基于實驗室能力驗證需求國標(biāo)法檢測雞肉和雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留量的優(yōu)化

唐子恒，林澤寧，陳子敏，黃楚彪，勞華杰，詹煒瑋，劉文字，沈祥廣*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家獸藥殘留基準(zhǔn)實驗室，廣東廣州 510642）（2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（廣州），廣東廣州 510642）

畜禽產(chǎn)品中獸藥及禁用藥物殘留檢測能力驗證（以下簡稱“能力驗證”）是指各個實驗室或檢測機(jī)構(gòu)按照事先制定好的標(biāo)準(zhǔn)與規(guī)定，對由負(fù)責(zé)單位事先準(zhǔn)備好的考核樣品進(jìn)行檢測，通過對比各實驗室或檢測機(jī)構(gòu)的結(jié)果與操作規(guī)范性，來評價該實驗室或檢測機(jī)構(gòu)的獸藥及禁用藥物殘留檢測能力[1,2]。根據(jù)《檢驗檢測機(jī)構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定能力評價檢驗檢測機(jī)構(gòu)通用要求》和《農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測機(jī)構(gòu)考核評審細(xì)則》的要求[3,4]，檢驗檢測機(jī)構(gòu)及相關(guān)實驗室必須參加能力驗證或?qū)嶒炇议g比對。由于未通過能力驗證可能導(dǎo)致實驗室或檢測機(jī)構(gòu)失去相應(yīng)項目的檢測活動及出具合法有效檢驗檢測報告的資質(zhì)，所以盡可能地提高能力驗證通過率對于實驗室或檢測機(jī)構(gòu)來說十分重要。

氟喹諾酮類藥物（Fluoroquinolones，F(xiàn)Qs）是廣譜合成抗生素[5]，可以選擇性抑制參與革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌DNA復(fù)制的細(xì)菌酶[6]。因為它們對多種細(xì)菌病原體都具有活性，且與其他抗菌藥無交叉耐藥性[7]，加之價格低廉，故常被用于大規(guī)模養(yǎng)殖，以預(yù)防、治療動物疾病或改善畜禽生長和生產(chǎn)力[8,9]。由此，不規(guī)范用藥帶來的殘留風(fēng)險也較大，它們會殘留在動物體內(nèi)，并通過食物鏈進(jìn)入人體，對人體健康造成極大危害[10]。FQs在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域應(yīng)用的不良反應(yīng)鮮有報道，但對于人類來說，F(xiàn)Qs存在中樞系統(tǒng)毒性，會導(dǎo)致如Q-T間期延長，肌肉疼痛無力，肌腱撕裂等不良反應(yīng)[11]。從20世紀(jì)90年代中期開始，革蘭氏陽性菌株和革蘭氏陰性菌株對 FQs的耐藥性不斷增加[12,13]。近年來，人們還發(fā)現(xiàn)重要的水資源中也存在FQs殘留[14]，藥物殘留已經(jīng)威脅到人類飲用水安全。

根據(jù)GB 31650-2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》規(guī)定[15]，雞肉中的達(dá)氟沙星（Danofloxacin，DAN）最大殘留限量（Maximum Residue Limit，MRL）為 200 μg/kg，沙拉沙星（Sarafloxacin，SAR）MRL 為 10 μg/kg，恩諾沙星（Enrofloxacin，ENR）與環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）兩者殘留量相加不超過100 μg/kg。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部近年來組織的能力驗證常將雞肉中該4種藥物殘留量測定作為考核項目。上述4種FQs藥物在蛋雞的產(chǎn)蛋期禁用。

進(jìn)行能力驗證考核時，存在樣品數(shù)量少、檢測時間限制等難點(diǎn)。針對這些難點(diǎn)，在農(nóng)業(yè)部1025號公告-14-2008和農(nóng)業(yè)部781號公告-6-2006兩個現(xiàn)行有效的國標(biāo)高效液相色譜（HPLC）檢測方法的基礎(chǔ)上[16,17]，增加了移取1 mL待SPE凈化的備用液（1 mL）進(jìn)行加熱沉淀凈化，并上機(jī)檢測的快速分析方法，為依照國標(biāo)方法檢測的能力驗證實驗結(jié)果提供質(zhì)量驗證參比。剩余備用液分取適量體積，繼續(xù)按國標(biāo)方法優(yōu)化后的凈化操作完成能力驗證實驗。另外，由于高效液相色譜儀相對價廉，普及率高，所建的簡約前處理快速檢測法也適合養(yǎng)殖企業(yè)產(chǎn)品上市前的自檢。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Agilent 1260高效液相色譜儀（配熒光檢測器），美國 Agilent公司；AT-261型電子分析天平，瑞士Mettler公司；DK-8D三孔電熱恒溫水槽，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；KS 501 digital振蕩搖床，德國IKA公司；ST 16R高速冷凍離心機(jī)，美國賽默飛世爾科技有限公司。

環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星四種對照品，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；磷酸二氫鉀（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；正己烷（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三乙胺（分析純），上海麥克林生化科技有限公司；磷酸（分析純），天津市富宇精細(xì)化工有限公司；氫氧化鈉（分析純），廣州化學(xué)試劑廠；乙腈（色譜純），賽默飛世爾科技有限公司。TC-C18液相色譜柱（250 mm×4.6 mm），安捷倫科技有限公司；C18固相萃取柱（100 mg~1 mL），安捷倫科技有限公司。

空白雞肉、空白雞蛋均為市售合格產(chǎn)品，無FQs殘留，勻漿后封存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液和試劑的配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液和試劑參照農(nóng)業(yè)部1025號公告-14-2008和農(nóng)業(yè)部 781號公告-6-2006兩個國標(biāo)檢測方法配制[16,17]。

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：精密稱取達(dá)氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（按有效成分折算），用0.03 mol/L氫氧化鈉溶液溶解，并定容至50 mL得0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液；精密稱取恩諾沙星、環(huán)丙沙星和沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)品各50 mg（均按有效成分折算），用0.03 mol/L氫氧化鈉溶液溶解，并定容至50 mL得1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液置4 ℃冰箱中保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確量取適量上述4種儲備液混合，用流動相稀釋定容成適宜濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，使達(dá)氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星和沙拉沙星濃度比為1:5:5:5，于4 ℃冰箱保存。如無特殊說明，文中所述的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、添加濃度組中的達(dá)氟沙星濃度均為其他藥物濃度的1/5。

磷酸鹽提取液：取磷酸二氫鉀6.8 g，加水溶解并稀釋至500 mL，用5.0 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0。

0.05 mol/L磷酸/三乙胺溶液：取濃磷酸3.4 mL，用水稀釋至1 000 mL，用三乙胺調(diào)pH值至2.4。

乙腈（30%）-緩沖液：量取乙腈30 mL，0.05 mol/L磷酸/三乙胺溶液70 mL，混合，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18，250 mm×4.6 mm，5 μm；流動相：0.05 mol/L磷酸/三乙胺溶液-乙腈（81:19）；流速：0.8 mL/min（雞肉樣品檢測），1.0 mL/min（雞蛋樣品檢測）；進(jìn)樣量：50 μL；檢測波長：激發(fā)波長280 nm，發(fā)射波長450 nm。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

準(zhǔn)確量取適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，用流動相稀釋成濃度分別為0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、200.0、400.0 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（其中達(dá)氟沙星濃度為0.1、0.2、1.0、2.0、4.0、40.0、80.0 μg/L），供高效液相色譜分析，以與樣品同色譜條件重復(fù)檢測三次后取峰面積平均值。以各藥物濃度（μg/L）為橫坐標(biāo)（x軸），對應(yīng)峰面積平均值為縱坐標(biāo)（y軸），進(jìn)行線性回歸分析，計算回歸方程和相關(guān)回歸系數(shù)。

1.2.4 樣品提取

雞肉：稱取（2±0.05）g試樣于50 mL離心管中（如為考核樣品，默認(rèn)樣品質(zhì)量為2.00 g），在樣品中精確加入磷酸鹽提取液10.0 mL，渦旋1 min后，將離心管蓋緊，置搖床振蕩10 min，振蕩結(jié)束放入高速離心機(jī)10 000 r/min離心5 min。離心后的上清液轉(zhuǎn)移至另一50 mL離心管，殘余物再用10 mL磷酸鹽提取液同法提取。合并上清液并混勻，樣液備用。

雞蛋：稱?。?±0.05）g試樣于50 mL離心管中（如為考核樣品，默認(rèn)樣品質(zhì)量為2.00 g），精確加入磷酸鹽提取液2.0 mL，渦旋1 min后，將離心管蓋緊，置搖床振蕩 10 min，振蕩結(jié)束放入高速離心機(jī)10 000 r/min離心5 min。離心后的上清液轉(zhuǎn)移至10 mL量筒，殘余物再用2 mL磷酸鹽提取液同法提取。合并上清液后，用純水將上清液定容至6 mL，混勻，樣液備用。

1.2.5 樣液的凈化處理

1.2.5.1 加熱快速沉淀法

精密移取備用樣液1 mL于2 mL塑料離心管中，準(zhǔn)確加入乙腈0.2 mL，蓋緊，用封口膜密封，渦旋30 s，置55 ℃水浴加熱20 min后，4 ℃條件下以15 000 r/min離心5 min，上清液過0.22 μm濾膜后進(jìn)高效液相色譜儀快速測定樣品中的藥物含量。

1.2.5.2 按農(nóng)業(yè)部1025號公告-14-2008方法凈化的優(yōu)化方法

雞肉樣品備用液先放入-20 ℃冰箱冷凍至結(jié)冰，重解凍后10 000 r/min離心5 min，精密移取上層清夜5 mL，加入經(jīng)甲醇、磷酸鹽緩沖液各2 mL平衡過的C18固相萃取柱中，過柱后，1 mL水淋洗，擠干。用流動相1 mL洗脫，擠干，收集洗脫液，過0.22 μm濾膜后進(jìn)高效液相色譜儀測定。

1.2.5.3 按農(nóng)業(yè)部781號公告-6-2006方法凈化的優(yōu)化方法

雞蛋樣品備用樣液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，加入水飽和的正己烷10 mL，置水平搖床，振蕩10 min，4 ℃條件下以10 000 r/min離心5 min，用吸管吸去上層的正己烷，保留中間絮凝層；再加入10 mL水飽和正己烷，重復(fù)振蕩和離心，精密移取下層清液3 mL，加入依次用乙腈、乙腈（30%）-緩沖液和磷酸鹽提取液各5 mL平衡過的C18固相萃取柱中，過柱后，5 mL水淋洗，擠干。用1 mL流動相洗脫，擠干，收集洗脫液，過0.22 μm濾膜后進(jìn)高效液相色譜儀測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)評價

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

對“1.2.3”中各濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別按“1.2.2”色譜條件的雞肉、雞蛋兩種不同流速條件進(jìn)行分析，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中藥物的濃度為橫坐標(biāo)（x軸），對應(yīng)色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)（y軸），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。四種藥物在設(shè)定的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）均能達(dá)到0.999 9。具體結(jié)果如表1所示。

表1 4種氟喹諾酮類藥物的線性范圍、回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)Table 1 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients of four fluoroquinolones

2.1.2 檢測限與定量限

取空白的雞肉、雞蛋樣品添加適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，制成不同濃度的空白添加樣品，按“1.2.4”的提取方法提取，“1.2.5”的加熱快速沉淀法凈化處理完成后上機(jī)分析。以信噪比（S/N）≥3所對應(yīng)的添加濃度為檢測限（LOD），S/N≥10所對應(yīng)的添加濃度為定量限（LOQ），采用加熱快速沉淀法的檢測靈敏度結(jié)果如表2。

表2 4種氟喹諾酮類藥物的檢測限、定量限(g/kg)Table 2 LODs and LOQs of four fluoroquinolones

2.1.3 回收率與精密度

雞肉：共設(shè)置3個濃度組，取空白雞肉，添加混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，以CIP為參考，制成濃度分別為20、40、100 μg/kg（相當(dāng)于農(nóng)業(yè)部 1025號公告-14-2008方法LOD的1倍、2倍、5倍）的空白添加樣品，每組設(shè)置6個平行樣品，2個空白對照，重復(fù)3個批次。除樣品外，每個濃度組設(shè)置1個由流動相配成的標(biāo)準(zhǔn)對照溶液和1個由基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)對照溶液，標(biāo)準(zhǔn)對照溶液濃度與對應(yīng)濃度組的理論上機(jī)濃度一致，并以前者為對照計算加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。使用快速加熱沉淀法時，各濃度組具體回收率及RSD如表3所示。

表3 雞肉中4種氟喹諾酮類藥物的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Recoveries, intra-assay and inter-assay RSDs of four fluoroquinolones in chicken

雞蛋：設(shè)置3個濃度組，取空白雞蛋，添加混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，以CIP為參考，制成濃度分別為10 μg/kg、20 μg/kg、50 μg/kg（相當(dāng)于農(nóng)業(yè)部 781 號公告-6-2006方法LOD的1倍、2倍、5倍）的空白添加樣品，每組設(shè)置6個平行樣品，2個空白對照，重復(fù)3個批次。除樣品外，每個濃度組設(shè)置1個用流動相配成的標(biāo)準(zhǔn)對照溶液和1個由基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)對照溶液，標(biāo)準(zhǔn)對照溶液濃度與對應(yīng)濃度組的理論上機(jī)濃度一致，并以前者為對照計算加標(biāo)回收率及RSD。使用快速加熱沉淀法時，各濃度組具體回收率及RSD如表4所示。

表4 雞蛋中4種氟喹諾酮類藥物的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 4 Recoveries, intra-assay and inter-assay RSDs of four fluoroquinolones in egg

2.2 討論與分析

2.2.1 色譜條件

農(nóng)業(yè)部781號公告-6-2006和農(nóng)業(yè)部1025號公告-14-2008中使用的流動相均為0.05 mol/L磷酸/三乙胺溶液-乙腈，比例分別為 81:19和 82:18，流速分別為1.0 mL/min和 0.8 mL/min，色譜柱為 C18250 mm×4.6 mm。為使能力驗證的工作流程盡量簡約，在國標(biāo)法的流動相條件下，對比了不同型號的色譜柱。GL-sciences Inc Inertsil ODS2 C18、伊利特Hypersil BDS C18和Supelco Discovery C18的藥物峰形不夠理想；Agilent Extend C18、Waters Nova-Pak C18的藥物出峰較早，CIP、DAN和ENR的色譜峰分離不夠徹底；相對其他型號色譜柱，Agilent TC-C18色譜柱在等度洗脫條件下對國標(biāo)中的4種FQs藥物有較好的分離效果，藥物峰型尖銳、對稱，基線平穩(wěn)，對空白雞肉和雞蛋的分析均未見明顯干擾峰，每次進(jìn)樣能在20 min以內(nèi)實現(xiàn)藥物的分離和測定。

2.2.2 方法的靈敏度和精密度

快速加熱沉淀法雖然是對樣品進(jìn)行了稀釋，但由于背景干擾低，通過加大進(jìn)樣量（50 μL），仍能獲得較好的檢測靈敏度。快速加熱沉淀法應(yīng)用于雞肉檢測時，4種FQs藥物的LOD為1 μg/kg~10 μg/kg，LOQ為4 μg/kg~20 μg/kg，添加回收率為81.08%~103.09%；應(yīng)用于雞蛋時，4種藥物L(fēng)OD為0.5 μg/kg~5 μg/kg，LOQ為2 μg/kg~10 μg/kg，回收率為77.60%~102.94%，詳見表2~表4。靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度均能滿足NY/T 1896-2010《獸藥殘留實驗室質(zhì)量控制規(guī)范》的要求[18]，相較于其他文獻(xiàn)方法（如表5所示）也具有一定優(yōu)勢。

表5 相關(guān)文獻(xiàn)方法及其效果Table 5 Methods and effects of relevant literature

雞肉和雞蛋定量限添加樣品檢測色譜圖見圖1。

圖1 雞肉及雞蛋定量限添加樣品色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of chicken and egg samples with quantitative limit

2.2.3 樣品凈化方法優(yōu)化

雞肉和雞蛋均含有較高比例的蛋白質(zhì)，蛋黃中卵磷脂的含量也很高[23]，樣品的前處理重點(diǎn)在于提取藥物并分離蛋白質(zhì)和脂類等物質(zhì)，上述兩個國標(biāo)檢測方法中均采用pH值7.0的磷酸鹽緩沖液作為提取劑，經(jīng)測試，該方法提取步驟帶入的干擾物質(zhì)少，對氟喹諾酮類藥物的提取率較高。但兩者的過 SPE柱凈化步驟均存在一定缺陷，容易引起堵柱或出現(xiàn)回收率偏低的問題。

加熱快速沉淀法主要是利用低含量乙腈結(jié)合加熱的物理作用使蛋白質(zhì)等雜質(zhì)迅速淀沉和分離。溫度高于 50 ℃時，蛋白質(zhì)的凝集效果較好，且溫度越高凝集越快，但溫度過高則易造成溶劑揮發(fā)或藥物分解[24]。選用 55 ℃的水浴條件既可以滿足沉淀雜質(zhì)的需求，又不會影響準(zhǔn)確定量。若上機(jī)樣液中的乙腈比例過高，色譜峰會出現(xiàn)前移、峰寬變大或“M”型峰等情況。添加0.2 mL乙腈足夠沉淀雜質(zhì)，樣液中乙腈比例與流動相中的乙腈比例相近，過濾后可直接進(jìn)高效液相色譜儀分析。由于操作簡單易控，相對于過SPE柱的凈化方式，具有更好的重現(xiàn)性、準(zhǔn)確性和過程可控性。加熱快速沉淀法只需使用1 mL備用液，不影響樣品檢測繼續(xù)按國標(biāo)方法完成實驗和測定。利用加熱快速沉淀法對質(zhì)控樣品檢測的準(zhǔn)確度和精密度評價，并將檢測結(jié)果與按國標(biāo)方法完成實驗的結(jié)果進(jìn)行比較，能相對可靠的評估按國標(biāo)方法檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。采用加熱快速沉淀法能為參加能力驗證實驗室多提供一次評估結(jié)果準(zhǔn)確性的參比機(jī)會。

農(nóng)業(yè)部1025號公告-14-2008的凈化方法中，雖然只分取5 mL備用液上樣進(jìn)行SPE凈化，但在雞肉樣品實際檢測中，由于備用液中含有蛋白質(zhì)和脂肪，堵柱的情況仍常有發(fā)生。如果先將過柱備用液置于-20 ℃凍結(jié)，使脂肪和蛋白質(zhì)凝集，重新解凍后高速離心，再取上清液過SPE凈化，堵柱和回收率低兩個問題皆得到很好的解決，具體回收率對比見圖2。淺色部分為按照原方法操作的回收率，其中20 μg/kg濃度組實驗中未出現(xiàn)堵柱現(xiàn)象，該份樣品為新鮮雞肉；40 μg/kg和100 μg/kg添加濃度組皆出現(xiàn)了堵柱現(xiàn)象，該份樣品為經(jīng)凍融過的雞肉。深色部分為按國標(biāo)的凈化方法優(yōu)化后的回收率，結(jié)果較為理想。

圖2 雞肉樣品回收率對比圖Fig.2 Comparison of chicken sample recovery

在農(nóng)業(yè)部781號公告-6-2006中，雞蛋備用液需進(jìn)行兩次除脂肪操作，在除脂肪時要求棄去中間由正己烷與水相形成的絮凝層，取全量下層清液過柱凈化，由于棄去的絮凝層帶走藥物，導(dǎo)致回收率偏低。備用液中含有大量的蛋黃成分的脂溶性成分卵磷脂，在除脂肪操作中經(jīng)激烈的渦旋、振蕩容易使正己烷與水相產(chǎn)生乳化，離心后在兩相中間形成絮凝層，混合方式越劇烈，形成的絮凝層越厚，備用液損失越多，藥物損失也越嚴(yán)重。對比了手動翻轉(zhuǎn)、渦旋、搖床水平振蕩等操作，不同的混合方式對下層備用液體積、絮凝層體積和除脂效果有較大影響，具體結(jié)果如表6所示。對國標(biāo)方法農(nóng)業(yè)部 781號公告-6-2006的凈化優(yōu)化方法建議如下：雞蛋備用液先加入少量純水定容至6 mL；除脂操作選擇中速振蕩的方式；為減少檢測目標(biāo)物損失，在第一次除脂中保留中間絮凝層；第二次除脂后只分取3 mL下層備用液進(jìn)行SPE凈化。優(yōu)化后的方案有效提高了定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，具體回收率對比見圖3，其中淺色部分為按照原方法操作并全量過柱得到的回收率，深色部分為按照優(yōu)化后的凈化方法操作得到的回收率。

表6 正己烷與備用液的振搖方式對除脂效果的影響Table 6 Influence of vibration mode of n-hexane and standby liquid on the effect of fat removal

圖3 雞蛋樣品回收率對比圖Fig.3 Comparison of egg sample recovery

3 結(jié)論

本文對農(nóng)業(yè)部1025號公告-14-2008和農(nóng)業(yè)部781號公告-6-2006兩個現(xiàn)行有效國標(biāo)法檢測方法的樣品前處理提出了優(yōu)化方案，優(yōu)化后的方法可以應(yīng)用于雞肉、雞蛋的FQs藥物殘留檢測，步驟簡單、可操作性強(qiáng)、準(zhǔn)確可靠，能滿足生產(chǎn)企業(yè)日常自檢以及檢測機(jī)構(gòu)的批量樣品的快速篩查需要。對于需要使用該上述國標(biāo)方法完成能力驗證的檢測機(jī)構(gòu)，優(yōu)化后的方案能為能力驗證檢測工作多提供一份檢測技術(shù)參比和質(zhì)量保障，有助于對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確判定。