外源添加物對海雜魚魚糜凝膠特性的影響

梁光燦，范鑫，袁方，陸瑞琪，卞忠明，劉苗苗，張歡*，曹云剛*

（1.陜西科技大學 食品與生物工程學院，陜西 西安 710021；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；3.江蘇一鳴生物股份有限公司，江蘇 泰興 225400）

海雜魚是從海中捕撈的各種非養(yǎng)殖水產(chǎn)魚類的總稱，通常為海魚的一些常見品種，如梭魚、小鯧魚、刺兒魚、鱸魚、愣蹦魚、鰨目尖（即小鰨目魚）、小黃魚、小黃花魚、黑頭等，它們不僅含有大量的優(yōu)質(zhì)動物蛋白和卵磷脂，還具有多種人體所需的微量元素，營養(yǎng)豐富。然而，海雜魚普遍個頭偏小、品種混雜、刺多肉薄，導致消費者對其鮮銷的接受度并不高。因此，利用魚糜加工和重組技術，將大量海雜魚加工成魚糜及魚糜制品可以有效提高海雜魚的附加值，解決其量多價廉的問題。

魚糜是一種低脂肪、低膽固醇、易被消化吸收的肌原纖維蛋白濃縮物[1]，在水產(chǎn)食品加工中占有重要地位[2]。但是，某些海水魚類制成的魚糜，特別是一些海雜魚混合制作成的魚糜，它們的凝膠特性普遍較差。因此，選擇合適的添加劑或技術來改善此類魚糜的凝膠性能與品質(zhì)是目前研究的熱點。有研究表明，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（transglutaminase，TGase）可以促進魚糜蛋白質(zhì)分子之間形成ε（γ-谷氨酰）賴氨酸共價鍵，增強魚糜凝膠的彈性和緊實度[3-5]；蛋清蛋白粉具有良好的成膠能力，可以促使魚糜中水分、脂肪和肌肉蛋白等成分形成穩(wěn)定均勻的體系，繼而提升魚糜的凝膠強度和持水性[6-7]。Jafarpour等[8]研究指出與未添加蛋清蛋白的對照組相比，添加3%蛋清蛋白的鯉魚糜凝膠的斷裂力和斷裂距離分別提高了41%和31%。復合磷酸鹽可以使魚糜凝膠的pH值偏離其等電點，同時還具有解離肌動球蛋白的作用，能夠增強魚糜的持水性和彈性[9]。

鑒于此，本研究以海雜魚為主要原料，選擇外源添加物TGase、蛋清蛋白粉以及復合磷酸鹽的添加量為單因素，根據(jù)Box-Behnken設計原理，以海雜魚魚糜凝膠強度為響應值，采用響應面優(yōu)化法優(yōu)化海雜魚魚糜的凝膠性能，同時對外源添加物作用機理進行初步探究，以期為高品質(zhì)海雜魚魚糜的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷凍海雜魚魚糜、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（酶活100IU/g）：江蘇一鳴生物股份有限公司；蛋清蛋白粉：河南萬邦化工科技有限公司；食鹽、復合磷酸鹽（焦磷酸鈉:三聚磷酸鈉=1:1）、白砂糖：市售；戊二醛（C5H8O2）、乙醇（C2H6O）、叔丁醇（C4H10O）：天津市天力化學試劑有限公司，所用試劑均為分析純及以上純度。

HR/T20MM立式高速冷凍離心機：湖南赫西儀器裝備有限公司；TA.Plus物性測試儀：英國Stable Micro System公司；Haake mars 60型流變儀：美國賽默飛世爾科技公司；NMI20-040V-I低場核磁共振分析儀：蘇州紐邁分析儀器股份有限公司；FEI Q45+EDAX Octane Prime環(huán)境掃描電子顯微鏡：美國FEI公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

海雜魚魚糜解凍（4℃，8 h～10 h）→斬拌（空斬1 min；添加1.5%NaCl斬拌2 min；加入其他配料斬拌5 min）→模具成型（型號50 mm×20 mm）→二段式加熱（40℃水浴加熱30 min，90℃水浴加熱20 min）→冰水冷卻（1 h）→4℃放置過夜→測定凝膠性質(zhì)。

1.2.2 單因素試驗

1.2.2.1 TGase添加量對魚糜凝膠性能的影響

取100 g魚糜，分別添加3%冰水、8%白砂糖、4.0%蛋清蛋白粉、0.25%復合磷酸鹽和不同添加量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%） 的TGase充分攪拌，二段式加熱制備魚糜凝膠，冷卻至室溫后放入冷藏溫度（4℃）下貯藏，測定不同TGase添加量的魚糜凝膠性能。

1.2.2.2 蛋清蛋白粉添加量對魚糜凝膠性能的影響

取100 g魚糜，分別添加3%冰水、8%白砂糖、0.3%TGase、0.25%復合磷酸鹽和不同添加量（0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%）的蛋清蛋白粉進行攪拌，二段式加熱制備魚糜凝膠，測定不同蛋清蛋白粉添加量的魚糜凝膠性能。

1.2.2.3 復合磷酸鹽添加量對魚糜凝膠性能的影響

取100 g魚糜，分別添加3%冰水、8%白砂糖、0.3%TGase、4.0%蛋清蛋白粉和不同添加量（0%、0.15%、0.25%、0.35%、0.45%）的復合磷酸鹽并充分攪拌，二段式加熱制備魚糜凝膠，測定不同復合磷酸鹽添加量的魚糜凝膠性能。

1.2.3 響應面優(yōu)化設計

利用Design-Expert 8.0.6軟件，根據(jù)Box-Behnken設計原理，以海雜魚糜凝膠強度為響應值，進行三因素三水平共17個點響應面優(yōu)化試驗，因素與水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.4 魚糜凝膠性能的測定

1.2.4.1 魚糜凝膠強度的測定

1.2.4.2 魚糜凝膠持水性測定

將魚糜凝膠樣品切成圓柱，質(zhì)量記為M1（g），用濾紙包裹置于離心管中，3 000×g離心10 min，稱其質(zhì)量記為M2（g），每組測量平行3次，試驗重復3次，取平均值。魚糜凝膠性持水性按式（1）進行計算。

1.2.4.3 魚糜凝膠質(zhì)構的測定

參考Petcharat等[11]的方法并略作修改。采用質(zhì)地剖面分析（texture profile analysis，TPA）法，將魚糜凝膠切成2 cm×2 cm×2 cm的正方體塊狀，放置于平板上進行質(zhì)構測定。測定參數(shù)設置：測前、測中、測后速率均為1 mm/s；下壓程度50%；兩次下壓時間間隔5 s；探頭型號P/75；觸發(fā)力5 g。

1.2.4.4 魚糜凝膠動態(tài)流變的測定

參考Cao等[12]的方法并稍加修改。使用型流變儀進行振蕩溫度連續(xù)掃描。將魚糜樣品在20℃下平衡3min，掃描溫度范圍為20℃～90℃，程序升溫1℃/min。振蕩模式選擇CD-AutoStrain，控制應變?yōu)?.02，監(jiān)測魚糜樣品凝膠化過程。

1.2.4.5 低場核磁共振的測定

2) 將液壓千斤頂進行升壓，加載油壓升壓到23.89 MPa，系統(tǒng)穩(wěn)定15 min后輸入150 t，標定滿量程。

參考Jiao等[13]的方法并稍加修改。將魚糜凝膠樣品在室溫下恒溫30 min，切取約2 g的樣品放入直徑為15 mm的核磁管中，采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）脈沖序列進行自旋-自旋弛豫時間T2、T2峰比例的測定。

1.2.4.6 魚糜凝膠微觀結構表征

參考Mi等[14]的方法并稍加修改。將魚糜凝膠樣品切成4mm×4mm×4mm的小方塊，使用2.5%（體積分數(shù)）戊二醛緩沖液固定4h，隨后用磷酸鹽緩沖液（pH7.2）漂洗3次，然后通過不同濃度（30%、50%、70%、90%、95%、100%）的乙醇溶液進行梯度脫水，每次30 min，最后用叔丁醇置換3次，-80℃冷凍干燥后離子濺射噴金，然后使用掃描電子顯微鏡觀察其微觀結構。

1.3 統(tǒng)計分析

使用SPSS 23.0對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析（ANOVA）。采用LSD全配對多重比較方法進行顯著性分析，P＜0.05為差異性顯著。試驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差表示，使用Origin 2019軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 TGase添加量對海雜魚魚糜凝膠性能的影響TGase添加量對魚糜凝膠性能的影響見圖1。

圖1 TGase添加量對魚糜凝膠性能的影響Fig.1 Effect of TGase amount on gel properties of surimi

由圖1可知，TGase添加量在0.1%～0.4%時，魚糜凝膠強度逐漸增強，當添加量超過0.4%后，魚糜凝膠強度開始減弱，其中添加量為0.4%時，樣品的凝膠強度達到最大值627.86 g·cm，這與張一鳴等[15]的研究結果一致。上述結果表明，TGase可以有效改善海雜魚魚糜的凝膠特性。TGase的添加會促進魚糜蛋白質(zhì)分子之間形成ε-（γ-Glu）-Lys共價鍵，且在魚糜制作過程中存在加熱工序，蛋白質(zhì)分子受熱后會發(fā)生變性、伸展，為TGase提供了更多的交聯(lián)位點，有利于蛋白質(zhì)之間非二硫共價鍵的形成，從而使魚糜凝膠的網(wǎng)狀結構更加緊密，增強魚糜的凝膠強度[16]。過量添加TGase使凝膠強度減弱可能是因為ε-（γ-Glu）-Lys共價鍵的過量形成促進了魚糜蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的相互作用，使魚糜體系中形成了大的蛋白質(zhì)聚集體，導致在加熱時蛋白結構的變性伸展速率低于交聯(lián)速率，阻礙了蛋白凝膠網(wǎng)絡的形成[17]。海雜魚魚糜持水性的變化與凝膠強度的變化趨勢一致，綜合而言，TGase添加量為0.4%時，魚糜凝膠性能最佳。

2.1.2 蛋清蛋白粉添加量對海雜魚魚糜凝膠性能的影響

蛋清蛋白粉添加量對魚糜凝膠性能的影響見圖2。

圖2 蛋清蛋白粉添加量對魚糜凝膠性能的影響Fig.2 Effect of egg white protein amount on gel properties of surimi

由圖2可知，蛋清蛋白粉可以提高海雜魚魚糜的凝膠強度，當?shù)扒宓鞍追厶砑恿吭?%～6.0%時，魚糜凝膠強度逐漸增強，在添加量為6%時，凝膠強度達到了627.01 g·cm，相比不添加蛋清蛋白粉的樣品增加了29.90%。當?shù)扒宓鞍追厶砑恿看笥?.0%時，凝膠強度無顯著變化（P＞0.05）。蛋清蛋白粉作為一種活性黏連劑，能夠與蛋白質(zhì)基質(zhì)形成相互作用，增強魚糜的凝膠形成能力，從而提高魚糜的凝膠強度[18]。持水性是魚糜凝膠品質(zhì)的一個重要指標，由圖2可知，隨蛋清蛋白粉添加量的增加，魚糜凝膠的持水性逐漸增大，當?shù)扒宓鞍追厶砑恿看笥?.0%時持水性無顯著變化（P＞0.05），與凝膠強度的變化一致。綜合而言，蛋清蛋白粉添加量為6.0%最為合適。

2.1.3 復合磷酸鹽添加量對海雜魚魚糜凝膠性能的影響

GB 2760—2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》中規(guī)定魚糜制品中磷酸根（PO43-）含量不得高于5 g/kg，因此本試驗分別對0%、0.15%、0.25%、0.35%、0.45%的復合磷酸鹽添加量進行了分析。復合磷酸鹽添加量對海雜魚魚糜凝膠性能的影響見圖3。

圖3 復合磷酸鹽添加量對凝膠性能的影響Fig.3 Effect of composite phosphate amount on gel properties

由圖3可知，復合磷酸鹽提高了海雜魚魚糜的凝膠強度，當添加量為0.35%時，凝膠強度達到最大值574.69 g·cm。在復合磷酸鹽添加量0%～0.35%時，持水性隨著復合磷酸鹽添加量的增加而增加，添加0.35%的復合磷酸鹽可以顯著提高魚糜樣品的持水性（P＜0.05），相比未添加組（84.73%）提升了7.63%，這可能是因為復合磷酸鹽呈堿性，會使魚糜蛋白的pH值偏離等電點而使凝膠持水性提高，同時磷酸鹽還有螯合金屬離子和解離肌動球蛋白的作用，也能增強持水性[19]。但隨著添加量的增大，持水性略有下降。綜合而言，復合磷酸鹽添加量濃度為0.35%時，魚糜凝膠性能最好。

2.2 響應面試驗

2.2.1 試驗設計與結果

魚糜的凝膠強度與魚糜本身的品質(zhì)息息相關，凝膠強度越大證明魚糜品質(zhì)越好，因此，凝膠強度的高低常常被用來評估魚糜品質(zhì)的優(yōu)劣[20]。三因素三水平Box-Behnken響應面試驗設計及結果如表2所示。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Experimental designs and results for response surface methodology

表2中1～12為析因試驗，13～17為中心試驗，每次試驗均重復3次，以估計誤差。采用Design-Expert 8.0.6對表2中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到響應值Y（凝膠強度）與各因素（X1、X2、X3）的多元二次回歸方程：Y=680.36+8.54X1+27.86X2-10.54X3-1.69X1X2+6.59X1X3-1.99X2X3-54.73X12-32.45X22-15.63X32。

2.2.2 回歸模型方差分析

對上述試驗結果擬合出的二次模型進行方差分析，結果見表3。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for regression model

由表3的方差分析結果可知，該試驗模型極顯著（P=0.000 2＜0.01），失擬項不顯著（P=0.180 5＞0.05），說明模型有效可用?；貧w方程的二次項相關系數(shù)R2=0.969 0，調(diào)整后R2=0.929 2，信噪比為14.56，遠高于臨界值4，說明該試驗具有較好的擬合性，試驗誤差小，對海雜魚魚糜樣品凝膠強度的預測準確性高。通過對P值的比較，可以發(fā)現(xiàn)一次項蛋清蛋白粉添加量（X2）對響應值Y影響極顯著（P＜0.01），復合磷酸鹽添加量（X3）對響應值Y影響顯著（P＜0.05）；二次項 TGase添加量（X12）與蛋清蛋白粉添加量（X22）對響應值Y影響極顯著（P＜0.01），復合磷酸鹽添加量（X32）對響應值Y影響顯著（P＜0.05）。通過F值還可以看出，各因素對海雜魚魚糜凝膠強度的影響顯著性次序為蛋清蛋白粉添加量＞復合磷酸鹽添加量＞TGase添加量。

2.2.3 各因素交互作用響應面分析

利用軟件對結果進行擬合分析，響應面分析圖中的三維曲面的弧度可以說明各因素對響應值的影響程度，弧度越大，影響越大。各因素交互作用的響應面圖見圖4～圖6。

圖4 TGase與蛋清蛋白粉對魚糜凝膠強度的交互作用Fig.4 Interaction of TGase and egg white protein with the gel strength of surimi

圖5 TGase與復合磷酸鹽對魚糜凝膠強度的交互作用Fig.5 Interaction of TGase and composite phosphate with the gel strength of surimi

圖6 蛋清蛋白粉與復合磷酸鹽對魚糜凝膠強度的交互作用Fig.6 Interaction of egg white protein and composite phosphate with the gel strength of surimi

如圖4～圖6所示，各因素之間具有不同程度的交互作用，其中TGase與復合磷酸鹽的交互作用對海雜魚魚糜的凝膠強度影響較大，因為兩者交互的響應面圖最陡。為確定最佳響應值的因素水平，通過方程求出最優(yōu)解為TGase添加量為0.41%，蛋清蛋白粉添加量為6.88%，復合磷酸鹽添加量為0.31%，此時魚糜凝膠強度的理論值為688.55 g·cm。根據(jù)優(yōu)化后的添加量并結合實際生產(chǎn)需要選擇TGase添加量為0.4%，蛋清蛋白粉添加量為7.0%，復合磷酸鹽添加量為0.30%，進行驗證性試驗，測得魚糜凝膠強度為（697.66±4.86）g·cm，相對于理論預測值誤差較小，證明所得數(shù)學模型的準確性和可行性較高，具有一定的實際應用價值。

2.3 海雜魚魚糜凝膠質(zhì)構特性

質(zhì)構特性是評價魚糜凝膠感官品質(zhì)的重要參數(shù)。表4展示了優(yōu)化組（添加了最優(yōu)復配比的TGase、蛋清蛋白和復合磷酸鹽）與普通組（空白對照）魚糜樣品的質(zhì)構特性。

表4 普通組和優(yōu)化組魚糜樣品的質(zhì)構特性Table 4 Texture characteristics of surimi samples in the control group and the optimization group

由表4可知，優(yōu)化組魚糜凝膠的硬度、內(nèi)聚性、咀嚼性和回復性均顯著高于普通組（P＜0.05），二者彈性無顯著差異。與本研究結果類似的是，F(xiàn)ang等[21]將TGase加入到含有乳化豬油的真鯛魚魚糜中，發(fā)現(xiàn)在相同乳化油含量下，添加TGase的魚糜凝膠硬度和咀嚼性均顯著高于未添加TGase的魚糜凝膠。復合磷酸鹽能夠增強魚糜凝膠體系的pH值，使魚糜肌球蛋白進一步偏離其等電點（pH5.4）；焦磷酸鈉能夠解離肌動球蛋白，對提高魚糜凝膠的質(zhì)構特性具有促進的作用[22]。魚糜凝膠的硬度和咀嚼性與其蛋白質(zhì)含量有關，添加蛋清蛋白直接增加了魚糜凝膠體系的蛋白質(zhì)含量，從而質(zhì)構特性得到了提升。

2.4 海雜魚魚糜凝膠流變特性

海雜魚中蛋白質(zhì)的流變學特性與其凝膠特性密切相關，在熱誘導凝膠過程中動態(tài)流變行為的變化主要通過儲能模量（G′）來體現(xiàn)[23]。海雜魚魚糜的溫度掃描流變特性變化曲線如圖7所示。

圖7 普通組和優(yōu)化組魚糜樣品的流變特性Fig.7 Rheological properties of surimi samples in the control group and the optimization group

由圖7可知，普通組魚糜的G′值在20℃～32℃緩慢上升，此階段為凝膠預備階段，在低溫條件下，魚糜肌球蛋白重鏈發(fā)生變性聚集，溶膠體系形成了一個相對較弱網(wǎng)絡結構，從而G′值增加。32℃～53℃為凝膠劣化階段，此時G′值急劇下降，在53℃時達到最小值，這可能是因為在此溫度區(qū)間，魚糜中內(nèi)源性蛋白酶活性增強，在蛋白酶的作用下肌球蛋白輕鏈亞基發(fā)生解離，打亂了肌球蛋白頭部間的交聯(lián)，從而增強了凝膠體系的流動性[24]。當溫度在53℃～90℃時，G′值迅速上升并逐步趨于穩(wěn)定，表明魚糜進入了魚糕化階段，形成了結構致密、熱不可逆的凝膠網(wǎng)絡結構[25]。優(yōu)化組G′值的變化趨勢與普通組基本一致，但G′值的大小在整個升溫過程中均顯著高于普通組，普通組魚糜的最終彈性模量G′值為15 654.88 Pa，添加了外源添加物后G′值達到了31 128.23 Pa，提高了98.84%。表明外源添加物的加入顯著改善了魚糜凝膠的網(wǎng)絡結構，這與上述魚糜凝膠質(zhì)構特性的研究結果一致。

2.5 海雜魚魚糜凝膠低場核磁共振

海雜魚魚糜的弛豫時間T2分布如圖8所示。

從圖8可以看出，圖譜被擬合為3個波峰，即對應3種不同的水分分布狀態(tài)及波峰范圍：結合水T21（1 ms～10 ms）、不易流動水T22（10 ms～100 ms）、自由水T23（100 ms～1 000 ms）[26]。從圖中可以看出，添加了外源添加物的海雜魚魚糜凝膠樣品的T23有降低的趨勢，說明添加外源添加物可能使海雜魚魚糜凝膠中的自由水朝不易流動水方向遷移。

圖8 普通組和優(yōu)化組魚糜樣品的T2弛豫時間Fig.8 T2relaxation time of surimi samples in the control group and the optimization group

T21、T22、T23的積分面積所占總積分面積的百分比分別用P21、P22和P23表示，代表上述3種不同狀態(tài)水分的相對含量[27]。普通組和優(yōu)化組魚糜樣品的T2弛豫峰比例見表5。

表5 普通組和優(yōu)化組魚糜樣品的T2弛豫峰比例Table 5 T2relaxation peak area fraction of surimi samples in the control group and the optimization group

由表5可知，相對于普通組，優(yōu)化組的P22顯著增加，P23顯著降低（P＜0.05），這說明水分由自由水向不易流動水方向遷移，自由度降低，也解釋了添加外源添加物的魚糜凝膠的持水性增強的原因。分析上述變化的原因，TGase的添加能夠促進海雜魚魚糜凝膠內(nèi)部的非二硫共價鍵的形成，促進魚糜蛋白之間的交聯(lián)聚集；蛋清蛋白粉可以起到黏合魚糜的作用，也可以直接填充到魚糜凝膠網(wǎng)絡結構的縫隙中，有助于魚糜形成良好的凝膠網(wǎng)絡結構，增大對水分的截留。這與上述凝膠特性變化結果相一致。

2.6 海雜魚魚糜凝膠微觀結構

海雜魚魚糜普通組與優(yōu)化組的凝膠微觀結構如圖9所示。

由圖9可知，普通組魚糜凝膠的微觀網(wǎng)絡結構粗糙、不規(guī)則、且具有較大的不規(guī)則孔隙，這也是其凝膠強度、持水性低，質(zhì)構特性普遍較差（表4）的原因。而優(yōu)化組由于外源添加物的作用，使魚糜凝膠的微觀結構發(fā)生了顯著變化，形成了連續(xù)、均勻、致密的網(wǎng)絡結構，這解釋了T22不易流動水水分含量上升（圖8）的原因，進一步驗證了添加物的作用。

圖9 魚糜樣品的微觀結構Fig.9 Microstructure of surimi samples

3 結論

通過單因素試驗和響應面優(yōu)化試驗考察TGase、蛋清蛋白粉及復合磷酸鹽3個因素對海雜魚魚糜凝膠性質(zhì)的影響，得到最佳外源添加物的配方為TGase添加量0.4%、蛋清蛋白粉添加量7.0%、復合磷酸鹽添加量0.30%，在此條件下，魚糜凝膠強度最大。根據(jù)此配方（優(yōu)化組）所得魚糜的質(zhì)構特性參數(shù)、G′、不易流動水含量均顯著高于未添加外源物的普通組（P<0.05），此外，優(yōu)化組魚糜的凝膠網(wǎng)狀結構更為致密、均勻。本研究旨在優(yōu)化3種外源添加物的組成比例，并將此最優(yōu)比例應用于海雜魚魚糜，以充分改善魚糜的凝膠性能，為進一步實現(xiàn)海雜魚魚糜制品的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的數(shù)據(jù)支撐。