腫瘤類器官的研究進展及應用*

方艷芬，郭屾淼

1中國科學院上海藥物研究所，上海 201203；2上海市洋涇中學，上海200122

隨著腫瘤基礎(chǔ)研究的深入、早診早治理念的推廣以及新診療手段的發(fā)現(xiàn)，特別是近三十年分子靶向治療藥物的研發(fā)，腫瘤患者的五年生存率獲得極大提高。但是惡性腫瘤依然是威脅人類生命健康的重大問題，仍需通過基礎(chǔ)研究的深入尋找開發(fā)更為有效的腫瘤治療藥物和治療方法，以及更精確地發(fā)現(xiàn)相應的受益人群。

腫瘤基礎(chǔ)研究和抗腫瘤藥物研發(fā)及相應應用方案的發(fā)現(xiàn)都需要準確、可靠且可重復的藥效學模型予以支持。目前常用的模型主要是由人或動物的腫瘤組織構(gòu)建的細胞株和利用這些細胞株構(gòu)建的動物模型，但是由于長期在體外培養(yǎng)，腫瘤細胞株的基因、生物學行為都發(fā)生了極大變化，已不能真實反映臨床腫瘤實際情況，導致由細胞株構(gòu)建的模型篩選得到的有效化合物在臨床試驗中屢屢碰壁。一項回顧性研究分析了2000 年～2015 年2 萬多個化合物的臨床試驗數(shù)據(jù)，結(jié)果表明成功率僅為3.4%[1]，因此，貼近臨床情況的腫瘤模型日益受到業(yè)界的關(guān)注和重視。直接利用病人來源的腫瘤樣本構(gòu)建從細胞到體內(nèi)的不同層次模型，被稱為病人來源腫瘤原代細胞株（patient-derived tumor cell，PDC）、病人來源腫瘤類器官模型（patient-derived organoids，PDO）和病人來源腫瘤異種動物模型（patient-derived xenograft，PDX）。這三類模型提供了更個性化、更符合人類腫瘤真實生物情況的實驗模型，能更真實、通用地反映腫瘤生物學特征和藥物的響應特征，有助于提高臨床轉(zhuǎn)化效率[2，3]。

類器官（organoids）是將多能干細胞或者成體干細胞/祖細胞在三維基質(zhì)中培養(yǎng)，通過自組裝形成與體內(nèi)來源組織或器官高度相似的三維組織[4，5]。PDO是利用基質(zhì)膠或者生物材料將癌癥患者原代腫瘤組織在體外進行三維培養(yǎng)構(gòu)建的培養(yǎng)物，是近十年發(fā)展形成的一種新型體外腫瘤研究模型。與以往只關(guān)注腫瘤細胞本身不同，PDO 立體地模擬體內(nèi)腫瘤生長的微環(huán)境，從而更好地保持人腫瘤細胞生長的特征，有助于維持高度異質(zhì)性，是新時代腫瘤研究領(lǐng)域的利器。本文將從PDO 研究進展、在腫瘤新藥研發(fā)和基礎(chǔ)研究中的應用及目前存在的問題這幾方面進行綜述。

1 腫瘤類器官的研究進展

1.1 腫瘤類器官的構(gòu)建現(xiàn)狀

2009年，Sato T等[6]報道了利用小鼠腸道干細胞構(gòu)建類器官的研究，由此開啟了類器官研究的時代。利用干細胞構(gòu)建類器官的實踐為PDO 的構(gòu)建提供了寶貴經(jīng)驗。不久之后，陸續(xù)有文獻報道由鼠源腫瘤或者癌癥患者來源的新鮮腫瘤組織構(gòu)建而成的PDO。用于構(gòu)建PDO 的腫瘤組織大部分來源于手術(shù)切除和活檢取樣，還有少量來自循環(huán)腫瘤細胞和胸、腹水積液。截止目前，十幾種不同系統(tǒng)來源的腫瘤已成功構(gòu)建PDO 模型，包括胰腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、肺癌、肝癌等[7]。其中絕大部分屬于上皮樣腫瘤，也有非上皮腫瘤PDO，包括膠質(zhì)母細胞瘤和橫紋肌樣瘤[8，9]。不同類型的腫瘤組織，PDO 模型的構(gòu)建成功率各不相同。腸癌、胰腺癌和卵巢癌的成功率較高，達到80%以上；而肝癌、前列腺癌的成功率則相對較低，僅約15%～30%[10-12]。相應地，目前已報道的結(jié)直腸癌、胰腺癌、胃癌PDO 例數(shù)累積均已達到幾百例，而肝癌、前列腺癌PDO 例數(shù)僅累積幾十例[11]。除了腫瘤類型，影響構(gòu)建成功率的因素還包括腫瘤分化程度、腫瘤樣本質(zhì)量、樣本分離到處理的間隔時間和保存條件等。

1.2 腫瘤類器官的優(yōu)勢

與細胞系構(gòu)建的細胞和動物模型相比，PDC、PDO 和PDX 均采用臨床腫瘤樣本構(gòu)建而成，重現(xiàn)且維持來源腫瘤組織的基因表達特征，具有貼近臨床的先天優(yōu)勢。PDC 是用病人的新鮮腫瘤組織分離獲得的腫瘤細胞，在體外培養(yǎng)體系中進行短期二維培養(yǎng)構(gòu)建的模型，具有成本較低、培養(yǎng)方便、實驗周期短、可進行高通量篩選的優(yōu)勢；但是PDC 構(gòu)建成功率低、二維培養(yǎng)方式不能反映腫瘤真實生長的細胞特性、原代腫瘤基因特征在傳代過程容易發(fā)生改變。PDX 是用病人的新鮮腫瘤組織直接移植到免疫缺陷小鼠從而建立皮下或原位移植瘤模型，能很好保存原發(fā)腫瘤的組織形態(tài)特征、模擬人腫瘤的病理生理環(huán)境；但由于腫瘤組織中缺乏某些免疫細胞，因此在免疫缺陷小鼠上構(gòu)建的類器官不適合評價一些免疫治療藥物，另外還存在成功率低、耗時長、成本高的問題[13]。

PDO 的生物學特性使其成為彌補PDC 和PDX不足的重要工具。由于采用三維培養(yǎng)，PDO 較好地保持腫瘤細胞與微環(huán)境基質(zhì)的接觸極性，高度呈現(xiàn)原代腫瘤組織的形態(tài)特征和基因組學特征，真實還原腫瘤異質(zhì)性、藥物敏感性等特性[14，15]。在合適的條件下，PDO 包含免疫細胞、腫瘤相關(guān)成纖維細胞等成分，能立體地模擬人體內(nèi)的腫瘤微環(huán)境，一定程度上可被視作半體內(nèi)模型。與PDC 相比，PDO 可以更加準確地呈現(xiàn)臨床腫瘤實際情況；與PDX 相比，PDO 形成時間短、傳代時間短，有利于實驗開展，適用于高通量篩選。

2 腫瘤類器官的應用

2.1 臨床前藥效評價和作用機制研究

目前，腫瘤類器官作為體外實驗模型，廣泛應用于新藥研發(fā)的臨床前研究，有助于提高新藥臨床試驗成功率，降低新藥研發(fā)成本和風險，因而已開始在臨床前研究中得到較廣泛的使用。Broutier L等[16]采用臨床肝膽腫瘤病人的手術(shù)樣本構(gòu)建了8 例肝膽PDO，利用其中6 例模型評價了29 個抗腫瘤藥物對腫瘤細胞增殖存活的影響，發(fā)現(xiàn)藥物敏感性與基因突變之間的相關(guān)性，例如CTNNB1突變與porcupine 抑制劑LGK974 耐藥、KRAS突變與EGFR 抑制劑AZD8931 耐藥之間有關(guān)聯(lián)。Hirt CK等[17]將自動化類器官培養(yǎng)、藥物遞送、細胞活力檢測等技術(shù)進行集成，開發(fā)并利用全自動PDO 藥物篩選平臺對1172 個獲得美國FDA 批準的臨床藥物（適應癥包括癌癥、炎癥、心血管及中樞系統(tǒng)疾病等）進行抗腫瘤活性篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)26 個藥物對胰腺導管癌類器官具有潛在抗腫瘤活性，其中19 個是尚未獲批用于胰腺癌治療的化療藥物，5 個是用于治療非腫瘤疾病（包括強心苷ouabain 和抗原蟲藥emetine 等）的藥物。體內(nèi)實驗進一步證實，ouabain和emetine 對胰腺導管癌腫瘤生長具有良好的抑制作用。他們還通過CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)構(gòu)建ARID1A錯義突變的PDO，發(fā)現(xiàn)相較于野生型，ARID1A突變的胰腺導管癌對多靶點酪氨酸激酶抑制劑達沙替尼和共濟失調(diào)毛細血管擴張突變基因Rad3 相關(guān)激酶（ataxia telangiectasia and Rad3-related，ATR）抑制劑VE-821 更為敏感。類似地，Lo YH 等[18]將PDO 高通量藥物篩選技術(shù)和CRISPR/Cas9 技術(shù)結(jié)合，在胃癌類器官模型中尋找基因組改變與藥物敏感性之間的關(guān)聯(lián)。在人正常胃組織類器官中敲除TP53和ARID1A，轉(zhuǎn)錄因子（forkhead box protein M1，F(xiàn)OXM1）及下游參與細胞增殖調(diào)控的基因顯著上調(diào)，進而促進胃癌的發(fā)生。高通量藥物篩選發(fā)現(xiàn)FOXM1 下游靶標BIRC5/Survivin 的抑制劑YM-155 能顯著抑制TP53/ARID1A雙敲除胃癌類器官的增殖存活。上述研究表明PDO 適用于高通量藥物篩選，結(jié)合基因組學、轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)，可建立基因表達/突變與藥物敏感性之間的關(guān)聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)可能指征藥物敏感性的生物標志物。此外，將PDO 技術(shù)與CRISPR/Cas9 基因敲除技術(shù)結(jié)合，可用于探索腫瘤耐藥機制及藥物合用克服策略，這些研究結(jié)果將有助于提高抗腫瘤治療效果[19]。

2.2 臨床個性化用藥方案制定

PDO 真實呈現(xiàn)原代腫瘤特性，且具有培養(yǎng)周期相對較短、操作方便等優(yōu)勢，有助于其用于臨床癌癥患者對于放化療藥物、分子靶向藥物、抗腫瘤抗體等藥物敏感性檢測，預測患者對藥物響應性的情況，具有輔助臨床治療決策的潛力。2018年，Science報道了一項轉(zhuǎn)移性胃腸道腫瘤類器官用于藥物敏感性測試的研究[20]，該研究比對分析了21 位臨床病人與其相應PDO 對一系列靶向及化療藥物敏感性差異，結(jié)果表明兩者具有很強的一致性。與患者實際療效進行對比，PDO 預測良好（敏感性100%、特異性93%、陽性預測值88%以及陰性預測值100%）。2020年，Yao Y等[21]利用112 例局部晚期直腸癌活檢組織構(gòu)建了96 例直腸癌類器官，選取其中80 例檢測其對放化療的響應，結(jié)果表明直腸癌類器官對放化療敏感性與病人臨床響應高度一致(敏感性78%，特異性92%、準確性84%）。隨后在胃癌、乳腺癌等腫瘤中，也發(fā)現(xiàn)PDO 與腫瘤患者對藥物響應的一致性情況。Yan HHN等[22]利用34 位胃癌病人的腫瘤組織、癌旁組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶構(gòu)建了一個胃癌類器官庫。其中有2 例發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，在手術(shù)后進行了順鉑和5-FU 聯(lián)合治療，兩者均有很好的響應。另1 例術(shù)前接受過化療，術(shù)后對卡培他濱無響應?？疾爝@3 例的PDO 相應化合物的敏感性，結(jié)果表明PDO 的藥敏性與各患者的臨床響應情況完全一致。Guillen KP等[23]利用內(nèi)分泌治療耐受、復發(fā)和轉(zhuǎn)移的乳腺癌病人腫瘤樣本構(gòu)建了PDX 及PDO，且對這些樣本進行了組織形態(tài)學、基因組和藥物敏感性檢測。結(jié)果表明，乳腺癌PDX 和PDO 均高度還原了其來源腫瘤的組織生物學和基因組學特性，而且兩者對抗腫瘤藥物的響應一致。該研究中一位處于ⅡA 期的三陰性乳腺癌患者，在經(jīng)歷術(shù)前化療和手術(shù)治療后1 年左右發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。研究者將構(gòu)建的PDO 和PDX 進行體內(nèi)外藥敏檢測，發(fā)現(xiàn)微管抑制劑艾瑞布林（erubulin）具有最佳治療效果。根據(jù)這一結(jié)果，指導病人接受艾瑞布林治療，用藥后肝轉(zhuǎn)移完全緩解，持續(xù)時間將近5 個月。這些研究在一定程度上證實了PDO 指導臨床腫瘤患者用藥的可能性，但所涉及的案例數(shù)較少，還需要更廣泛的研究來評價PDO 在臨床藥物敏感性預測中的價值。另外還有研究表明，通過比較正常類器官和PDO 對藥物的響應差異，發(fā)現(xiàn)選擇性高的藥物有助于降低臨床患者的毒副反應。由此可見，通過PDO 進行藥敏檢測，發(fā)現(xiàn)最合適的藥物治療方案，將有助于提高腫瘤患者臨床療效，降低毒副作用、耐藥風險和腫瘤復發(fā)幾率，使患者最大程度受益。

2.3 腫瘤發(fā)生發(fā)展機制的研究

2.3.1 腫瘤類器官作為腫瘤進展模型的應用 針對腫瘤患者疾病進展不同時期的PDO、原發(fā)和轉(zhuǎn)移灶PDO，采用多組學技術(shù)分析基因表達、突變、表觀遺傳修飾等差異，有助于探索發(fā)現(xiàn)促進腫瘤進展和轉(zhuǎn)移的新機制，為抗腫瘤新藥研發(fā)提供新的分子靶標。Roe JS等[24]利用轉(zhuǎn)基因KPC 小鼠胰腺導管癌的原發(fā)和轉(zhuǎn)移腫瘤組織構(gòu)建PDO，轉(zhuǎn)錄組學分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶PDO 中轉(zhuǎn)錄因子（FOXA1）表達明顯增加。進一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXA1 誘導增強子重編程，從而使癌細胞具有轉(zhuǎn)移性。Mo S等[25]利用轉(zhuǎn)錄組學、基因組學和單細胞測序技術(shù)比較了結(jié)直腸癌病人原發(fā)灶和肝轉(zhuǎn)移灶PDO，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶腫瘤較好地保留了相應原發(fā)腫瘤的驅(qū)動基因突變特征，另外也產(chǎn)生一些新的突變圖譜，這些突變是否驅(qū)動腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移有待進一步研究。

蛋白質(zhì)組學對于腫瘤研究具有重要價值，但對用于檢測的腫瘤樣本量需求較大，因而限制其廣泛應用。通過體外PDO 培養(yǎng)實現(xiàn)微量腫瘤組織的擴增，可為蛋白質(zhì)組學檢測提供足夠的樣本量。2015年，Boj SF等[26]利用iTRAQ 技術(shù)對小鼠正常胰腺導管類器官、胰腺上皮內(nèi)腫瘤類器官、胰腺導管腺癌類器官進行蛋白質(zhì)組學分析，發(fā)現(xiàn)正常胰腺導管類器官和胰腺上皮內(nèi)腫瘤類器官間存在710 個差異蛋白，正常胰腺導管類器官和胰腺導管腺癌類器官間存在1047 個差異蛋白。將這些數(shù)據(jù)與轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)進行對比，發(fā)現(xiàn)正常胰腺導管類器官和胰腺上皮內(nèi)腫瘤類器官、正常胰腺導管類器官和胰腺導管腺癌類器官間的差異表達在兩種分析中均出現(xiàn)的概率分別是40%和70%左右，說明蛋白穩(wěn)定性在胰腺癌演化進程中也發(fā)揮重要作用。Cristobal A等[27]利用Dimethyl 標記的蛋白質(zhì)組學分析了臨床病人來源的結(jié)直腸癌類器官和癌旁正常結(jié)直腸組織類器官的蛋白表達差異，共鑒定出5790 個蛋白，其中78個蛋白發(fā)生上調(diào)，227 個蛋白發(fā)生下調(diào)。與轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)進行對比，這305 個差異表達蛋白中有22 個在兩種分析中出現(xiàn)了一致的變化。類器官和蛋白質(zhì)組學技術(shù)的結(jié)合可以獲得蛋白層面的數(shù)據(jù)，為全面掌握腫瘤的生物學特征提供有力的研究手段。

2.3.2 腫瘤類器官在發(fā)現(xiàn)腫瘤抑制或驅(qū)動基因中的應用 利用正常類器官或者腫瘤類器官，通過分子生物學手段進行基因敲除、敲減或者過表達，可用于揭示相關(guān)基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用。例如BAP1（BRCA1-associated protein 1），它是去泛素化酶家族成員之一，參與調(diào)控多種細胞生物學功能，包括基因組穩(wěn)定性、DNA 雙鏈斷裂、細胞周期、凋亡等過程，但它在成人肝穩(wěn)態(tài)和肝臟腫瘤發(fā)生中的作用并不清楚。Artegiani B等[28]利用CRISPR/Cas9技術(shù)在正常人肝導管類器官中敲除BAP1，發(fā)現(xiàn)BAP1 通過調(diào)控染色質(zhì)可及性來控制細胞連接和細胞骨架相關(guān)基因表達，可影響細胞極性，使細胞喪失多種上皮特征，運動性增強。通過基因編輯技術(shù)使人肝導管類器官類器官攜帶TP53、PTEN、SMAD4和NF1 突變，分析敲除BAP1 對肝導管細胞惡化的影響，發(fā)現(xiàn)BAP1 敲除的肝導管類器官具有體內(nèi)成瘤性，腫瘤組織形態(tài)學特征與臨床膽管癌類似。該研究表明調(diào)節(jié)染色質(zhì)可及性來控制上皮細胞是BAP1作為腫瘤抑制因子發(fā)揮功能的關(guān)鍵因素之一。

TGF-β 信號通路可抑制腸上皮細胞增殖，因此在腸道類器官培養(yǎng)條件中需要加入抑制劑抑制該信號通路提高構(gòu)建效率，撤除抑制劑或者添加重組TGF-β 有效抑制結(jié)腸類器官生長[29]。利用這一特點，科學家們在腸道類器官中進行CRISPR/Cas9 基因敲除文庫轉(zhuǎn)染，撤除TGF-β 受體抑制劑或添加重組TGF-β 進行陽性篩選，尋找新的腫瘤抑癌基因（tumor suppressor gene，TSG）。Michels BE等[30]利用有APC-/-和KRASG12D突變的癌前結(jié)腸類器官篩選一個泛癌TSG gRNA庫，發(fā)現(xiàn)一系列潛在的抑癌基因，包括在結(jié)腸癌中發(fā)生高頻突變的基因（TGFBR2、SMAD4、PIK3R1、ZC3H13和FBXW7），及在結(jié)腸癌中并未見報道，但與其他腫瘤密切相關(guān)的基因（STK11、PBRM1和ZFP36L1）。Ringel T等[31]利用野生和APC敲除的人小腸類器官進行CRISPR/Cas9基因敲除文庫篩選，發(fā)現(xiàn)一些與TGF-β 耐藥性相關(guān)的基因，包括CNIH4、KEAP1、NBAS和SWI/SNF 亞單位（ARID1A和SMARCA4）等。進一步研究發(fā)現(xiàn)，ARID1A和SMARCA4介導的染色體重塑參與調(diào)控TGF-β 下游靶基因轉(zhuǎn)錄，進而抑制腫瘤生長。當ARID1A和SMARCA4發(fā)生突變，染色體重塑受到抑制，TGF-β 下游靶基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生改變，腫瘤細胞發(fā)生惡性增殖。這些研究展現(xiàn)了PDO 結(jié)合基因編輯技術(shù)在研究發(fā)現(xiàn)新型腫瘤原癌或抑癌基因中的潛能。

2.3.3 腫瘤類器官在病原體相關(guān)腫瘤進展機制研究中的應用 對于肝癌、胃腸道腫瘤等涉及微生物感染的癌癥類型，采用相關(guān)病毒或細菌感染正常類器官或者PDO，可研究微生物在腫瘤演化進程中的確切角色。比如乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是肝癌最重要的致病風險之一，特別在中國，是肝癌發(fā)生的主要誘因。但由于缺乏合適的實驗模型，HBV 的致癌機制并不明確。De Crignis E等[32]利用HBV 感染由肝硬化病人的病理肝組織構(gòu)建而成的肝臟類器官，轉(zhuǎn)錄組學分析發(fā)現(xiàn)這些類器官存在異常的早期癌癥基因特征，為HBV 誘發(fā)的肝癌發(fā)生發(fā)展機制研究提供線索，也為治療提供潛在的候選靶標。腸道菌群也被認為與結(jié)直腸癌的發(fā)生密切相關(guān)。如大腸埃希菌（Escherichia coli，E.coli）基因組包含一個50 Kb 雜合聚酮非核糖體肽合酶操縱子（pks），可產(chǎn)生小分子毒性物質(zhì)colibactin，破壞細胞DNA。有研究將具有遺傳毒性的pks+大腸桿菌注射入人腸道類器官內(nèi)腔，在暴露五個月后對類器官細胞進行全基因組測序，發(fā)現(xiàn)其可誘導獨特的突變特征。通過隊列研究分析不同癌癥類型的突變模式，發(fā)現(xiàn)這一突變特征在結(jié)腸癌中的頻率更高[33]?？梢?，PDO 可為研究病原微生物在腫瘤發(fā)生及演化進程中的作用提供實驗模型。

2.4 腫瘤新抗原的鑒定和發(fā)現(xiàn)

準確和快速鑒定腫瘤新抗原是腫瘤個性化免疫治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)?；谫|(zhì)譜的免疫多肽組學通過免疫親和力純化和質(zhì)譜測定，對人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）呈遞的多肽樣品進行鑒定和定量，可以在蛋白水平鑒定出真實存在的抗原肽，包括經(jīng)翻譯后修飾的肽和蛋白酶體作用產(chǎn)生的剪接肽等這些不能被基因組學和轉(zhuǎn)錄組學檢測發(fā)現(xiàn)的免疫肽。但是免疫多肽組學需要大量的生物樣本（＞1 g），PDO 能夠很好地解決這一問題，有助于腫瘤新抗原的發(fā)現(xiàn)和免疫治療藥物的開發(fā)。2019年，Newey A等[34]利用5 位結(jié)直腸癌患者的活檢組織成功構(gòu)建PDO，然后采用免疫多肽組學技術(shù)鑒定HLA-Ⅰ和HLA-Ⅱ呈遞肽段。結(jié)果顯示，每個PDO 的HLA-Ⅰ呈遞肽段均數(shù)為9936，顯著高于文獻報道的在腫瘤細胞株上鑒定到的肽段數(shù)目，說明PDO 能更好地保持原代腫瘤樣本的免疫源性。另外，這5 個PDO 的HLA-Ⅱ呈遞肽段普遍較低，可能與PDO 中缺乏表達HLA-Ⅱ分子的抗原呈遞細胞（antigen-presenting cell，APC）相關(guān)。2020年，Demmers LC等[35]利用一位結(jié)腸癌病人的腫瘤組織進行單細胞類器官培養(yǎng)，獲得4 個結(jié)腸癌類器官亞克隆。免疫多肽組學分析發(fā)現(xiàn)，每個亞克隆均檢測到大約7000 個HLA-Ⅰ類肽段，其中3%的肽段是結(jié)腸癌特異性的。結(jié)合蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，這些腫瘤特異性肽段大部分來自DNA 損傷感知和修復蛋白。進一步分析發(fā)現(xiàn)，免疫多肽的序列在不同亞克隆中高度重復，但是其中15%～25%的多肽在不同亞克隆之間存在2 倍以上的數(shù)量差異。該研究說明即使在同一個體中，HLA-Ⅰ類肽的呈遞也存在異質(zhì)性，這種現(xiàn)象在腫瘤多肽疫苗研發(fā)過程需要加以重視。除了預測和識別潛在的腫瘤新生抗原，PDO 還可對這些潛在的腫瘤新生抗原進行鑒定，評估藥物對抗原肽呈遞的影響。Wang W等[36]利用多組學分析和預測了肝膽PDO 和匹配腫瘤組織的新抗原多肽庫。將肝細胞癌PDO 與T 細胞進行共培養(yǎng)，通過細胞殺傷實驗來鑒定可以刺激CD8 細胞產(chǎn)生抗腫瘤效應的多肽。Newey A等[34]利用結(jié)直腸癌PDO 分析了IFN-γ 和MEK 抑制劑曲美替尼（trametinib）對抗原肽呈遞的影響。上述這些研究表明，基于PDO 的研究為個體化免疫治療中新抗原多肽的臨床前篩選提供了有效策略。

3 腫瘤類器官存在的問題

3.1 微環(huán)境成分丟失

PDO 的一個重要優(yōu)勢在于能模擬真實腫瘤微環(huán)境，但目前常用的基質(zhì)膠包裹的沉浸培養(yǎng)下，PDO的主要成分是腫瘤上皮細胞，腫瘤微環(huán)境的其他細胞成分較少[37]。盡管Neal JT等[38]開發(fā)的氣液界面培養(yǎng)（air-liquid interface culture，ALI）構(gòu)建的PDO 包括了腫瘤相關(guān)成纖維細胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）和免疫細胞，但是這些成分在傳代過程中會逐漸丟失[39]。為了解決腫瘤微環(huán)境成分缺失問題，將PDO 與腫瘤組織分離得到的CAFs 或者免疫細胞共培養(yǎng)，以期更真實地模擬腫瘤微環(huán)境[40]。另外，器官芯片概念也被引入共培養(yǎng)體系打造類器官芯片，實現(xiàn)PDO 與腫瘤微環(huán)境成分共培養(yǎng)[41]。

3.2 缺乏標準化

PDO 構(gòu)建涉及多個環(huán)節(jié)，包括腫瘤組織樣本取樣、組織處理、三維培養(yǎng)等過程。但是這些環(huán)節(jié)尚無標準、統(tǒng)一的操作流程，不同實驗室根據(jù)自己的實際情況有各自的方法，實驗技術(shù)的多樣性可能導致PDO 不能真實、準確地重現(xiàn)來源腫瘤組織的生物學異質(zhì)性。由于PDO 大多采用手術(shù)切除或者活檢腫瘤組織，而組織處理方法往往又根據(jù)腫瘤組織不同而有差異，因此現(xiàn)階段取樣和組織處理標準的制定存在很大困難。相對來說，培養(yǎng)過程涉及的骨架材料、培養(yǎng)條件可進行一定程度的標準化。培養(yǎng)液中需要添加多種蛋白、生長因子促進PDO 生長，這些商品化的蛋白、因子價格昂貴，于是一些實驗室采用在細胞中過表達的相應蛋白收集培養(yǎng)液進行替代。但這些條件性培養(yǎng)液不僅存在批間差異、實驗室間差異，還有很多未知的成分可能影響PDO 培養(yǎng)，因此降低重組蛋白、因子的生產(chǎn)、使用成本，是實現(xiàn)培養(yǎng)條件標準化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。另外，目前三維培養(yǎng)最常用的骨架材料是從小鼠肉瘤（Engelbreth-Holm-Swarm，EHS）中提取的基底膜基質(zhì)（Matrigel或者BME）或者動物來源的膠原基質(zhì)，存在批次間差異、成分不明確、操控性差等問題。材料科學研究正致力于開發(fā)新型的生物材料，力圖最大程度模擬體內(nèi)腫瘤細胞與胞外基質(zhì)的相互作用，重現(xiàn)腫瘤微環(huán)境[42]。

3.3 臨床個性化應用問題

同種腫瘤不同病人、同一病人不同腫瘤灶構(gòu)建的PDO 可能存在克隆選擇，導致不能真實呈現(xiàn)原發(fā)腫瘤的特性，進而使得藥物敏感性與臨床實際存在偏差。盡管基于PDO 的高通量藥物篩選可以建立基因-藥物敏感性相關(guān)性，但是對于臨床腫瘤患者個體而言，不同腫瘤灶的異質(zhì)性存在藥物響應差異，使得PDO 在臨床治療決策中的應用仍存在較大的挑戰(zhàn)。此外，不同腫瘤類型PDO 構(gòu)建成功率不同，成功率低的腫瘤較難支持藥物敏感性檢測，這些問題都有待進一步研究改進[7]。

3.4 其他問題

PDO 還存在一些其他方面的問題等待解決。肝癌、前列腺癌等腫瘤的PDO 構(gòu)建成功率偏低，需要改進方法提高成功率[11，12]；大部分構(gòu)建成功的PDO主要來源于上皮樣腫瘤，非上皮樣腫瘤的PDO 構(gòu)建有待開展；有些PDO 中混有正常組織來源的類器官，而且有些時候后者生長速度反而更快；目前常用的藥物篩選或者根據(jù)細胞形態(tài)篩選PDO 并不適用于所有腫瘤，因此需要建立合適的PDO 篩選方法；另外，相較于二維細胞，PDO 培養(yǎng)周期較長、成本高昂，需要通過優(yōu)化培養(yǎng)條件縮短培養(yǎng)周期、降低培養(yǎng)成本。

4 結(jié)論和展望

隨著生命科學的迅猛發(fā)展，惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的本質(zhì)和基本過程逐步被闡明，使得抗腫瘤藥物的研究從傳統(tǒng)的細胞毒類藥物轉(zhuǎn)向分子靶向、免疫調(diào)控抗腫瘤藥物等，更注重于精準醫(yī)療、個性化治療。相應地，抗腫瘤新藥研發(fā)對藥效評價模型也提出了更高的要求。貼近臨床的體內(nèi)外模型，被認為是縮短新藥臨床前到臨床的研發(fā)周期、提高藥物研發(fā)成功率的重要工具。作為一種新的腫瘤研究模型，PDO在過去十年間發(fā)展迅速，展現(xiàn)了諸多優(yōu)勢，在抗腫瘤新藥研究領(lǐng)域和腫瘤基礎(chǔ)研究中應用廣泛。盡管仍存在一些問題和局限亟待改善和優(yōu)化，但是目前已顯示出PDO 對腫瘤基礎(chǔ)研究、臨床前和臨床藥物研發(fā)進程的積極推動作用，相信在未來也必將發(fā)揮不可或缺的作用。

致謝

感謝中國科學院上海藥物研究所丁健院士對本綜述選題的指導，感謝中國工程院未來少年科創(chuàng)營項目的支持。