干細胞動員對急性肺損傷幼鼠肺泡表面活性蛋白的影響

黃國日,潘革,莫錦麗,楊蘭,黃忠向

(1.廣西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院兒科，廣西南寧 530007；2.廣西醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院a.兒科，b.檢驗科，c.病理科,廣西南寧 530031)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)以呼吸困難為主要表現，患者可在各個年齡段發(fā)病，是目前臨床危重醫(yī)學研究重點[1]。ALI的病理改變在于過度炎癥反應使肺血管內皮細胞、肺泡上皮細胞遭受廣泛性破壞，如肺泡表面活性物質(SP-A、SP-D、AQP5等)合成減少，因此改善肺泡表面活性物質水平逐漸成為ALI患者治療靶點[2]。骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)為一類非造血細胞的多能干細胞，具有向多種組織細胞分化的能力[3]。近年來隨著對干細胞多向分化潛能研究深入，發(fā)現干細胞可再生修復ALI的肺泡上皮細胞和內皮細胞，重建損傷的肺組織結構及功能，成為ALI治療新靶點，并可能是未來治療ALI患者的關鍵所在[4]。本實驗通過對幼鼠自體骨髓干細胞進行動員，擴增入血，分析動員后肺泡表面活性蛋白水平變化，進而找到治療ALI的新途徑，為下一步臨床開展兒童ALI的救治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選取無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級BALB/c品系健康幼鼠120只，體重174～230 g，平均(201.32±20.56) g，由廣州四和生物科技有限公司提供，實驗動物生產許可證號：44007200101674，使用許可證號：SCXK(粵)2016-0041，采用隨機數字表將實驗動物隨機分為對照組和動員組，每組60只。 對照組雄性20只，雌性40只，平均體重(201.18±21.21) g；動員組雄性27只，雌性33只，平均體重 (202.76±22.05) g。兩組性別、體重比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。實驗開展前，幼鼠均飼養(yǎng)1周(飼養(yǎng)溫度設置為21 ℃)，自由進食和飲水。飼養(yǎng)觀察1周無異常后進行實驗，實驗期間無幼鼠死亡。本實驗獲得廣西醫(yī)科大學動物實驗中心倫理委員會批準。

1.2 實驗主要儀器及試劑蘇州安泰潔凈工作臺(SW-CJ-IFD)，低速離心機(中佳，SC3614)，倒置光學顯微鏡(OLYMPUS CKX41, U-CTR30-2),倒置熒光顯微鏡(生產商：Leica，型號：DMI6000B)、臺式高速冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，TGL-16)、分光光度計(廠家：上海五久自動化設備有限公司，UV-2100PC型)、核酸蛋白測定儀(廠家：德國eppendorf，型號：22331 Hamburg)、ABI7500熒光PCR儀(廠家：美國愛普拜斯/ABI，型號：ABI PRISM7500 Sequence Detection System)、880型酶標儀(德國拜發(fā)儀器公司)等。試劑：精制大腸桿菌內毒素脂多糖(美國Sigma公司)；重組人粒細胞刺激因子(rhG-CSF，中國醫(yī)學科學院昆明醫(yī)學生物研究所，150 μg/支)；SP-A、SP-D、AQP5抗體(英國Abcam公司)；反轉錄試劑盒、SYBR Green實時定量PCR試劑盒(美國Sigma公司)。

1.3 實驗方法⑴急性肺損傷幼鼠模型[5]建立。予精制大腸桿菌內毒素脂多糖(LPS，美國Sigma公司)5 mg/kg溶于0.5 mL生理鹽水后經腹腔注射至幼鼠體內，建立內毒素肺損傷幼鼠模型共120只，全部幼鼠24 h內出現呼吸窘迫、倦怠、蜷縮、對外界刺激敏感，并有泡沫狀分泌物(帶血性)由鼻腔溢出，不喜歡活動等癥狀，表明造模成功。隨后幼鼠在造模成功24 h后同一時間內動員組給予皮下注射rhG-CSF 30 μg/(kg·d)動員自體骨髓干細胞，對照組注射等容積量生理鹽水,均連續(xù)注射5天。⑵標本采集。每組幼鼠在干預后5 d、10 d、14 d，腹腔注射3%戊巴比妥鈉(1 mg/kg)麻醉并斷頸法各處死20只，取部分左肺組織在生理鹽水中迅速漂洗干凈后，立即放入液氮中冷凍，后轉入-70 ℃冰箱中低溫保存。⑶標本檢測。①HE染色觀察組織形態(tài)學變化：以IMS圖像分析系統(tǒng)測定陽性表達強度，并檢測肺組織干預后5 d、10 d、14 d 輻射狀肺泡計數(RAC)值；HE染色方法：首先使用石蠟切片脫蠟脫水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ20 min→二甲苯Ⅱ20 min→無水乙醇Ⅰ5 min→無水乙醇Ⅱ5 min→75%酒精5 min，自來水洗。然后進行蘇木素染色：切片入蘇木素染液染3～5 min，自來水洗，分化液分化，自來水洗，返藍液返藍，流水沖洗。再以伊紅染色：切片依次入85%、95%的梯度酒精脫水各5 min，入伊紅染液中染色5 min。而后進行脫水封片：切片依次放入無水乙醇Ⅰ 5 min→無水乙醇Ⅱ 5 min→無水乙醇Ⅲ 5 min→二甲Ⅰ5 min→二甲苯Ⅱ5 min透明，中性樹膠封片。最后使用顯微鏡鏡檢，圖像采集分析，對肺組織損傷情況[6]進行半定量分析，其中1分、2分、3分及4分分別為肺組織正常、細支氣管外周附近存在輕度淋巴細胞浸潤、細支氣管外周附近存在中度中性粒細胞浸潤且肺泡內部存在散在浸潤、大部分肺泡以及細支氣管中均存在重度炎癥細胞浸潤，進行分析時每張切片均需要觀察10個不同位置視野，最終結果為其均值。根據圖片中RAC，用SPSS計算RAC均值與方差。②免疫組化法測定肺組織中SP-A、SP-D、AQP5特異性表面標志物水平：小鼠肺組織石蠟切片烤片后脫蠟、脫水后應用3%H2O2置于37 ℃環(huán)境下孵育10 min，磷酸緩沖溶液沖洗后進行內源性過氧化物酶滅活處理，添加枸櫞酸緩沖液置于高壓鍋中予以抗原修復處理5 min，置于室溫環(huán)境下冷卻，應用10%山羊血清進行封閉，滴加多克隆抗體SP-A、SP-D、AQP5后置于4 ℃環(huán)境下孵育過夜處理，陰性對照則以磷酸緩沖液作為一抗。第2天添加辣根過氧化物酶標記鏈霉素置于37 ℃環(huán)境下孵育，孵育結束后進行DBA染色、蘇木精復染、脫水、透明、干燥以及封片，最后置于顯微鏡下拍片觀察，使用image J軟件對陽性細胞比例(陽性細胞所占總數的比值)及染色強度(光密度值)進行處理，其結果判讀為陽性細胞比例(0～4分)與染色強度(0～3分)乘積，滿分0～12分。③逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測肺組織勻漿SP-A、SP-D、AQP5 mRNA含量平均值變化：采用TRIzol法獲得肺組織總RNA，總RNA濃度與純度采用UV-2100PC型分光光度計測定，cDNA反轉錄采用反轉錄試劑盒測定，所有測定均嚴格按照試劑盒說明書進行操作。SP-A、SP-D、AQP5 mRNA含量采用RT-PCR測定，反應體系按照SYBR Green實時定量PCR試劑盒配置，反應條件為：94 ℃、52 ℃、72 ℃條件下分別變性處理30 s、退火處理30 s、延伸處理30 s，一共處理30個循環(huán)，最后在72 ℃條件下延伸處理5 min，最后依據2-(待測樣品中目的基因△Ct-參照樣品中目的基因△Ct))計算SP-A、SP-D、AQP5 mRNA水平，內參基因選擇β-actin，各指標引物見表1。

表1 引物序列

1.4 觀察指標干預后5 d、10 d、14 d比較兩組小鼠肺部RAC值變化；肺組織中特異性表面標志物SP-A、SP-D、AQP5蛋白表達情況；肺組織勻漿SP-A、SP-D、AQP5 mRNA含量平均值變化。

2 結 果

2.1 HE染色結果模型制備后觀察到對照組、動員組肺泡壁溶解，肺泡間隔斷裂，對照組干預后5 d、10 d肺臟組織肺泡擴張不良，肺泡內中性粒細胞浸潤，部分出現蛋白滲出，肺泡壁增厚，動員組病變與對照組相似，但其中炎癥細胞、中性粒細胞較對照組少；干預后14 d，對照組仍存在炎性浸潤，蛋白滲出明顯，毛細血管擴張充血，肺泡腔仍存在，而動員組炎癥細胞少，蛋白滲出程度減輕。半定量肺損傷評分結果顯示，對照組評分逐漸增加(P<0.05)，動員組干預后10 d與14 d評分均高于干預后5 d(P<0.05)，而干預后10 d半定量肺損傷評分與14 d比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；干預后5 d動員組半定量肺損傷評分與對照組比較無差異，而干預后10 d、14 d，動員組半定量肺損傷評分均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2與圖1。

表2 各組HE染色半定量肺損傷評分結果比較(分,

注：紅色箭頭示肺泡壁溶解，肺泡融合，形成不規(guī)則腔，黃色箭頭示紅細胞滲出及炎癥細胞浸潤。A、B、C分別為干預后5 d、10 d、14 d對照組HE染色結果(×200)；D、E、F分別示干預后5 d、10 d、14 d動員組HE染色結果(×300)圖1 兩組HE染色病理圖片

2.2 干預后RAC值比較干預后5 d、10 d、14 d 動員組RAC值高于對照組，動員組RAC值逐漸變大，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 干預后RAC值比較(個，

2.3 干預后SP-A、SP-D、AQP5蛋白表達結果免疫組化檢測干預后5 d、10 d、14 d肺組織中特異性表面標志物SP-A、SP-D、AQP5蛋白表達情況，對照組干預后5 d、10 d、14 d肺組織中SP-A、SP-D、AQP5蛋白表達無明顯變化，動員組干預后5 d、10 d、14 d肺組織中SP-A、SP-D、AQP5蛋白表達逐漸增多，且高于對應時間點的對照組，比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4和圖2-圖7。

表4 干預后SP-A、SP-D、AQP5蛋白表達結果比較(分，

A:第5天；B:第10天；C:第14天圖3 動員組肺組織中特異性表面標志物SP-A表達情況

A:第5天；B:第10天；C:第14天圖5 動員組肺組織中特異性表面標志物SP-D表達情況

A:第5天；B:第10天；C:第14天圖6 對照組肺組織中特異性表面標志物AQP5蛋白表達情況

A:第5天；B:第10天；C:第14天圖7 動員組肺組織中特異性表面標志物AQP5蛋白表達情況

2.4 干預后相關mRNA含量變化對照組干預后5 d、10 d、14 d SP-A、SP-D、AQP5 mRNA含量無明顯變化(P>0.05)，動員組干預后5 d、10 d、14 d SP-A、SP-D、AQP5 mRNA表達含量顯著升高(P<0.05)，且動員組干預后5 d、10 d、14 d SP-A、SP-D、AQP5 mRNA含量高于對照組(P<0.05)。見表5、圖8-圖10。

表5 干預后相關mRNA含量變化

圖8 干預后SP-A mRNA相對表達量

圖9 干預后SP-D mRNA相對表達量

圖10 干預后AQP5 mRNA相對表達量

3 討 論

ALI是兒科常見和潛在的危害極大疾病之一，為由心源性以外的各種肺內外致病因素導致的肺部炎癥，可損傷患兒毛細血管內皮，破壞肺泡毛細血管屏障，盡管目前已廣泛采用重癥監(jiān)護、機械通氣等手段對ALI患兒進行干預，但因ALI確切機制尚未完全闡明，更無有效的防治手段, 其死亡率仍較高[7]。ALI的病理特征主要是肺泡毛細血管壁破裂，隨著肺泡中蛋白質滲出，引發(fā)肺水腫，最終氣體交換障礙而發(fā)生呼吸衰竭[8],這種疾病的組織學特征是肺表面活性物質表達減少、肺部嚴重急性炎癥反應、中性粒細胞性肺泡炎[9-10]。骨髓干細胞動員是新興細胞移植方法，通過利用細胞因子使骨髓中干細胞進入外周血，經血液循環(huán)進入損傷組織繼而達到細胞移植的目的，是目前ALI治療的新靶點[11]。

本研究HE染色發(fā)現，在建立幼鼠ALI模型后肺泡壁溶解，肺泡間隔斷裂，尤其是對照組在干預后5 d、10 d肺臟組織肺泡擴張不良，肺泡內中性粒細胞浸潤，部分出現蛋白滲出，肺泡壁增厚，動員組病變與對照組相似，但其中炎癥細胞、中性粒細胞較對照組少，至干預后14 d對照組仍有炎性浸潤，蛋白滲出較明顯，而動員組炎癥細胞少，蛋白滲出程度輕。干預后5 d、10 d、14 d，動員組半定量肺損傷評分均低于對照組，動員組RAC值高于對照組，表明采用LPS成功建立ALI模型，而經皮下注射rhG-CSF進行骨髓干細胞動員后可較好改善幼鼠ALI癥狀，減少炎癥細胞浸潤，這與宋靜等人[12]的研究結論相符。肺泡上皮細胞、血管內皮細胞損傷為ALI的主要特點，肺泡上皮僅有兩種類型的上皮細胞，即肺泡Ⅰ型上皮細胞(AEC-Ⅰ)、肺泡Ⅱ型上皮細胞(AEC-Ⅱ)，AEC-Ⅱ是肺泡上皮干細胞, 有合成并分泌磷脂及蛋白質組成的肺表面活性物質(pulmonary surfactant，PS)作用，而PS具有降低肺泡表面張力和維持氣道內液體平衡等重要生理作用，維持著肺呼吸功能及非呼吸功能，其中SP-A、SP-D具備肺局部先天性免疫功能，可凝聚病原微生物，對免疫細胞有趨化作用及調理吞噬作用[13]。水通道蛋白5(AQP5)則主要分布在下呼吸道，可維持肺泡腔中相對干燥的環(huán)境，保證機體有效進行氣體交換，相關研究證實APQ5表達下調會造成肺間質及肺泡內水轉運障礙，繼而加重肺泡腔、肺間質水腫[14]。本次免疫組化法顯示動員組干預后5 d、10 d、14 d肺組織中SP-A、SP-D、AQP5蛋白表達增多，且高于對照組，而RT-PCR檢測發(fā)現動員組干預后5 d、10 d、14 d SP-A、SP-D、AQP5 mRNA含量顯著高于對照組，這與宋靜等人[15]的研究基本一致，表明干細胞動員有助于促進ALI幼鼠肺表面活性蛋白SP-A、SP-D、AQP5的表達，骨髓充質間干細胞經血液循環(huán)在肺內定植，且易于迅速擴增，并向肺上皮細胞、內皮細胞分化，短期內便能得到治療所需細胞量，從而參與急性肺損傷修復。rhG-CSF為近年來發(fā)現的有力動員劑，在一定條件下可使骨髓間充質干細胞轉化為Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞及支氣管上皮細胞[16]，此外rhG-CSF對新生大鼠肺組織巨噬細胞的終末分化起著關鍵作用，采用rhG-CSF持續(xù)治療能有效保持巨噬細胞功能，減少炎癥細胞因子浸潤，使肺水腫、膠原沉積、肺纖維化減輕，并激發(fā)修復的生長因子生長，抑制肺泡壁細胞凋亡，從而對ALI起到較好的治療作用[17]。本研究中干預后5 d、10 d、14 d動員組SP-A、SP-D、AQP5蛋白與mRNA水平持續(xù)上升，提示干細胞動員可發(fā)揮持續(xù)肺損傷修復作用，但研究亦發(fā)現動員組干預后10 d、14 d半定量肺損傷評分均高于干預后5 d，而干預后10 d肺損傷評分與14 d比較沒有統(tǒng)計學意義。原因可能為造模成功后LPS對肺組織損傷明顯，即使注射了rhG-CSF進行骨髓干細胞動員，因肺組織SP-A、SP-D、AQP5 mRNA含量及SP-A、SP-D、AQP5蛋白表達有限，但仍導致肺組織修復速度可能小于肺損傷速度。同時觀察到動員組干預10 d之后，SP-A、SP-D、AQP5蛋白多量表達，使其對于肺組織損傷修復速度可能較對照組高。

綜上所述，干細胞動員能較好促進ALI模型幼鼠肺泡表面活性蛋白(SP-A、SP-D、AQP5)再生，促進肺功能恢復，這為ALI患兒開展干細胞動員救治提供了理論依據。