小承氣湯合黃芪建中湯灌腸對術(shù)后早期炎性腸梗阻大鼠腸黏膜損傷及炎性因子的影響*

孟 瑩 劉寶清 李 喬 楊成城 張 棟△

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078）

術(shù)后早期炎癥性腸梗阻（EPISBO）是腹部外科最常見的術(shù)后并發(fā)癥之一。該病發(fā)生在術(shù)后1～2周內(nèi)，由腹部手術(shù)創(chuàng)傷、腹腔內(nèi)炎癥等原因?qū)е履c壁水腫滲出粘連，以機(jī)械性、動(dòng)力性失常共存為特征的腸梗阻［1］。其發(fā)病機(jī)制與手術(shù)操作創(chuàng)傷及術(shù)后炎癥反應(yīng)相關(guān)。由于患者存在嚴(yán)重的腸道粘連和炎癥，手術(shù)分離粘連反而造成腸管損傷、出血加重梗阻，延長腸道功能恢復(fù)時(shí)間，甚至造成腸瘺、短腸綜合征、重癥感染等嚴(yán)重并發(fā)癥［2］，因此，本病主要以非手術(shù)治療為主。但胃腸減壓、營養(yǎng)支持治療的康復(fù)周期長，并且增加患者經(jīng)濟(jì)及心理負(fù)擔(dān)。近年來中藥灌腸療法在EPISBO的非手術(shù)治療上發(fā)揮了極大的優(yōu)勢，且療效滿意［3］。小承氣湯為通腑瀉下的代表方，能輕下熱結(jié)；黃芪建中湯為建中補(bǔ)虛之代表方。既往研究表明小承氣湯、黃芪建中湯均能降低炎性因子水平，改善腸屏障功能［4-5］?；诖?，本研究通過建立EPISBO大鼠模型，觀察小承氣湯合黃芪建中湯灌腸對模型大鼠腸黏膜損傷及炎癥因子的影響，探討其發(fā)病及治療機(jī)制，以期為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級Wistar雄性大鼠45只，6周齡，體質(zhì)量（200±20）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2016-0011。動(dòng)物合格證號：110011211110710424。實(shí)驗(yàn)室溫度（22±2）℃，濕度50%～60%，通風(fēng)、光照良好，正常飲食、水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。動(dòng)物倫理批準(zhǔn)號：S20210224-064。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 小承氣合黃芪建中湯：厚樸6 g，枳殼9 g，大黃12 g，桂枝9 g，白芍18 g，生姜6 g，大棗10 g，炙甘草6 g，黃芪18 g（北京康仁堂藥業(yè)有限公司，批號：2109280018）。將中藥每100 g濃煎至100 mL，4 ℃冰箱保存待用。

1.3 儀器與試劑 大鼠二氧化胺酶（DAO）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（Elabscience公司，批號：E-EL-R3013），大鼠D-乳酸（D-LA）ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)公司，批號：ml545840V），大鼠白細(xì)胞介素-6（IL-6）ELISA 試劑盒（Elabscience公司，批號：E-ELR0015c），大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（Elabscience公司，批號：E-EL-R2856c），大鼠白細(xì)胞介素-10（IL-10）ELISA試劑盒（江蘇晶美公司，批號：202205）。電子天平（德國賽多利斯公司，型號：MSA224S-000-DA）、超低溫冰箱（賽默飛公司，型號：902-ULTS）、低溫離心機(jī)（美國Sigma公司，型號：3-30）。

1.4 分組與造模 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為：正常組、假手術(shù)組、模型組、中藥組和肥皂水組，每組9只。參照文獻(xiàn)［6］方法，大鼠術(shù)前禁食12 h、禁水6 h后，腹腔注射方式麻醉，無菌條件下取下腹正中切口約2 cm，將盲腸及距盲腸約15 cm的小腸段取出，用生理鹽水棉簽由小腸向盲腸反復(fù)擦拭5次，并暴露體外30 min后將小腸理順還納腹腔，逐層縫合關(guān)腹。模型組、中藥組及肥皂水組按照上述方法造模，假手術(shù)組除開腹后不擦拭腸管外，其他操作都相同。正常組無須操作。如大鼠出現(xiàn)懶動(dòng)、萎靡，且進(jìn)食量、大便量明顯減少，甚至基本無大便，認(rèn)為造模成功。

1.5 干預(yù)方法 造模術(shù)后第1天開始保留灌腸，每日1次，連續(xù)灌腸1周，灌腸液溫度為38℃，灌腸前盡量排空大鼠肛門直腸內(nèi)成形的糞便，灌腸管采用直徑2 mm、長12 cm的兒童直腸給藥管，插入深度約為3～5 cm，緩慢注入灌腸液，完畢后立即捏緊肛門，提起鼠尾將大鼠倒置約5 min后拔出灌腸管，使灌腸液充分留置。中藥組大鼠灌腸用藥劑量參照體表面積折算表換算［7］，灌腸給藥量為8.45 g（/kg·d），則200 g大鼠用藥劑量為1.69 g/d。肥皂水組給予等量0.2%肥皂水灌腸。

1.6 標(biāo)本采集與檢測 1）血清DAO、D-LA、TNF-α、IL-6、IL-10檢測。治療結(jié)束后，腹主動(dòng)脈取血3 mL，3 000 r/min離心10min，保存上層血清，采用ELISA法檢測指標(biāo)。2）腸黏膜病變及小腸粘連分級。肉眼觀察腸道組織形態(tài)、與周圍組織或臟器粘連的程度，記錄并拍照。粘連級別參考Nair等［8］制定的5級分類法。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，計(jì)數(shù)資料以［n（%）］記錄。等級資料采用χ2檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，方差齊者用LSD法，方差不齊者用Tamhane's T2法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況觀察 各組造模后大鼠出現(xiàn)活動(dòng)減少、攝食量減少、腹圍明顯增大等情況，且大便量明顯減少，甚至基本無大便，體質(zhì)量增長緩慢，提示造模成功。中藥組予灌腸干預(yù)后大鼠體質(zhì)量增長、活動(dòng)、攝食量、排便量等方面均有好轉(zhuǎn)。

2.2 各組大鼠腸組織情況及腸粘連分級比較 見表1、圖1。正常組、假手術(shù)組大鼠腸管形態(tài)正常，未發(fā)現(xiàn)粘連，均評為0級。與正常組比較，模型組分級集中在Ⅳ級（5例，55.56%），出現(xiàn)腸道粘連梗阻，梗阻部位以上可見腸管粘連、擴(kuò)張、膨脹，腸壁變薄，腸壁充血水腫，內(nèi)含渾濁液體，梗阻以下的腸管癟陷萎縮，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，肥皂水組大鼠分級集中在Ⅲ級（4例，44.44%）及Ⅳ級（4例，44.44%），梗阻部位以上腸管也出現(xiàn)擴(kuò)張、膨脹，腸壁充血水腫等現(xiàn)象，但其粘連分級較模型組輕，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，中藥組大鼠分級集中在Ⅰ級（4例，44.44%）及Ⅱ級（3例，33.33%），其腸道外觀改變明顯較模型組輕，小腸粘連嚴(yán)重級別顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠小腸腸管形態(tài)及粘連表現(xiàn)

表1 各組大鼠術(shù)后小腸粘連分級（n）

2.3 各組大鼠血清DAO、D-LA表達(dá)水平比較 見表2。正常組與假手術(shù)組較無明顯差異（P＞0.05）；與正常組相比，模型組血清中DAO、D-LA含量明顯升高（P＜0.05），提示造模成功；與模型組比較，肥皂水組血清DAO、D-LA含量無明顯差異（P＞0.05），而中藥組血清中DAO、D-LA含量明顯降低（P＜0.05），提示中藥干預(yù)后對DAO、D-LA水平有降低作用。

表2 兩組大鼠血清DAO、D-LA表達(dá)水平比較（±s）

表2 兩組大鼠血清DAO、D-LA表達(dá)水平比較（±s）

組別正常組假手術(shù)組模型組中藥組肥皂水組n 9 9 9 9 9 DAO（ng/mL）24.41±2.46△#24.22±1.35△#38.33±1.00*36.44±0.91*△#38.01±1.05*D-LA（μg/mL）82.39±7.84△#84.69±8.11△#256.85±18.28*238.00±9.71*△#264.47±16.43*

2.4 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10表達(dá)水平比較 見表3。正常組與假手術(shù)組較無明顯差異（P＞0.05）；與正常組比較，模型組血清中TNF-α、IL-6、IL-10含量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，肥皂水組血清中 TNF-α、IL-6、IL-10含量無顯著差異（P＞0.05），而中藥組TNF-α、IL-6含量明顯降低，IL-10含量明顯升高（P＜0.05）。

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10表達(dá)水平比較（±s）

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10表達(dá)水平比較（±s）

組別正常組假手術(shù)組模型組中藥組肥皂水組n 9 9 9 9 9 TNF-α（pg/mL）24.22±2.98△#27.38±1.76△#57.91±9.84*39.42±6.39*△#52.98±5.93*IL-6（pg/mL）22.07±3.56△#24.72±3.51△#66.83±5.81*56.96±6.73*△#63.59±7.94*IL-10（ng/L）74.58±6.53△#75.45±5.18△#82.78±5.32*93.89±5.19*△#86.67±5.62*

3 討 論

EPISBO歸屬于中醫(yī)學(xué)“腸結(jié)”“腹痛”范疇，多為本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜之證，病初為氣滯血瘀、腑實(shí)腸結(jié)、胃氣上逆的“標(biāo)實(shí)”，但手術(shù)金刃損傷臟腑、筋脈，耗傷氣血，損傷脾胃，故存在“本虛”，不應(yīng)是純實(shí)證。而近年來中醫(yī)藥治療腸梗阻多以承氣湯加減等單純攻下為主，雖說“通法”是本病治療的基本原則，但“通”并非單純攻下而言，正如《醫(yī)學(xué)真?zhèn)鳌ば母雇础匪浴巴ㄖǜ饔胁煌?，調(diào)氣以和血，調(diào)血以和氣，通也；上者使之下行，中結(jié)者使之旁達(dá)亦通也；虛者助之使通，寒者溫之使通，無非通之之法也，若必以下泄為通則妄矣”。因此若單純采用攻下通里之法，則氣血損益太過，中焦陽虛陰弱更為明顯?；诖?，本病當(dāng)標(biāo)本兼治，溫中補(bǔ)虛健脾以治其本，使脾胃樞機(jī)恢復(fù)正常升降，通腑瀉實(shí)以治其標(biāo)，使燥屎去、地道通，本病得愈。本實(shí)驗(yàn)使用小承氣湯合黃芪建中湯，與大承氣湯相比，小承氣湯無大承氣湯破氣攻下的峻烈之性，可“微和胃氣”，輕下熱結(jié)。黃芪建中湯為建中補(bǔ)虛之代表方劑，兩方相合，既能通腑瀉下排出邪氣，又能補(bǔ)氣健脾扶助正氣，達(dá)到標(biāo)本虛實(shí)兼顧之效，充分體現(xiàn)了仲景“扶陽氣、存津液、保胃氣”的核心思想。又因腸梗阻患者可存在嘔吐、無法口服中藥的表現(xiàn)，中藥灌腸療法不會(huì)對上消化道產(chǎn)生負(fù)擔(dān)，更適合術(shù)后行胃腸減壓的患者，藥液經(jīng)直腸吸收還能減少肝臟首過效應(yīng)及消化酶分解破壞的影響，提高血藥濃度，同時(shí)減少對肝臟的毒副作用［9］。中藥液使腸腔容積擴(kuò)大，通過神經(jīng)反射調(diào)節(jié)促使腸蠕動(dòng)增強(qiáng)；中藥成分含有的電解質(zhì)及多糖化合物可營養(yǎng)腸黏膜。與肥皂水灌腸劑通過高滲作用使水分進(jìn)入腸道相比具有顯著優(yōu)勢。且肥皂水容易使大量的氨進(jìn)入體內(nèi)，可加重肝功能異?；颊叩母闻K損害。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，大黃素可抑制TNF-α誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)從而減輕腸黏膜損傷［10］，大黃還對多種細(xì)菌有不同程度的抑制作用［11］。厚樸可雙向調(diào)節(jié)胃腸道收縮，抑制多種炎癥因子的釋放，減輕其對局部組織的浸潤作用，改善微循環(huán)［12］。枳殼提取物可下調(diào)大鼠IL-6、IL-1、TNF-α的表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用［13］。黃芪多糖可顯著抑制巨噬細(xì)胞TNF-α表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)抑炎因子IL-10表達(dá)上調(diào)［14］。桂枝與白芍配伍可協(xié)同增強(qiáng)抗炎作用［15］?？梢?，本方中大部分單味藥具有降低炎癥因子水平、抗菌消炎、保護(hù)腸道的作用。

EPISBO的發(fā)病是多因素的，已證實(shí)與手術(shù)創(chuàng)傷、炎癥反應(yīng)、麻醉藥物等相關(guān)，而炎癥反應(yīng)是其發(fā)生的關(guān)鍵因素［16］。首先手術(shù)中對腸管的操作能激活肥大細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，引起肌層白細(xì)胞募集、促炎細(xì)胞因子和趨化因子的釋放，使腸黏膜通透性增加及細(xì)菌移位，導(dǎo)致腸道平滑肌細(xì)胞收縮力受損；白細(xì)胞浸潤小腸平滑肌后引起腸管炎癥水腫，損害腸道運(yùn)動(dòng)，最終引發(fā)腸梗阻。腸道屏障被破壞后，各種標(biāo)志物可通過受損黏膜大量釋放入血。DAO是人和哺乳動(dòng)物腸黏膜上皮絨毛中的細(xì)胞內(nèi)酶，且生理狀態(tài)下外周血中活性很低，因此DAO是反映腸上皮細(xì)胞完整性的敏感性指標(biāo)。D-LA是大腸桿菌、乳酸菌等細(xì)菌在腸道組織缺血、缺氧條件下的代謝產(chǎn)物，且哺乳動(dòng)物無法生成及代謝分解D-LA，D-LA可通過受損黏膜入血，故可作為臨床反映腸黏膜受損程度和通透性變化、判斷術(shù)后腸道內(nèi)毒素和細(xì)菌移位的指標(biāo)［17］。TNF-α、IL-6、IL-10是參與炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞因子［18］。TNF-α是巨噬細(xì)胞被激活后分泌的炎性細(xì)胞因子，對于各項(xiàng)炎性因子均有促進(jìn)功能。IL-6主要來源于單核/巨噬細(xì)胞，具有促進(jìn)B細(xì)胞增生分化和分泌抗體的作用。IL-10是雙向免疫調(diào)節(jié)因子，具有強(qiáng)大的抗炎活性，能夠抑制多種炎性因子的合成和釋放。一項(xiàng)術(shù)后腸梗阻的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，被敲除IL-10基因的術(shù)后腸梗阻小鼠其胃腸動(dòng)力恢復(fù)時(shí)間明顯長于對照組［19］。

通過一般狀態(tài)觀察，大鼠造模后出現(xiàn)少動(dòng)、攝食量減少、腹圍增大、大便量減少，甚至基本無大便等情況，提示造模成功。與正常組比較，模型組腸粘連級別、DAO、D-LA、TNF-α、IL-6、IL-10上升，說明造模后大鼠出現(xiàn)炎癥反應(yīng)、腸黏膜損傷及腸粘連。與模型組比較，中藥組腸粘連級別、DAO、D-LA、TNF-α、IL-6均下降，IL-10上升，說明經(jīng)小承氣合黃芪建中湯治療后大鼠炎癥程度減輕、腸黏膜損傷及腸粘連程度減輕。由此可見，小承氣合黃芪建中湯可能是通過降低炎性介質(zhì)釋放從而減輕腸損傷。但是具體通過何種通路、是否與中藥劑量相關(guān)尚未清楚，因此仍需進(jìn)一步研究，為其保護(hù)腸道黏膜的分子途徑提供證據(jù)。

綜上所述，小承氣合黃芪建中湯方灌腸可以減輕EPISBO大鼠模型炎癥反應(yīng)程度，并且緩解腸粘連程度，其機(jī)制可能與抑制促炎因子釋放、提高抗炎因子表達(dá)相關(guān)。