因啟動子區(qū)rs12129861（A/G）位點基因型分布符合Hardy-Weinberg 平衡性檢驗，該位點在新疆地區(qū)漢族人群中達到穩(wěn)定遺傳狀態(tài)，具有代表性（χ2=0.427，P＞0.05）。痛風組 PDZK1 基因rs12129861（A/G）位點AA、GA、GG 基因型分別有6例（1.99%）、80 例（26.58%）、215 例（71.43%）。對照組PDZK1 基因 rs12129861（A/G）位點AA、GA、GG 基因型分別有24 例（4.67%）、189 例（36.77%）、301 例（58.56%）。兩組間AA、GA、GG 基因型分布頻率的差異有統(tǒng)計學意義（χ2=14.633，P＜0.01）。痛風組等位基因A 頻次為 92（27.96%），等位基因G 頻次為237（72.04%）；對照組等位基因A 頻次為510（41.50%），等位基因G 頻次為719（58.50%）。PDZK1 基因啟動子區(qū)rs12129861（A/G）位點等位基因A 和G 在兩組間的分布頻率差異具有統(tǒng)計學意義，痛風組等位基因G 頻次高于對照組（χ2=14.236，P＜0.01）。攜帶G 等位基因的個體患痛風的OR值為1.661（95%CI：1.274～2.165），攜帶A 等位基因的個體患痛風的OR值為0.602（95%CI：0.462～0.785）。

2.1.2 PDZK1 基因 rs12129861（A/G）位點不同基因型分組的一般性臨床指標比較 血清尿酸濃度在不同基因型分組間的差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.011），經兩兩比較后發(fā)現，A/A 組與G/G 組間、G/A組與G/G組間血清尿酸濃度的差異具有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），其中G/G組血尿酸濃度大于其余兩組。葡萄糖、尿素氮、肌酐、甘油三酯、總膽固醇、收縮壓、舒張壓在各組間的差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05），見表1。

基因型A/A G/A G/G尿酸（μmol/L）369.11 ± 89.58 392.94 ± 125.23 415.763 ± 122.33葡萄糖（mmol/L）5.50 ± 1.65 5.46 ± 1.28 5.56 ± 1.61尿素氮（mmol/L）5.22 ± 1.79 6.50 ± 21.14 5.42 ± 2.79肌酐（μmol/L）89.02 ± 37.07 88.32 ± 18.05 90.21 ± 40.70甘油三酯（mmol/L）2.00 ± 1.50 1.78 ± 1.16 1.79 ± 1.27總膽固醇（mmol/L）4.77 ± 0.84 4.67 ± 0.96 4.58 ± 0.99收縮壓（mmHg）125.93 ± 16.75 125.36 ± 12.78 124.57 ± 13.11舒張壓（mmHg）77.07 ± 10.11 77.94 ± 9.28 77.86 ± 10.68

2.2 PDZK1 基因啟動子區(qū)rs12129861（A/G）位點的基因型和基因頻率與新疆地區(qū)漢族男性人群痛風發(fā)病關系的驗證 pGL3-rs12129861（G）-promotor重組質粒熒光素酶相對活性為5.046，pGL3-rs12129861（A）-promotor 重組質粒熒光素酶相對活性為9.160。與pGL3-promotor 空載質粒比較，目的序列rs12129861 含G、A 等位基因的重組質粒熒光素酶相對活性分別是pGL3-promotor 的5.001 倍（P＜0.01）和9.078 倍（P＜0.01），pGL3-rs12129861（A）-promotor 重組質粒熒光素酶相對活性是pGL3-rs12129861（G）-promotor 重組質粒熒光素酶相對活性的1.815倍（P＜0.01）。

3 討論

目前痛風的病因涉及多種因素，包括細胞因子、易感基因和基因突變，但其確切的發(fā)病機制尚未闡明。痛風遺傳模式十分復雜，盡管在對發(fā)病機制和治療進展的理解上取得了重大進展，但痛風的發(fā)病率仍在增加，許多患者的疾病控制不佳［11］。環(huán)境和遺傳因素均可影響痛風的發(fā)生和發(fā)展。GWAS 表明，常見的基因突變使一般人群更易患痛風［12］?；虮磉_調控可以在不同水平、多個階段進行，曾有一項GWAS 研究系統(tǒng)地評估與疾病病因有關的常見（＞1%患病率）遺傳變異的基因組［13］，這些變異基因的作用通常較弱，大多數通過調節(jié)基因表達、轉錄穩(wěn)定性和轉錄處理發(fā)揮作用，但調控基因表達最有效的方法是在轉錄水平進行。多項流行病學研究顯示，遺傳因素在原發(fā)性痛風中具有重要作用，并且已經發(fā)現20 多個遺傳易感位點［14］，PDZK1 就是其中之一。有GWAS顯示PDZK1 基因rs12129861 位點與尿酸水平相關。rs12129861 位于PDZK1 基因上游約2 kb 處屬于基因啟動子區(qū)，可能影響PDZK1 的基因表達水平?；騿幼訁^(qū)是參與特定基因轉錄及其調控的DNA 序列［14］，包含第一外顯子上游的核心啟動子區(qū)、較遠端的調節(jié)啟動子區(qū)、遠端調控序列（增強子與抑制子）及基因間的邊界元件或隔離成分（隔離子），是調控靶基因轉錄的重要區(qū)域，但并不編碼蛋白。變異的基因啟動子區(qū)可能會通過影響靶基因蛋白的表達，從而改變了靶基因在人體中顯示出的生物學功能，我們前期已經通過查閱NCBI 數據庫篩選出候選基因并利用SNP 分型實驗對可能影響候選基因表達的SNP 位點進行了檢測，本研究中需要進行驗證的陽性位點就出自我們已經篩選建立出的SNP 位點數據庫。

痛風是一種由尿酸水平升高引起的常見關節(jié)炎疾病，尿酸水平升高是痛風的一個重要獨立危險因素。PDZK1 基因已被確定與尿酸濃度有關，PDZK1作為支架蛋白并不直接參與血尿酸轉運，而是通過調控多個轉運蛋白對尿酸排泄產生影響，因此如果影響了PDZK1 蛋白的表達那么很可能會影響尿酸濃度從而影響痛風的發(fā)生。目前已知PDZK1 能夠與尿酸鹽陰離子轉運蛋白1（URAT1）和腎臟尿酸分泌轉運蛋白鈉離子依賴磷酸鹽轉運體1（NPT1）相互作用影響血尿酸水平。URAT1 由SLC22A 家族中的SLC22A12 基因編碼，被認為是介導腎臟近端小管頂端側尿酸鹽重吸收的重要分子［15］。SLC17A1編碼的NPT1 通過鈉離子的協(xié)同作用將尿酸從腎小管上皮細胞頂面轉運至細胞外，是負責尿酸排泄的轉運蛋白之一。

本研究PDZK1基因啟動子區(qū)rs12129861（A/G）位點基因型分布符合Hardy-Weinberg 平衡性檢驗，說明該位點在新疆地區(qū)漢族人群中達到穩(wěn)定遺傳狀態(tài)，具有代表性。本研究還發(fā)現PDZK1 基因啟動子區(qū)rs12129861的基因型分布頻率和等位基因分布頻率在痛風組和對照組之間的差異具有統(tǒng)計學意義，其中G等位基因在痛風組分布的頻率為72.04%，在對照組的分布頻率為58.5%，差異具有統(tǒng)計學意義，攜帶G 等位基因的個體患痛風的OR值為1.661。在不同基因型分組下，G/G 基因型組尿酸的濃度最高，與其他組相比差異具有統(tǒng)計學意義。以上結果表明PDZK1 基因啟動子區(qū)rs12129861（A/G）位點SNP 可能與新疆地區(qū)漢族男性人群的痛風有一定的關系，G 等位基因可能是痛風發(fā)病的危險因素。在此基礎上利用雙熒光素酶報告實驗的方法，檢測PDZK1 基因啟動子區(qū)rs12129861 位點對熒光素酶基因表達活性的影響。結果顯示與空載質粒（含Sv40 啟動子）相比，rs12129861（A/G）位點具有增強子功能，能檢測到熒光強度（P＜0.05）。此外，rs12129861 位點含等位基因G 重組質粒的熒光素酶報告基因的表達水平與含等位基因A 重組質粒相比顯著降低。因此含有G 等位基因的rs12129861 位點的增強子活性較低，這有可能導致PDZK1 蛋白表達減少，從而降低尿酸轉運率使得患痛風的風險增加，這與基因頻率分布比較的結果相一致。

綜上，PDZK1 基因啟動子區(qū)rs12129861 位點的SNP 可能與新疆地區(qū)漢族男性人群痛風發(fā)病有關，且?guī)в械任换騁 的個體痛風患病風險更高。但本次研究仍有許多不足之處，由于rs12129861位點屬于PDZK1 基因啟動子區(qū)并不能編碼蛋白只能調控基因轉錄，因此并不一定能影響PDZK1 蛋白最終的表達，我們尚未發(fā)現痛風組患者與對照組人群的PDZK1 蛋白濃度之間的差異。有研究顯示可溶性尿酸升高可以增加PDZK1 的表達［16］，當痛風患者體內血清尿酸濃度增加，為了轉運多余的尿酸，轉運蛋白URAT1 和NPT1 表達增加，作為有調控作用的支架蛋白PDZK1 蛋白的濃度反而可能升高，這為我們此后的研究提供了新的方向和思路。