云南不同地區(qū)大絨鼠種群的表型性狀差異與分子遺傳差異的比較與分析

任月， 賈婷， 張浩， 王政昆， 朱萬龍

（1.云南省高校西南山地生態(tài)系統(tǒng)動植物生態(tài)適應(yīng)進化及保護重點實驗室，云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心，云南省生物質(zhì)能與環(huán)境生物技術(shù)重點實驗室，昆明650500；2.云南經(jīng)濟管理學(xué)院，昆明650106）

群體間數(shù)量性狀（quantitative trait across populations，QST）與分子遺傳差異（differentiation in neutral marker，F(xiàn)ST）的比較，即QST-FST比較，為研究人員區(qū)分自然選擇和遺傳漂變作為復(fù)雜多基因性狀群體分化的原因提供一種手段（Brommer，2011）。其中，F(xiàn)ST是傳統(tǒng)衡量種群遺傳分化和種群遺傳的基本指標(biāo)（Wright，1943），在遺傳學(xué)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用；QST是指在遺傳漂變、選擇、基因流和環(huán)境適應(yīng)性等因素作用下，群體間數(shù)量性狀的差異（Brommer，2011）。當(dāng)QST＞FST，則研究性狀編碼的基因差異超過了漂移基礎(chǔ)上的預(yù)期，這表明自然選擇在不同種群中偏愛不同的表型；當(dāng)QST=FST，則不能排除觀察到的分化僅僅是由遺傳漂變引起的；當(dāng)QST＜FST，則相同的表型在不同的群體中受到偏愛，并發(fā)生穩(wěn)定的選擇（Meril? & Crnokrak，2001）。大多數(shù)植物和動物，包括人類，可細分為許多孤立的種群，根據(jù)自然選擇、遺傳漂變、遷移和突變的相對強度，種群在遺傳和表型上會出現(xiàn)分化（Wright，1931；Holsinger & Weir，2009）。了解影響這種分化的原因和結(jié)果對生物科學(xué)具有重要意義，包括基礎(chǔ)研究：進化生物學(xué)、生態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)，以及應(yīng)用領(lǐng)域：林業(yè)和漁業(yè)管理、醫(yī)學(xué)生物學(xué)（Leinonenet al.，2013），尤其是可以確定種群分化是由自然選擇過程還是中性遺傳（即遺傳漂變）過程造成的。因此，測量與中性分化有關(guān)的QST是一項適用于進化生物學(xué)和保護生物學(xué)的重要研究。然而，許多物種，特別是瀕危物種，無法完成計算其狹義或廣義QST所需的育種實驗。目前大量研究均以群體間表型性狀差異（differentiation in phenotypic traits，PST）來 代 替QST（Leinonenet al.，2006；周 陸 等 ，2012）。PST的量化是基于對野生環(huán)境中多個種群中若干個體的性狀的表型測量（Brommer，2011）。

大絨鼠Eothenomys miletus為橫斷山區(qū)的特有種（朱萬龍等，2009；彭培英等，2015），無性二型特征（朱萬龍等，2009）。自第三紀(jì)以來，由于青藏高原的隆起、橫斷山脈的形成，氣候條件總體上由濕熱向干旱寒冷的方向演化（Liet al.，2014）；形成了西北高、東南低的基本地勢，海拔變化劇烈，形成了年溫差小、日溫差大、立體氣候顯著等特點，導(dǎo)致植被條件和動物的棲息環(huán)境多樣，邊緣效應(yīng)明顯；橫斷山不同地區(qū)的地貌、氣候等生態(tài)因子差異明顯，很可能引起生活于此的生物出現(xiàn)遺傳和表型的變異。云南不同地區(qū)大絨鼠體質(zhì)量、能量代謝（任月等，2020a，2020b）和頭骨幾何形態(tài)（張海姬等，2019）已經(jīng)出現(xiàn)明顯分化。本研究選擇云南德欽、香格里拉、麗江、劍川和哀牢山的大絨鼠為研究對象，基于群體亞種間的SNP標(biāo)記計算的FST和基于調(diào)查到的性狀數(shù)據(jù)計算PST，通過比較二者的關(guān)系，可進一步了解不同進化機制對云南山區(qū)大絨鼠群體間差異的程度和作用大小，并為其他小型野生哺乳動物的類似研究提供參考或借鑒。

1 材料與方法

1.1 研究對象

73只健康非繁殖期成年大絨鼠于2018年9月—2019年1月采自云南5個不同海拔地區(qū)：德欽（DQ：99°3′E，28°35′N，3 459 m；n=11）、香格里拉（XGLL：100°23′E，28°30′N，3 321 m；n=14）、麗江（LJ：100°22′E，27°27′N，2 478 m；n=15）、劍川（JC：100°15′E，26°43′N，2 590 m；n=20）和哀牢山（ALS：100°42′E，25°30′N，2 217 m；n=13）（圖 1）。野外捕獲后帶到當(dāng)?shù)胤酪哒?，滅蚤處理后稱量體質(zhì)量（精確到0.01 g），斷頸處死，取肝臟置于干冰中，帶回云南師范大學(xué)動物實驗室，-80 ℃保存。

圖1 云南省5個地區(qū)大絨鼠的采樣點Fig. 1 Locations of 5 sampling sites of Eothenomys miletus in Yunnan Province

1.2 形態(tài)學(xué)測量

大絨鼠的身體指標(biāo)測量參照高文榮（2017）的方法，包括自然狀態(tài)的體質(zhì)量、體長和尾長等（分別精確到0.01 g和0.01 cm）。頭骨指標(biāo)測量參照楊奇森等（2005）和夏霖等（2006）的方法，包括顱全長和顱基長等（精確到0.01 cm）。

1.3 分子遺傳差異指數(shù)測量

采用苯酚/氯仿法從動物肝臟組織樣本中提取總DNA。采用Covaris（基因有限公司，香港）將1～3 μg的DNA剪切成200～500 bp的片段。使用Rsal酶法（北京百邁克生物技術(shù)有限公司，北京）獲得9.19×特異性位點擴增片段（specific-locus amplified fragment，SLAF）標(biāo)記（Sunet al.，2013），其插入尺寸為 464～494，SLAF進行 3’端加A處理、連接Dual-index（Kozichet al.，2013）測序接頭、PCR 擴增、純化、混樣、切膠選取目的片段，文庫質(zhì)檢合格后，采用Illumina HiSeqTM2500測序。去除含有接頭和低質(zhì)量的reads（質(zhì)量值Q的堿基數(shù)占整條reads的50%以上）。使用Burrows-Wheeler Aligner 0.7.12-r1039算法將原始reads與橙腹田鼠Microtus ochrogaster參考基因組（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/10848）進行序列比對（Li & Durbin，2009），并使用 GATK 3.3（McKennaet al.，2010）和samtools（Version 1.2）（Liet al.，2009）開發(fā) SNP，對原始SNP進行過濾，過濾條件為完整度≥0.05，數(shù)據(jù)已上傳NCBI數(shù)據(jù)庫（未發(fā)布）。

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS 20.0對校正后的性狀數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），（Wójciket al.，2006；Raeymaekerset al.，2007），式中為種群間方差為種群內(nèi)的方差，h2為遺傳力（由于加性遺傳效應(yīng)而產(chǎn)生的表型方差的比例），c為總體方差的比例，該比例被認為是群體間的加性遺傳效應(yīng)，假設(shè)樣本之間的環(huán)境方差是隨機分布或不存在的?；诟哔|(zhì)量的SNP位點，使用 R 3.6.3 中的 SNPRelate（Zhenget al.，2012）計算兩兩種群間的FST，成對性狀PST和FST進行獨立樣本t檢驗。2個采樣點間地理距離、海拔差、冬季平均溫度差和冬季總降水量差與大絨鼠PST的相關(guān)性用雙變量相關(guān)分析中的Pearson分析方法；利用一般線性模型對兩點間地理距離、海拔差、冬季平均溫度差和冬季總降水量差與PST進行線性回歸分析。其中，2個采樣點間的地理距離為兩點直線距離。平均環(huán)境溫度和總降水量數(shù)據(jù)從國家氣象科學(xué)數(shù)據(jù)中心（http：//data.cma.cn/）下載。

2 結(jié)果

2.1 云南不同地區(qū)大絨鼠表型性狀差異性分析

單因素方差分析結(jié)果顯示，除下齒列長（P=0.389）外，橫斷山5個地區(qū)大絨鼠的體質(zhì)量、體長和尾長等各項表型性狀均具有顯著差異性（P＜0.05；表1）。

表1 云南5個地區(qū)大絨鼠表型性狀差異性分析Table 1 Phenotypic difference of Eothenomys miletus from 5 different areas in Yunnan Province

2.2 PST與FST比較

PST與FST的絕對值比較顯示（圖2），除DQ和XGLL種群的上齒列長，DQ和LJ種群的后肢長，DQ和JC種群的下齒列長，XGLL和LJ種群的后肢，LJ和JC種群的耳寬，LJ和ALS種群的體長和最大眶間距，JC和ALS種群的最大眶間距和下齒列長外，其余性狀的PST值均大于兩兩種群間的FST值。獨立樣本t檢驗顯示，所有測試性狀的PST均極顯著大于FST（P＜0.01）。

圖2 云南5個地區(qū)間大絨鼠的PST和FST比較Fig. 2 Comparison of PST and FST for Eothenomys miletus from 5 different areas in Yunnan Province

2.3 兩兩種群間PST與地理距離、海拔差、冬季平均溫度差和冬季總降水量差的相關(guān)關(guān)系分析和線性回歸分析

兩兩種群間PST與地理距離、海拔差、冬季平均溫度差和冬季總降水量差的相關(guān)性分析和線性回歸分析結(jié)果表明，地理距離與種群間各性狀的PST無相關(guān)關(guān)系（P＞0.05），海拔差與種群間的體質(zhì)量、體長、尾長、前肢長、最大眶間距和上齒列長等性狀的PST呈正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），冬季平均溫度差與體質(zhì)量、體長、尾長、前肢長和最大眶間距的PST呈正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），冬季總降水量差與軀干長、耳長的PST呈正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），與其他性狀的PST無相關(guān)關(guān)系（表2）。

表2 云南5個地區(qū)間大絨鼠兩兩種群間PST與地理距離和環(huán)境差異的相關(guān)性分析和線性回歸分析Table 2 Relationship of pairwise PST with geographic distance and environmental difference of Eothenomys miletus from 5 different areas in Yunnan Province

3 討論

本研究對云南不同海拔地區(qū)的大絨鼠形態(tài)學(xué)指標(biāo)測量和分析，結(jié)果表明，云南不同海拔地區(qū)大絨鼠表型性狀具有顯著差異。通過對QST和FST的比較，可推斷自然選擇對復(fù)雜表型性狀的作用，以及量化群體中數(shù)量性狀的空間遺傳結(jié)構(gòu)的程度（Meril? & Crnokrak，2001；McKay & Latta，2002；Leinonenet al.，2006），對解決與進化和生態(tài)遺傳學(xué)相關(guān)問題具有實用性意義（Leinonenet al.，2010）。由于實驗室條件無法對許多野生動物進行育種實驗，無法獲得計算QST所需要的種群定量遺傳數(shù)據(jù)，在鳥類（Meril?，1997；Saetheret al.，2007；Phillimoreet al.，2008）、魚類（Storz，2002）、哺乳類（Wójciket al.，2006）、兩棲類（Alhoet al.，2010）和甲殼類（周陸等，2012）等研究中一般采用PST替代QST。本研究通過將云南5個不同地區(qū)大絨鼠14個性狀的成對PST與FST進行比較，發(fā)現(xiàn)種群間的成對性狀PST均大于FST，提示其表型性狀受到較明顯的選擇壓力，環(huán)境因子可能是影響大絨鼠表型分化的關(guān)鍵。對黃喉姬鼠Apodemus flavicollis頭骨性狀的研究表明，顱骨形狀、下頜骨大小和下頜骨形狀的PST均大于FST，表明性狀受到強自然選擇，而顱骨大小也受到較弱的自然選擇（Wójciket al.，2006），與本研究中大絨鼠顱全長和顱基長等頭骨性狀受選擇壓力的結(jié)果相符。

環(huán)境因子是影響小型哺乳動物表型分化的關(guān)鍵因素（任月等，2020a，2020b），對中國12個地區(qū)中緬樹鼩Tupaia belangeri表型性狀的PST和FST比較分析，發(fā)現(xiàn)地理距離較遠的種群間各表型性狀均表現(xiàn)為PST＜FST，而地理距離較近的則為PST＞FST，提示地理距離較遠的種群處于穩(wěn)定的中性選擇之中，其進化過程主要受遺傳漂變影響，而地理距離較近的種群受到明顯的選擇壓力，進化過程主要受自然選擇的影響（高文榮，2017）。本研究中大絨鼠各表型性狀的PST與地理距離無相關(guān)關(guān)系，而海拔差、冬季平均溫度差和冬季總降水量差與部分性狀PST呈正相關(guān)關(guān)系，提示地理距離可能不是影響云南不同地區(qū)大絨鼠表型分化的因素，而海拔、環(huán)境溫度和降水量等環(huán)境因子可能是影響其表型分化的因素。

綜上所述，云南不同地區(qū)大絨鼠已出現(xiàn)表型分化，種群間性狀的PST＞FST，表明云南不同地區(qū)大絨鼠各表型性狀受到明顯選擇壓力，即其進化過程主要受自然選擇影響，而海拔、環(huán)境溫度和降水量可能是影響其種群間表型分化的環(huán)境因子。這些結(jié)果對研究不同進化機制對云南的大絨鼠群體間差異影響提供一定理論依據(jù)，而對地理距離較遠的大絨鼠種群間的PST和FST尚待進一步研究。