基于ttr基因的mini-MPN-qLAMP法快速定量檢測(cè)食品中沙門(mén)氏菌

章小洪，鄭連寶，陳衛(wèi)平，王偉影，賀云鵬，方芳，胡彤

（1.麗水市質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，浙江麗水 323000）（2.浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江杭州 310032）（3.德清縣食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，浙江湖州 313200）（4.衢州市食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江衢州 324000）

沙門(mén)氏菌是一種重要的食源性致病菌，該菌主要污染的食品有肉、蛋、乳等禽肉類(lèi)制品和速凍食品。一旦發(fā)生沙門(mén)氏菌污染的情況，食品生產(chǎn)環(huán)境中殘留的沙門(mén)氏菌不易控制，存在交叉污染的安全隱患[1,2]。消費(fèi)者食用了被沙門(mén)氏菌污染的食品容易引起腹瀉甚至敗血癥等食物中毒的現(xiàn)象。全球細(xì)菌性食物中毒事件中，沙門(mén)氏菌引起的食物中毒長(zhǎng)期占據(jù)榜首[3]。GB 4789.4[4]中，沙門(mén)氏菌的檢驗(yàn)程序繁瑣，需要4~6 d才能確認(rèn)結(jié)果，當(dāng)前急需一種高效、低成本的快速沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法。因此，開(kāi)發(fā)新的沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法一直是一個(gè)熱點(diǎn)研究方向[5]。近年來(lái)核酸檢測(cè)技術(shù)的迅速發(fā)展帶動(dòng)了食品檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，其中熒光定量PCR（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR）技術(shù)被應(yīng)用于食品中沙門(mén)氏菌的檢驗(yàn)[6]。熒光定量環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Quantitative Loop-Mediated Isothermal Amplification，qLAMP）、重組聚合酶擴(kuò)增等技術(shù)在沙門(mén)氏菌檢測(cè)中也取得了重要進(jìn)展[7,8]。這些等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)一方面減少了昂貴的PCR儀器使用，另外也將沙門(mén)氏菌的檢測(cè)效率大大提高了。

在食品微生物的定量檢測(cè)中，MPN（Most Probable Number，MPN）計(jì)數(shù)法是一種基于概率計(jì)算的計(jì)數(shù)方法，相比平板計(jì)數(shù)法具有更高的靈活性，且檢出限可根據(jù)加樣量進(jìn)行調(diào)整，因此廣泛用于食品中大腸菌群、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌等微生物的定量檢測(cè)。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.4中只對(duì)沙門(mén)氏菌規(guī)定了定性檢測(cè)方法[5]，但沙門(mén)氏菌的研究通常需要定量方法的輔助。美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)（AOAC）、美國(guó)環(huán)保局（EPA）等機(jī)構(gòu)制定的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)中均運(yùn)用了該方法[9,10]，可見(jiàn)MPN計(jì)數(shù)法對(duì)于沙門(mén)氏菌的定量研究具有重要意義。

invA基因編碼位于沙門(mén)氏菌致病島上的入侵蛋白，是侵襲宿主細(xì)胞所需的毒力因子?，F(xiàn)有商業(yè)化檢測(cè)試劑盒均以invA基因作為靶標(biāo)基因[11]，但近年來(lái)發(fā)現(xiàn)有12.3%的S.entericaserovar Kentucky分離菌株無(wú)法檢測(cè)出invA基因[12]，且S.entericaserovar Litchfield和Senftenberg等菌株在自然界中也存在丟失invA基因的可能[13]。ttrRSBCA轉(zhuǎn)座子是沙門(mén)氏菌無(wú)氧代謝過(guò)程中重要的基因，Malorny B等開(kāi)發(fā)了基于ttrRSBCA轉(zhuǎn)座子檢測(cè)食品中沙門(mén)氏菌屬的qPCR方法[14]。近年來(lái)，Kreitlow等[15]發(fā)現(xiàn)ttr基因在沙門(mén)氏菌中的特異性最高，其包容性和排他性均為100%，而invA基因在沙門(mén)氏菌的特異性次之，排他性100%，包容性為97.6%，證明了ttr基因在沙門(mén)氏菌的檢測(cè)中優(yōu)于invA基因。

本研究針對(duì)ttrRSBCA基因座建立一種快速檢測(cè)食品中沙門(mén)氏菌的 qLAMP技術(shù)，并結(jié)合 mini-MPN和短時(shí)間增菌技術(shù)，即沙門(mén)氏菌的mini-MPN-qLAMP法，并與已建立的mini-MPN-qPCR法[16]比較，以確定所建立的mini-MPN-qLAMP方法的可靠性，為食品中沙門(mén)氏菌快速定量檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器設(shè)備

U445超低溫保存箱，西班牙泰事達(dá)科技公司；QuantStudio5熒光定量PCR儀、LEGEND MICRO21離心機(jī)，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；IN260生化培養(yǎng)箱，德國(guó)美墨爾特有限公司；HF-Safe-1200JE生物安全柜，上海力申科學(xué)儀器有限公司。

1.1.2 主要材料和試劑

雞胸肉購(gòu)置于本地超市，慶元烏米飯購(gòu)自本地市場(chǎng)；緩沖蛋白胨水（BPW）、XLT-4瓊脂，購(gòu)于青島海博生物技術(shù)有限公司；ThermoPol緩沖液、Bst2.0 DNA聚合酶（8 U/μL）、MgSO4（100 mmol/L）、LAMP熒光染料，購(gòu)于NEB北京公司；TBGreen Premix Ex Taq、ROX 參比熒光染料、dNTP Mixture（10 mmol/L），購(gòu)于寶生物工程有限公司。

1.1.3 菌種和引物

引物：依據(jù)沙門(mén)氏菌屬穩(wěn)定表達(dá)的ttr RSBCA轉(zhuǎn)座子基因序列（AF282268.1），LAMP引物使用NEB LAMP Primer Design Tool（https://lamp.neb.com/）軟件設(shè)計(jì)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)篩選得到引物；qPCR引物使用PrimerQuest（https://sg.idtdna.com/PrimerQuest/Home/Index）軟件設(shè)計(jì)，引物序列詳見(jiàn)表1。所有引物均使用BLAST進(jìn)行比對(duì)，由上海生工生物工程有限公司合成。菌種：實(shí)驗(yàn)主要測(cè)試菌株為鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC14028，具體特異性驗(yàn)證菌株詳見(jiàn)表2。

表1 實(shí)驗(yàn)用引物Table 1 The primers used in this experiment

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌液制備與核酸提取

菌液制備：將待測(cè)菌株接種于BPW中36 ℃培養(yǎng)16 h得到新鮮菌液。

核酸提?。翰捎弥蠓蟹ㄌ崛『怂帷Ｎ? mL樣液于12 000 r/min離心5 min，小心移去上清液900 μL，加入1 mL無(wú)菌水后混勻再12 000 r/min離心5 min，小心移去上清液 900 μL，置于 100 ℃電熱板中煮沸15 min，迅速冷卻后12 000 r/min離心1 min，移取上清液直接用于qPCR和qLAMP實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 qLAMP和qPCR的反應(yīng)條件

LAMP反應(yīng)體系：10 X ThermoPol Buffer 2 μL，MgSO41.2 μL，dNTP Mixture 2.8 μL，50 X LAMP 熒光染料 0.2 μL，ROX 參比熒光染料 0.2 μL，10 X Primers Mix 2 μL，Bst2.0 WarmStart DNA 聚合酶0.8 μL，DNA 粗提液 5 μL，加無(wú)菌水至 20 μL。反應(yīng)條件：65 ℃保溫反應(yīng)40 min，以1 min作1個(gè)循環(huán)檢測(cè)熒光值，結(jié)束后測(cè)定溶解曲線(xiàn)（65~95 ℃，0.2 ℃/s）。

qPCR反應(yīng)體系參照文獻(xiàn)[16]。

1.2.3 qLAMP和 qPCR的特異性實(shí)驗(yàn)和純培養(yǎng)檢出限測(cè)定

特異性檢測(cè)：參照1.2.1提取表2中各菌株核酸，使用建立的qLAMP法和qPCR法對(duì)方法的特異性進(jìn)行檢測(cè)。

檢出限檢測(cè)：參照 1.2.1制備鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC14028菌液，使用PBS進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)玫?5×107、5×106、5×105、5×104、5×103、5×102、5×101、5×100CFU/mL稀釋液，每個(gè)濃度取1 mL分別進(jìn)行核酸提取和qLAMP、qPCR實(shí)驗(yàn)，確定方法檢出限，并進(jìn)行溶解曲線(xiàn)分析。同時(shí)取適宜濃度100 μL樣液進(jìn)行XLT-4平板涂布計(jì)數(shù)。

1.2.4 平板計(jì)數(shù)法定量檢測(cè)沙門(mén)氏菌

使用PBS進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)?個(gè)適宜稀釋梯度，分別吸取100 μL稀釋菌液，涂布于XLT-4平板，36 ℃培養(yǎng) 24 h。然后對(duì)典型菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，并依據(jù)GB 4789.4-2016進(jìn)行后續(xù)鑒定工作。

1.2.5 mini-MPN-qLAMP、mini-MPN-qPCR和mini-MPN法定量檢測(cè)沙門(mén)氏菌

使用BPW對(duì)樣液進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)總€(gè)梯度濃度取1.2 mL至48孔板，每個(gè)濃度加3孔，置于36 ℃增菌5 h后分別從48孔板中取1 mL增菌液，提取核酸，進(jìn)行qPCR和qLAMP鑒定實(shí)驗(yàn)，剩余增菌液繼續(xù)置于36 ℃增菌至18 h，然后在XLT-4平板劃線(xiàn)，依據(jù)GB 4789.4進(jìn)行鑒定。依據(jù)不同濃度陽(yáng)性孔數(shù)進(jìn)行MPN查表計(jì)數(shù)[17]。

1.2.6 人工污染雞胸肉混合液和冷凍烏米飯定量檢測(cè)

從當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)購(gòu)置雞胸肉和烏米飯，置于無(wú)菌均質(zhì)袋中，送入實(shí)驗(yàn)室，適度均質(zhì)后置于冰箱中冷凍保存。參照GB 4789.4-2016進(jìn)行檢驗(yàn)，確認(rèn)無(wú)沙門(mén)氏菌污染后，再制備成樣品混合液（即人工添加 102~108CFU/mL不同濃度的沙門(mén)氏菌稀釋液）待平板計(jì)數(shù)法、mini-MPN法、mini-MPN-qPCR法和mini-MPN-qLAMP法定量檢測(cè)。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

以上實(shí)驗(yàn)均設(shè)3個(gè)平行，使用SigmaPlot 14.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和Bland-Altman相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 qLAMP和qPCR檢測(cè)方法確立

實(shí)驗(yàn)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和溶解曲線(xiàn)如圖1，qPCR實(shí)驗(yàn)獲得的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y=-3.02x+36.61，r2=0.997，PCR擴(kuò)增效率為 100%，檢出限為50 CFU/mL，溶解曲線(xiàn)分析表明溶解溫度為86.1 ℃；qLAMP實(shí)驗(yàn)獲得的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y=-2.39x+12.51，r2=0.949，PCR擴(kuò)增效率為 151%，檢出限為500 CFU/mL，溶解曲線(xiàn)分析表明溶解溫度為 87.4 ℃。與本項(xiàng)目組之前基于invA基因建立的qPCR法和qLAMP法相比，本研究建立的兩種方法檢出限具有一致性[16,18]。并且qPCR法建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相對(duì)qLAMP法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)穩(wěn)定性更好。當(dāng)使用qLAMP法對(duì)低濃度的沙門(mén)氏菌進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，曲線(xiàn)線(xiàn)性易受到影響，本實(shí)驗(yàn)多次測(cè)試結(jié)果表明，低濃度下LAMP的擴(kuò)增不穩(wěn)定，Ct值容易出現(xiàn)較大波動(dòng)，這與 Youn[19]等研究得到的結(jié)果一致。同時(shí)，本研究中qLAMP法檢出限與Fang等[20]建立的qLAMP法檢出限相似。

圖1 qLAMP和qPCR檢出限測(cè)定和溶解溫度分析Fig.1 The detection limit and melting temperature analysis of qLAMP and qPCR

為了驗(yàn)證所建立的qLAMP和qPCR方法的特異性，本研究使用15株沙門(mén)氏菌菌株和21株非沙門(mén)氏菌菌株進(jìn)行qLAMP和qPCR實(shí)驗(yàn)。如表2，qLAMP和qPCR均特異性良好，15株沙門(mén)氏菌菌株均能擴(kuò)增出ttr基因片段，而21株非沙門(mén)氏菌菌株均未檢出ttr基因，故實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合沙門(mén)氏菌特異性鑒定的要求。

表2 qLAMP和qPCR的特異性實(shí)驗(yàn)Table 2 Specificity of qPCR and qLAMP

2.2 人工污染速凍烏米飯混合液的定量檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)使用初始濃度為5×108CFU/mL的沙門(mén)氏菌菌液進(jìn)行10倍稀釋后，每個(gè)濃度分別取1 mL至25 g烏米飯樣品中均質(zhì)，加入225 mL BPW稀釋后，得到終濃度為 6.30、5.30、4.30、3.30、2.30、1.30、0.30、-0.70 lg CFU/mL稀釋液，分別使用mini-MPN-qLAMP、mini-MPN-qPCR、mini-MPN計(jì)數(shù)法和平板計(jì)數(shù)法對(duì)速凍烏米飯中沙門(mén)氏菌進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果如表3所示。平板計(jì)數(shù)法最低檢出濃度為 1.46 lg CFU/mL，而基于MPN的方法最低可檢出-0.44 lg MPN/mL的沙門(mén)氏菌，相較平板計(jì)數(shù)法檢出限顯著降低。從表中得出，基于MPN 的mini-MPN-qLAMP、mini-MPN-qPCR、mini-MPN法計(jì)數(shù)結(jié)果相近。其中mini-MPN-qLAMP和mini-MPN-qPCR法的結(jié)果平均差異為0.02 lg MPN/mL，最大差異為 0.28 lg MPN/mL。所有計(jì)數(shù)結(jié)果均在mini-MPN-qLAMP的95%置信區(qū)間內(nèi)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示mini-MPN-qLAMP法的檢出限為-0.44 lg MPN/mL。

表3 速凍烏米飯的沙門(mén)氏菌定量檢測(cè)結(jié)果Table 3 The quantitative detection of Salmonella in frozen black rice

為驗(yàn)證mini-MPN-qLAMP的有效性，實(shí)驗(yàn)將mini-MPN-qLAMP法和其它定量檢測(cè)方法的結(jié)果進(jìn)行Bland-Altman相關(guān)性比較分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。mini-MPN-qPCR、mini-MPN和平板計(jì)數(shù)法的定量結(jié)果與 mini-MPN-qLAMP結(jié)果一致性程度較高。平板計(jì)數(shù)法與mini-MPN-qLAMP的相關(guān)系數(shù)r2=0.997，而mini-MPN與mini-MPN-qLAMP的相關(guān)系數(shù)r2=0.998，具有更好的線(xiàn)性關(guān)系。從圖中可以看出，mini-MPN和mini-MPN- qLAMP法的95%置信區(qū)間上差異為-0.19和0.28 lg MPN/mL之間，這兩種方法在95%置信區(qū)間差異不超過(guò)0.15 lg MPN/mL，因此，與已被廣泛認(rèn)可的MPN計(jì)數(shù)法相比，mini-MPN-qLAMP法為沙門(mén)氏菌定量檢測(cè)提供了一種可靠的替代方法。

圖2 在速凍烏米飯應(yīng)用中mini-MPN-qLAMP法與其他方法的Bland-Altman比較分析Fig.2 Bland-Altman analysis of mini-MPN-qLAMP and other quantitative methods infrozen black rice

2.3 人工污染速凍雞胸肉混合液的定量檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)使用濃度4×108CFU/mL菌液進(jìn)行10倍稀釋后，稀釋液分別取1 mL至25 g雞胸肉樣品中均質(zhì)，加入225 mL BPW稀釋后得到終濃度為6.20、5.20、4.20、3.20、2.20、1.20、0.20、-0.80 lg CFU/mL稀釋液，分別使用 mini-MPN-qLAMP、mini-MPN-qPCR、mini-MPN法和平板計(jì)數(shù)法對(duì)速凍雞胸肉中沙門(mén)氏菌進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表4所示?；贛PN的方法在檢出限方面相比平板計(jì)數(shù)法同樣更具優(yōu)勢(shì)。mini-MPN-qLAMP和mini-MPN-qPCR法的結(jié)果平均差異為0.51 lg MPN/mL，最大差異為1.03 lg MPN/mL。相較于速凍烏米飯，在速凍雞胸肉中mini-MPN-qPCR、mini-MPN-LAMP、mini-MPN和平板計(jì)數(shù)法四種方法的結(jié)果一致性程度較低，原因可能是生肉制品中存在大量的腐敗假單胞菌[21]對(duì)結(jié)果造成的干擾。另外，通過(guò)平板計(jì)數(shù)法發(fā)現(xiàn)雞胸肉中存在大量大腸菌群等干擾菌，這些細(xì)菌容易對(duì)常規(guī)的mini-MPN法和平板計(jì)數(shù)的結(jié)果造成干擾。在增菌過(guò)程中，大腸菌群等細(xì)菌大量繁殖，而mini-MPN法的增菌時(shí)間偏長(zhǎng)，大腸菌群屬于優(yōu)勢(shì)菌種，導(dǎo)致mini-MPN法的結(jié)果存在較大偏差。這些結(jié)果與本課題組對(duì)山泉水中沙門(mén)氏菌的檢測(cè)結(jié)果相似[18]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 mini-MPN-qLAMP法的檢出限為-0.64 lg MPN/mL。

表4 雞胸肉混合液的沙門(mén)氏菌定量檢測(cè)結(jié)果Table 4 The quantitative detection of Salmonella in chicken breast rinsate

實(shí)驗(yàn)將 mini-MPN-qLAMP法和其它定量檢測(cè)方法的結(jié)果進(jìn)行Bland-Altman相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。平板計(jì)數(shù)法與mini-MPN-qLAMP的相關(guān)系數(shù)r2=0.963，mini-MPN與mini-MPN-qLAMP的相關(guān)系數(shù)r2=0.970。mini-MPN-qPCR與mini-MPN-qLAMP相關(guān)線(xiàn)性最好，r2=0.990。如圖所示，mini-MPN-qLAMP法和其他檢測(cè)方法的 95%置信區(qū)間上差異普遍偏大，mini-MPN-qPCR與mini-MPN-qLAMP的結(jié)果在95%置信區(qū)間上差異為-0.40和1.18 lg MPN/mL之間。相比而言，在高污染雜菌的條件下，mini-MPN-qLAMP法為沙門(mén)氏菌定量檢測(cè)提供了一種可靠的檢測(cè)方法，具有較好的定量檢測(cè)能力。

圖3 在雞胸肉檢測(cè)應(yīng)用中mini-MPN-qLAMP法與其他方法的Bland-Altman分析Fig.3 Bland-Altman analysis of mini-MPN-qLAMP and other quantitative methods in chicken breast rinsate

3 討論

由于不同食品對(duì)于沙門(mén)氏菌的檢測(cè)影響較大，考慮到沙門(mén)氏菌普遍易感的兩種食品速凍面米食品和生制肉制品，本實(shí)驗(yàn)選取速凍烏米飯和速凍雞胸肉進(jìn)行不同污染程度食品沙門(mén)氏菌定量檢測(cè)方法的驗(yàn)證。常用的定量檢測(cè)方法有平板計(jì)數(shù)法，MPN計(jì)數(shù)法。其中平板計(jì)數(shù)法由于取樣量少，存在檢出限高的問(wèn)題，并且對(duì)于污染嚴(yán)重的樣品可能無(wú)法直接計(jì)數(shù)。

與平板計(jì)數(shù)法相比，MPN計(jì)數(shù)法可以顯著降低定量方法的檢出限。雖然通過(guò)概率計(jì)算可能帶入誤差[22]，但MPN值與平板計(jì)數(shù)法結(jié)果之間存在正相關(guān)[23]。根據(jù)MPN計(jì)算公式，MPN法的誤差與加樣量和發(fā)酵管數(shù)相關(guān)。發(fā)酵管數(shù)越多，MPN計(jì)數(shù)結(jié)果越準(zhǔn)確，但這將實(shí)驗(yàn)成本升高，操作變得復(fù)雜。為了控制實(shí)驗(yàn)成本，減少實(shí)驗(yàn)工作量，項(xiàng)目組使用體積小，容量大的 48孔板作為多管發(fā)酵容器，可實(shí)現(xiàn)每孔加樣量1.2 mL，使用3管稀釋法大大降低了傳統(tǒng)MPN計(jì)數(shù)對(duì)人力和物力成本需求，可實(shí)現(xiàn)快速簡(jiǎn)便定量檢測(cè)，并且通過(guò)MPN統(tǒng)計(jì)表中的95%置信區(qū)間減少誤差。

基于 mini-MPN計(jì)數(shù)法，本實(shí)驗(yàn)建立了mini-MPN-qLAMP和 mini-MPN-qPCR法。其中mini-MPN-qPCR法的具有良好的定量檢測(cè)能力[16,24]，但該方法需要昂貴的熒光定量PCR儀。qLAMP技術(shù)對(duì)設(shè)備要求更低，只需等溫條件即可進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)。另外，qLAMP是基于熒光的LAMP技術(shù)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、反應(yīng)快的特點(diǎn)，也可使用顯色反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。LAMP技術(shù)對(duì)于引物設(shè)計(jì)的要求較高，需要設(shè)計(jì)合理引物防止出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象。而且LAMP顯色技術(shù)容易受到核酸提取方法的影響，因此，本研究使用qLAMP法對(duì)LAMP過(guò)程進(jìn)行監(jiān)控，檢測(cè)結(jié)果更加可靠，后續(xù)可增加基于顯色反應(yīng)的LAMP技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步降低儀器要求，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

項(xiàng)目組同時(shí)設(shè)計(jì)了 mini-MPN-qLAMP、mini-MPN-qPCR、mini-MPN和平板計(jì)數(shù)法定量測(cè)定沙門(mén)氏菌，通過(guò)Bland-Altman分析對(duì)兩種方法的檢測(cè)結(jié)果的一致性進(jìn)行評(píng)價(jià)。兩種檢測(cè)方法的結(jié)果差異用結(jié)果的差值平均值進(jìn)行估計(jì)，平均值的變異情況則用差值的標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)描述。當(dāng)測(cè)量結(jié)果的差值服從正態(tài)分布時(shí)，95%的差值位于平均值±1.96標(biāo)準(zhǔn)差之間，則可認(rèn)為這兩種方法測(cè)量結(jié)果具有較好的一致性[25]。本實(shí)驗(yàn)使用兩種不同污染程度的食品對(duì)所建立的mini-MPN-qLAMP法進(jìn)行定量檢測(cè)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)mini-MPN-qLAMP可以通過(guò)基因檢測(cè)消除初始雜菌對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，項(xiàng)目組后續(xù)考慮檢驗(yàn)結(jié)果區(qū)分死菌活菌的能力，配合PMA等檢測(cè)方法進(jìn)行進(jìn)一步研究[26]。

4 結(jié)論

本研究旨在建立一種準(zhǔn)確度高、操作簡(jiǎn)便的沙門(mén)氏菌定量等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法。研究使用ttr基因替代傳統(tǒng)的invA基因作為檢測(cè)靶點(diǎn)建立了qLAMP和qPCR定性檢測(cè)方法，并使用15株沙門(mén)氏菌菌株和21株非沙門(mén)氏菌菌株進(jìn)行特異性驗(yàn)證，僅沙門(mén)氏菌檢測(cè)呈陽(yáng)性結(jié)果。qLAMP和 qPCR純培養(yǎng)檢出限分別為500 CFU/mL和50 CFU/mL，建立的定性檢測(cè)方法可行。研究進(jìn)一步使用基于48孔板的3孔微量多管發(fā)酵法和短時(shí)間增菌技術(shù)建立了 mini-MPN-qLAMP法和mini-MPN-qPCR 法實(shí)現(xiàn)了定量檢測(cè)。通過(guò)Bland-Altman分析表明，經(jīng)過(guò)5 h BPW增菌后所建立的 mini-MPN-qLAMP法在速凍烏米飯中檢測(cè)結(jié)果與mini-MPN-qPCR、mini-MPN計(jì)數(shù)法、平板計(jì)數(shù)法相比均具有較高的一致性，r2≥0.994，檢出限為-0.44 lg MPN/mL；而在速凍雞胸肉中該法檢測(cè)結(jié)果與mini-MPN-qPCR結(jié)果一致性最佳，r2=0.990，檢出限為-0.64 lg MPN/mL。肉制品中腐敗雜菌會(huì)影響mini-MPN計(jì)數(shù)和平板計(jì)數(shù)結(jié)果，mini-MPN-qLAMP可排除肉制品中腐敗雜菌對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立的mini-MPN-qLAMP法是一種準(zhǔn)確度高、操作簡(jiǎn)便的沙門(mén)氏菌定量檢測(cè)方法，無(wú)需特定PCR儀器即可進(jìn)行沙門(mén)氏菌的快速檢測(cè)，可大幅度提高檢測(cè)效率，可在食品的沙門(mén)氏菌檢測(cè)領(lǐng)域予以推廣。