利心水方對(duì)大鼠心肌纖維化的影響*

宋曉龍 宋 峻 潘仁友 王 蕾 孫偉新 袁春玲

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)鹽城附屬醫(yī)院，江蘇省鹽城市中醫(yī)院，江蘇 鹽城 224000；2.徐州醫(yī)科大學(xué)，江蘇 徐州 221000）

心血管疾病最終的病理變化最常見(jiàn)的是心肌纖維化，心臟成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白過(guò)度沉積，心臟間質(zhì)的重塑是其主要特點(diǎn)［1］。在心臟間質(zhì)的重塑過(guò)程中，心血管病變導(dǎo)致心室大小、結(jié)構(gòu)和形態(tài)等發(fā)生較明顯的變化，并伴隨著心肌成纖維細(xì)胞的異常增殖，膠原的形成增多和降解減少，從而引起膠原蛋白的過(guò)度沉積［2］。心肌纖維化的形成導(dǎo)致心肌組織的順應(yīng)性下降，影響心臟的供血等功能。心肌纖維化與心肌梗死、心衰等心血管疾病密切相關(guān)，如不及時(shí)治療，會(huì)導(dǎo)致心功能不全及休克猝死等，所以對(duì)于心肌纖維化的治療是目前的研究重點(diǎn)［3-4］。全國(guó)名老中醫(yī)曾學(xué)文教授在長(zhǎng)期臨床實(shí)踐中提出心血管疾病的證治規(guī)律，即心氣虛-心血瘀-心水腫-心厥脫（簡(jiǎn)稱心臟病氣血水厥說(shuō)）的觀點(diǎn)［5］，臨床經(jīng)驗(yàn)證實(shí)利心水方對(duì)慢性心力衰竭有著顯著的臨床療效。但是利心水方對(duì)于治療心力衰竭的內(nèi)在機(jī)制，尤其是對(duì)心肌纖維的作用尚不明確。因此，本課題組制備大鼠的心肌纖維化模型，運(yùn)用利心水方進(jìn)行體內(nèi)干預(yù)，觀察對(duì)心肌纖維化的作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠，6～7周齡，體質(zhì)量180～220 g，由上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（滬）2018-0004。實(shí)驗(yàn)均按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南進(jìn)行，經(jīng)江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（XMLL-2021-880）。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

利心水方：豬苓30 g，人參10 g，白術(shù)10 g，黃芪40 g，制附子10 g，玉竹12 g，桂枝10 g，當(dāng)歸10 g，川芎10 g，葶藶子30 g，澤瀉30 g。加水煎煮兩次，第1次加10倍量水，浸泡1 h，加熱煎煮60 min，過(guò)濾；第2次繼續(xù)加10倍量水，加熱煎煮40 min，過(guò)濾。合并兩次濾液，最終濃縮為生藥含量2 g/mL的藥液。

1.3 試劑及儀器

Trizol（Invitrogen公司，貨號(hào)：15596018）；Real Time PCR 試劑盒（諾唯贊公司，貨號(hào)：R222-01）；Anti-CollagenⅠ抗體（Abcam公司，貨號(hào)：ab34710）；Anti-α-SMA抗體（Abcam公司，貨號(hào)：ab32575）；Anti-TGF-β抗體（Abcam公司，貨號(hào)：ab92486）；Anti-Fibronectin抗體（Abcam公司，貨號(hào)：ab268021）。顯微鏡（OLYMPUS，型號(hào)：IX51）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化，型號(hào)：SWCJ-1D）；qPCR熒光定量系統(tǒng)（杭州博日，型號(hào)：FQD-96A）；PCR儀（Eppendorf，型號(hào)：6311000070）；紫外分光光度計(jì)（ThermoFish，型號(hào)：SMA2000）；高速冷凍離心機(jī)（DragonLab，型號(hào)：LR5K001727）；恒溫金屬?。ㄉ虾Ｒ缓憧萍?，型號(hào)：TU-100）。

1.4 分組與造模

50只SD健康大鼠分為5組：假手術(shù)組、模型組和利心水方低劑量組、中劑量組、高劑量組。除假手術(shù)組外，剩余4組大鼠均采用縮窄腹主動(dòng)脈的方法構(gòu)建慢性心力衰竭（CHF）模型［6］。腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，沿肋弓處沿前正中線切開(kāi)腹部皮膚，長(zhǎng)約2.5 cm，繼之打開(kāi)腹腔分離腹主動(dòng)脈，平行于腹主動(dòng)脈放置7號(hào)手術(shù)針，后用0號(hào)絲線繞手術(shù)針結(jié)扎，取出手術(shù)針，確定腹主動(dòng)脈暢通，最后關(guān)腹。假手術(shù)組大鼠不結(jié)扎腹主動(dòng)脈只分離。術(shù)后第5周末測(cè)定大鼠心臟左室舒張末壓（LVEDP），以LVEDP≥15 mmHg（1 mmHg≈0.133 kPa）為心肌纖維化模型成功的標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 干預(yù)方法

利心水方的劑量根據(jù)人-鼠劑量的換算公式［大鼠劑量（mg/kg）=W×人劑量（mg/kg），其中W為換算系數(shù)6.25］進(jìn)行選擇［7］。建模成功后，利心水方各劑量組分別以低（5 mL/kg）、中（15 mL/kg）、高劑量（25 mL/kg）的利心水方藥液灌胃，假手術(shù)組和模型組予以相同體積的生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)喂藥5周。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 超聲心動(dòng)圖評(píng)估大鼠的心臟功能 末次給藥24 h后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，對(duì)其進(jìn)行胸前備皮，調(diào)整儀器探頭及調(diào)節(jié)參數(shù)，記錄不同組別大鼠的左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）和左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD），并記錄左室短軸縮短率（FS）和射血分?jǐn)?shù)（EF）值。

1.6.2 HE染色 用4%多聚甲醛固定液灌注大鼠，取出心臟，30%蔗糖脫水24 h，OCT包埋，做冰凍切片，厚度10 μm，隨即進(jìn)行HE染色，鏡下觀察不同組別大鼠的心肌組織變化。

1.6.3 Masson染色 心肌組織按常規(guī)包埋、切片，先用蘇木素染核15 min，接著鹽酸酒精分色1～2 s，自來(lái)水藍(lán)化20 min后麗春紅染色20 min，用雙蒸水快速洗1遍，亮綠染色3～5 s，最后雙蒸水漂洗脫水，脫水后的切片用中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。

1.6.4 RT-qPCR 檢測(cè) CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin mRNA的表達(dá) Trizol法提取總RNA，利用核酸蛋白儀檢測(cè)RNA濃度和純度。每組各取1 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，按試劑盒說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系，42℃ 30 min，95℃ 5 min。以β-actin為內(nèi)參，利用實(shí)時(shí)定量PCR儀，采用SYBR染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，基因引物參照GeneBank基因序列設(shè)計(jì)。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.6.5 Western blotting法檢測(cè) CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin蛋白表達(dá) 提取心肌組織細(xì)胞蛋白質(zhì)，利用二辛可寧酸法測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入稀釋好的一抗，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌液洗滌3次，加入二抗，室溫孵育1 h，TBST洗滌液洗滌3次，化學(xué)發(fā)光后采集圖像，并用軟件對(duì)反應(yīng)條帶進(jìn)行灰度分析，各蛋白相對(duì)表達(dá)量以各蛋白密度單位β-actin密度單位表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示。多組間比較以單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心臟彩超結(jié)果比較

見(jiàn)表2。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠LVEDD和LVESD明顯增加，F(xiàn)S和EF數(shù)值較假手術(shù)組明顯降低（P＜0.01），利用不同劑量的利心水方干預(yù)后，大鼠LVEDD和LVESD較模型組顯著下降，隨著劑量升高，差異越顯著，而利心水方組大鼠FS和EF較模型組顯著升高，同樣，隨著劑量升高，差異越顯著（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 各組大鼠心臟彩超結(jié)果比較（±s）

表2 各組大鼠心臟彩超結(jié)果比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與低劑量組比較，$P＜0.05，$$P＜0.01。下同。

組別假手術(shù)組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n 3 3 3 3 3 EF（%）86.29±2.74 37.92±2.59**45.39±2.95#55.11±2.87##$$68.88±1.59##$$FS（%）57.34±2.04 18.96±2.14**25.43±1.92#35.49±1.72##$$42.52±2.43##$$LVEDD（mm）4.97±0.22 8.87±0.27**7.87±0.26##7.10±0.13##$6.21±0.22##$$LVESD（mm）2.24±0.30 4.51±0.27**4.03±0.15 3.31±0.20##$2.86±0.17##$$

2.2 各組大鼠心肌組織的病理變化

HE染色示：假手術(shù)組大鼠的心肌細(xì)胞排列整齊，生長(zhǎng)均一，細(xì)胞間隙小，而模型組大鼠的心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞變大，間隙也明顯增大，同時(shí)可見(jiàn)比較明顯的心肌纖維化病灶的形成。與模型組相比，利心水方組大鼠的心肌細(xì)胞排列較為整齊，細(xì)胞間隙較小。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織的病理變化（HE染色，200倍）

2.3 各組大鼠心肌膠原表達(dá)比較

Masson染色示：假手術(shù)組中大鼠的心肌細(xì)胞及其周?chē)窗l(fā)現(xiàn)明顯膠原纖維沉積；而模型組大鼠心肌細(xì)胞和血管周?chē)苡^察到大量藍(lán)色的膠原纖維的沉積；與模型組的大鼠心肌組織相比，利心水方各組大鼠的心肌細(xì)胞膠原纖維的沉積顯著減少，高劑量組心肌細(xì)胞只有少量膠原纖維沉積。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠心肌膠原表達(dá)（Masson染色，200倍）

2.4 各組大鼠心肌組織CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin mRNA表達(dá)比較

見(jiàn)表3。與假手術(shù)組的大鼠相比，模型組大鼠心肌組織的Collagen I、α-SMA、TGF-β、FibronectinmRNA的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），利心水方組干預(yù)后，與模型組相比，心肌組織CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin的mRNA水平顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各組大鼠心肌組織CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin mRNA表達(dá)比較（±s）

表3 各組大鼠心肌組織CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin mRNA表達(dá)比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n 3 3 3 3 3 Collagen I 1.00±0.06 2.15±0.06**1.71±0.09##1.38±0.07##$$1.11±0.07##$$α-SMA 1.00±0.07 3.10±0.09**2.43±0.11##2.12±0.09##$1.64±0.08##$$TGF-β 1.00±0.07 2.85±0.13**2.29±0.15##2.09±0.08##1.53±0.06##$$Fibronectin 1.00±0.10 3.22±0.09**2.64±0.08##2.39±0.09##$1.85±0.08##$$

2.5 各組大鼠心肌組織CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin蛋白表達(dá)比較

見(jiàn)表4、圖3。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌組織CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），利心水方組干預(yù)后，心肌組織CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin的蛋白水平表達(dá)顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）。

表4 各組大鼠心肌組織CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin蛋白表達(dá)比較（±s）

表4 各組大鼠心肌組織CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin蛋白表達(dá)比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n 3 3 3 3 3 CollagenⅠ1.00±0.21 4.20±0.33**3.27±0.30##2.47±0.27##$1.55±0.09##$$α-SMA 1.00±0.14 4.58±0.33**3.54±0.21#2.84±0.45##2.03±0.30##$$TGF-β 1.00±0.07 4.18±0.29**3.47±0.25#2.68±0.21##$2.07±0.26##$$Fibronectin 1.00±0.13 4.52±0.40**3.58±0.20##2.79±0.16##$2.15±0.32##$$

圖3 各組大鼠心肌組織CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin蛋白條帶

3 討 論

心肌纖維化是心臟受到多種病理因素影響所致，心肌成纖維化細(xì)胞過(guò)度增殖，細(xì)胞外基質(zhì)膠原蛋白等過(guò)度沉積，進(jìn)一步形成心肌纖維化，影響心臟功能［8］。有文獻(xiàn)研究表明，心肌細(xì)胞受損時(shí)，缺少血氧，血液動(dòng)力超負(fù)荷，促發(fā)心肌及間質(zhì)細(xì)胞的相關(guān)基因表達(dá)，分泌多種活性細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，通過(guò)自分泌、旁分泌、血液循環(huán)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等作用，誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞活化增殖。臨床上關(guān)于心肌纖維化的具體途徑和機(jī)制尚不清楚，但已有研究報(bào)道，TGF-β1、氧化應(yīng)激、炎癥因子等參與了心肌纖維化的發(fā)生［9-10］。目前對(duì)中藥復(fù)方治療心肌纖維化的臨床作用受到重視，本團(tuán)隊(duì)臨床研究表明，利心水方Ⅱ能夠明顯改善慢性心力衰竭患者心功能狀態(tài)，對(duì)改善心室重構(gòu)有重要作用［11］。另外，筆者先前研究發(fā)現(xiàn)利心水方可以改善冠心病心力衰竭患者的臨床癥狀和心功能，并對(duì)心肌纖維化有一定作用，能改善心肌重構(gòu)［12］。利心水方對(duì)于心肌纖維的作用機(jī)制尚不完全明確。因此，本課題組利用大鼠的心肌纖維化模型研究利心水方體內(nèi)干預(yù)下對(duì)心肌纖維化的作用，為臨床用藥提供基礎(chǔ)研究。

與之前研究結(jié)果相似，超聲心動(dòng)圖檢測(cè)發(fā)現(xiàn)利心水方可顯著改善心臟功能。HE染色和Masson染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，利心水方組中大鼠心肌細(xì)胞排列更為整齊，細(xì)胞間隙也較小，心肌細(xì)胞膠原纖維的沉積顯著減少。由此可見(jiàn)，中藥復(fù)方利心水方對(duì)于大鼠的心肌纖維化具有一定的保護(hù)作用，可在一定程度上減少膠原的沉積。與模型組相比，利心水方干預(yù)組心肌組織有一定程度的恢復(fù)。利心水方由人參、黃芪、玉竹、桂枝、制附子、當(dāng)歸、川芎、白術(shù)、葶藶子、豬苓、澤瀉等組成，具有益氣溫陽(yáng)、化瘀行水的功效。有研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)用溫陽(yáng)化飲、益氣活血法干預(yù)急性心肌梗死早期左室重構(gòu)大鼠，其血清腎素、AngⅡ、ALD含量明顯下降，證實(shí)中藥通過(guò)抑制RAAS激活降低心肌纖維化程度［13］，這與筆者的研究結(jié)果相似。

心臟成纖維細(xì)胞不僅可以分泌細(xì)胞外基質(zhì)，也可以發(fā)揮降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用，從而保持正常心臟功能所必需的細(xì)胞外基質(zhì)的平衡［14］。在疾病狀態(tài)下，各種刺激損傷因素（如炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞因子、缺氧及高血糖等）均能誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞活化增殖，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，其高表達(dá)α-SMA。肌成纖維細(xì)胞會(huì)分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)波形蛋白、纖連蛋白和Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型膠原等［15-16］。TGF-β/Smad信號(hào)通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生和心肌組織纖維化的關(guān)鍵信號(hào)通路［17］。在其他臟器的纖維化（肺纖維化和肝纖維化）中，均可見(jiàn)相關(guān)信號(hào)通路的活化，表明TGF-β在組織器官的纖維化中發(fā)揮著重要作用［18-21］。

本研究通過(guò)RT-qPCR和Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了各組CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin的表達(dá)用以研究利心水方對(duì)心肌纖維化的作用。結(jié)果表明,心肌組織中CollagenⅠ、α-SMA、TGF-β、Fibronectin的mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著下降，進(jìn)一步證實(shí)了利心水方對(duì)心肌纖維化具有保護(hù)作用。綜上所述，中藥復(fù)方利心水方對(duì)于大鼠的心肌纖維化有一定的保護(hù)作用。