針刀干預(yù)對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎兔軟骨血管分布及CD34、CD105、VEGF表達(dá)的影響*

張 典 張 茜 許 悅 陳烯琳 秦露雪 郭長(zhǎng)青

（北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029）

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（KOA）是在生物力學(xué)和生物學(xué)兩者的共同因素相互影響狀態(tài)下，引起膝關(guān)節(jié)周圍結(jié)構(gòu)異常變化和功能慢性退行性改變的骨關(guān)節(jié)疾?。?］，以疼痛、活動(dòng)受限為主要臨床表現(xiàn)，以關(guān)節(jié)軟骨退變?yōu)樽罹邩?biāo)志性病變。正常的關(guān)節(jié)軟骨不僅無(wú)血供來(lái)源，且長(zhǎng)期處于生理性低氧環(huán)境中，KOA發(fā)病過(guò)程中的軟骨細(xì)胞表現(xiàn)為病理性缺氧，且隨著KOA病程進(jìn)展，軟骨細(xì)胞代償性啟動(dòng)血管生成反而加速軟骨退變。最新研究［2］表明，關(guān)節(jié)軟骨退變及骨關(guān)節(jié)炎臨床癥狀的嚴(yán)重程度可由軟骨血管化程度反映出來(lái)。OA病程早期可見源于軟骨下骨的微血管異常生成，侵入鈣化層軟骨，并可能隨著OA病程繼續(xù)發(fā)展，骨與軟骨交界處新生血管密度進(jìn)一步增加［3］，逐步突破潮線侵入非鈣化軟骨層，最終可蔓延至表層軟骨，且骨軟骨交界處血管密度與軟骨退變嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)［4］抑制血管異常生成可有效緩解KOA關(guān)節(jié)軟骨退變，因此，抑制軟骨新生血管形成可能是治療KOA的新思路［5］。針刀治療KOA療效確切，本項(xiàng)目組前期［6］已經(jīng)證實(shí)針刀通過(guò)其力學(xué)效應(yīng)可以發(fā)揮對(duì)KOA軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用，并在一定程度上可以延緩KOA病理進(jìn)程。本研究擬立足于觀察針刀干預(yù)對(duì)KOA兔軟骨血管分布及CD34、CD105、VEGF表達(dá)的影響，以進(jìn)一步探討針刀治療KOA的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

28只健康清潔級(jí)，6月齡，雄性，新西蘭兔（倫理編號(hào)：BUCM-4-2022010101-1097，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK京2018-0041，北京富龍騰飛實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究院有限公司），體質(zhì)量2.0～2.5kg。標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼養(yǎng)籠單籠飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲食。保持室溫恒定于（20±2）℃，濕度維持在40%～60%。

1.2 試劑與儀器

EDTA脫鈣液（G1105，Servicebio）；HE染液套裝（G1003，Servicebio）；胃蛋白酶消化液（Servicebio）；PBS緩沖液（G0002，Servicebio）；BSA（G5001，Servicebio）；蘇木素染液（G1004，Servicebio）；一抗CD34（GENETEX-GTX28158-1∶100）；HR-山羊抗大鼠二抗（GB23302-1∶200，Servicebio）；一抗CD105（MA5-17041-1∶500，invitrogen）；一抗 p-h2ax（05-636-I-1∶50，millipore）；HRP山羊抗小鼠二抗（GB23301-1∶200，Servicebio）；ELISA試劑盒（CSB-E08524Rb）；組化試劑盒DAB顯色劑（G1211，Servicebio）。組織攤片機(jī)（KDP，浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）；染色機(jī)（Giotto，DIAPATH）；脫水機(jī)（JJ-12J，武漢俊杰電子有限公司），包埋機(jī)（JB-P5，武漢俊杰電子有限公司）；脫色搖床（TSY-B，Servicebio）；病理切片機(jī)（RM2016，上海徠卡儀器有限公司）；渦旋混合器（MX-F，Servicebio）；掌上離心機(jī)（D1008E，Servicebio）；顯微鏡（XSPC204，CIC）；立式冷藏陳列柜（LSC-316C，星星）；高速組織研磨儀（KZ-II，Servicebio）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（D3024R，大龍）；酶標(biāo)檢測(cè)儀（Epoch，BioTeK）。

1.3 分組方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，按照隨機(jī)分配的基本原則分為空白組、模型組、電針組、針刀組，每組7只。針刀與電針均可通過(guò)刺激穴位達(dá)到治療效果，但針刀較電針刺激強(qiáng)度更大，在發(fā)揮針刺作用基礎(chǔ)上又可通過(guò)分解粘連、延長(zhǎng)攣縮、減張減壓直接作用于膝周“經(jīng)筋”，故選取電針組作為陽(yáng)性對(duì)照組，試圖通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比電針與針刀在治療兔KOA的療效差異。

1.4 造模方法

采用改良后Videman［7］左后肢伸直位固定制動(dòng)法制備KOA模型兔，造模前所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均需經(jīng)嚴(yán)格禁食約10～16 h。兔前后肢固定于操作臺(tái)，以3%戊巴比妥溶液30 mg/kg耳緣靜脈注射麻醉，左后肢腹股溝至足踝關(guān)節(jié)區(qū)域備皮，牽拉左下肢至膝關(guān)節(jié)完全伸直，以65～85℃熱水充分浸泡樹脂繃帶至軟化后，自腹股溝至足踝固定（保持膝關(guān)節(jié)完全伸直位180°，踝關(guān)節(jié)背屈約60°），留出足趾觀察血供，以無(wú)色透明膠紙于樹脂外包嚴(yán)扎以防兔撕咬。定時(shí)觀察兔足趾血供情況及模型脫落情況，及時(shí)拆除模具，待恢復(fù)正常血運(yùn)后再次制動(dòng)。有效制動(dòng)6周后，確認(rèn)模型制備成功拆除樹脂固定模具。

1.5 干預(yù)方法

各組動(dòng)物均在拆除樹脂固定后開始進(jìn)行干預(yù)。電針組：固定并選取KOA兔患側(cè)梁丘、血海、內(nèi)膝眼和外膝眼穴進(jìn)行電針干預(yù)治療。取穴參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［8］，并結(jié)合動(dòng)物比較學(xué)方法，根據(jù)比較解剖取穴法結(jié)合模擬骨度取穴法，選取上述腧穴進(jìn)行治療。采用一次性無(wú)菌針灸針，規(guī)格0.2 mm×13 mm（環(huán)球牌，蘇州針灸用品有限公司）。以韓氏電針儀分別連接“梁丘-血海”“內(nèi)膝眼-外膝眼”，選用疏密波，刺激頻率2/100 Hz，強(qiáng)度3 mA，每次干預(yù)20 min，隔天1次，共3周。針刀組：固定并以龍膽紫在KOA兔膝關(guān)節(jié)股內(nèi)、外側(cè)肌腱止點(diǎn)；股直肌肌腱止點(diǎn)；股二頭肌肌腱止點(diǎn)及縫匠肌、股薄肌和半腱肌的聯(lián)合腱即鵝足腱；膝關(guān)節(jié)周圍結(jié)節(jié)條索狀物進(jìn)行標(biāo)記定位。選用漢章系列一次性針刀，規(guī)格0.3 mm×30 mm（北京卓越華友醫(yī)療器械有限公司）。常規(guī)步驟備皮、消毒，隨后刺入針刀，刀刃與肌腱走向平行，刀體垂直于皮膚切面，按照“四步規(guī)程”進(jìn)針刀，每處松解2～3下后出針刀并按壓片刻止血。每周治療1次，共3周。模型組：造模完成后每天1次正常抓取、捆綁固定（方法同干預(yù)組）?？瞻捉M：不作任何處理，每天正常抓取、捆綁固定（方法同干預(yù)組）。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè)

1.6.1 HE染色 治療結(jié)束后，各組動(dòng)物以3%戊巴比妥溶液麻醉過(guò)量致死后立即打開關(guān)節(jié)腔，在無(wú)菌條件下，將直徑為8 mm的環(huán)鉆垂直放置于關(guān)節(jié)軟骨面，在患側(cè)膝關(guān)節(jié)脛骨、股骨軟骨面中央負(fù)重區(qū)各截取深度為10 mm的軟骨-軟骨下骨復(fù)合體圓柱形組織塊。將組織塊放置于4%多聚甲醛充分固定后脫鈣，常規(guī)制備石蠟切片、脫蠟、核染色、脫水封片處理。在光鏡下觀察軟骨-軟骨下骨復(fù)合體中鈣化軟骨層、非鈣化軟骨層血管分布情況。

1.6.2 免疫組織化學(xué) 將軟骨-軟骨下骨復(fù)合體組織塊放置于4%多聚甲醛充分固定后脫鈣，常規(guī)制備石蠟切片。在完成烤片、修復(fù)抗原、DAB顯色、復(fù)染細(xì)胞核、脫水封片處理等一系列常規(guī)操作后，通過(guò)免疫組化染色在光鏡下觀察鈣化軟骨層、非鈣化軟骨層CD34、CD105的表達(dá)，其中DAB顯出的蛋白陽(yáng)性表達(dá)呈淺黃色或棕黃色。隨后以Weidner計(jì)數(shù)法［9］計(jì)算微血管密度，先以低倍率（100倍）掃描切片，選擇3個(gè)最高血管密度（“熱點(diǎn)”）區(qū)域，再以高倍率（200倍）定向掃描3個(gè)熱點(diǎn)區(qū)域，視野內(nèi)允許最大數(shù)量微血管。由至少2名相對(duì)獨(dú)立研究者分別對(duì)同一切片微血管的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，取其平均值作為該切片的微血管密度（MVD），若計(jì)數(shù)差異超過(guò)10%，則需重新計(jì)數(shù)。

1.6.3 酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè) 獲得關(guān)節(jié)滑液及血清并置于-80℃冰箱保存，以ELISA試劑盒通過(guò)加樣、加檢測(cè)抗體、洗板，加酶、顯色和終止反應(yīng)等一系列常規(guī)操作后，檢測(cè)滑液及血清中VEGF蛋白表達(dá)水平，其濃度由計(jì)算出的標(biāo)準(zhǔn)曲線查得。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示。符合正態(tài)分布及方差齊的數(shù)據(jù)資料采用單因素方差分析；不符合正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異極具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組HE染色結(jié)果

在光學(xué)顯微鏡下可以觀察到HE染色中：空白組織胞核呈紫藍(lán)色，胞質(zhì)呈粉紅色?？瞻捉M關(guān)節(jié)軟骨表面光滑平整，細(xì)胞層次排列有序，分布及染色均勻，潮線完整，無(wú)血管通過(guò)，鈣化層軟骨或可見少量血管。模型組關(guān)節(jié)軟骨表面可見部分剝脫、缺損，細(xì)胞分布不均勻，潮線上移且扭曲不規(guī)則，有血管通過(guò)，并到達(dá)非鈣化層軟骨。電針組關(guān)節(jié)軟骨表層或可見剝脫，細(xì)胞分布較均勻，部分出現(xiàn)凋亡，潮線略扭曲、較規(guī)則，可見少量血管通過(guò)到達(dá)非鈣化層軟骨。針刀組軟骨表層較光滑，細(xì)胞層次排列均勻，潮線較規(guī)則且清晰，偶見重復(fù)潮線，偶見少量或無(wú)血管穿過(guò)到達(dá)非鈣化層軟骨。如圖1所示。

圖1 各組軟骨-軟骨下骨復(fù)合體組織病理觀察（HE染色，200倍）

2.2 各組免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果

見表1。免疫組化檢驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組MVD值均顯著增加（P＜0.01）；干預(yù)后，相比模型組，電針組和針刀組MVD值均明顯降低（P＜0.01），且針刀組顯著低于電針組（P＜0.05）。

表1 各組MVD表達(dá)水平比較（±s）

表1 各組MVD表達(dá)水平比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01；與電針組比較，△P＜0.05。下同。

組別n CD34CD105空白組模型組電針組針刀組7 7 7 7 0.77±0.34 23.02±2.27*12.19±0.90#8.51±0.61#△0.97±0.48 25.34±2.38*12.31±1.43#7.61±0.75#△

2.3 各組血清及滑液中VEGF表達(dá)比較

見表2。與空白組相比，模型組血清及滑液中VEGF表達(dá)均明顯升高（P＜0.01）；干預(yù)3周后，與模型組相比，電針組與針刀組血清及滑液中VEGF表達(dá)水平均有所降低（P＜0.01），且針刀組顯著低于電針組（P＜0.05）。

表2 各組血清、滑液中VEGF表達(dá)水平比較（pg/mL，±s）

表2 各組血清、滑液中VEGF表達(dá)水平比較（pg/mL，±s）

組別空白組模型組電針組針刀組n 7 7 7 7血清VEGF 6.50±1.22 14.15±1.11*10.61±0.65#7.61±0.90#△滑液VEGF 6.69±0.85 12.99±1.35*10.27±0.37#8.14±0.47#△

3 討 論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，KOA屬于“骨痹”范疇，“膝者，筋之府也”“筋者，肉之力也”“宗筋主束骨而利機(jī)關(guān)”，膝關(guān)節(jié)處筋為全身之最，發(fā)揮著包繞、約束骨骼和關(guān)節(jié)，絡(luò)系肌肉皮膚以及維持動(dòng)態(tài)及靜態(tài)穩(wěn)定的功能?，F(xiàn)代解剖學(xué)認(rèn)為，KOA的病理表現(xiàn)“筋傷”是由于膝關(guān)節(jié)周圍生物力學(xué)失衡所導(dǎo)致的一系列病變，針刀松解法是在傳統(tǒng)中醫(yī)“經(jīng)筋”理論指導(dǎo)下，結(jié)合現(xiàn)代解剖學(xué)理念，通過(guò)改善膝關(guān)節(jié)周圍生物力學(xué)環(huán)境，恢復(fù)膝關(guān)節(jié)周圍的正常力學(xué)平衡，發(fā)揮對(duì)軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用、延緩關(guān)節(jié)軟骨退變［10］，以獲得更加持續(xù)的治療作用，從而豐富針刀“調(diào)筋治骨”內(nèi)涵。生理?xiàng)l件下，軟骨及軟骨下骨是一個(gè)整體的功能單元，軟骨下骨為其分散過(guò)度集中的應(yīng)力。近年多項(xiàng)研究證實(shí)，膝關(guān)節(jié)周圍異常的生物力學(xué)環(huán)境會(huì)直接影響到軟骨下骨病變［11］，使關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨過(guò)早變性，啟動(dòng)了骨重塑。Suri等［12］認(rèn)為，在軟骨下骨重塑過(guò)程中，軟骨下骨異常增加的破骨細(xì)胞活動(dòng)使得軟骨下骨板與非鈣化軟骨層之間形成通道，同時(shí)裂隙自軟骨表面向下延伸至軟骨下板，被異常的新生血管占據(jù)同時(shí)深入至軟骨鈣化層。研究表明，軟骨-軟骨下骨復(fù)合體組織中的異常血管生成可能激發(fā)軟骨內(nèi)骨化，出現(xiàn)軟骨細(xì)胞肥大、X型膠原表達(dá)升高［13］等表現(xiàn)，進(jìn)而加速關(guān)節(jié)軟骨鈣化及退變。因此可以明確，膝關(guān)節(jié)周圍異常生物力學(xué)環(huán)境會(huì)啟動(dòng)骨重塑，骨重塑過(guò)程中異常的血管生成又會(huì)加速軟骨退變，針刀干預(yù)可以通過(guò)糾正膝關(guān)節(jié)周圍力學(xué)失衡，減緩骨重塑，緩解異常血管生成，從而發(fā)揮軟骨保護(hù)作用。

軟骨退變作為KOA的根本病理表現(xiàn)，新生血管異常增生是軟骨破壞的始動(dòng)環(huán)節(jié)，缺氧誘導(dǎo)的軟骨血管異常生成是KOA最早出現(xiàn)的病理特征之一，與KOA病程發(fā)展密切相關(guān)。最新研究［2］支持關(guān)節(jié)軟骨異常血管生成水平可反映關(guān)節(jié)軟骨退變及關(guān)節(jié)炎臨床癥狀的嚴(yán)重程度。前期研究已經(jīng)證實(shí)［14］KOA模型兔異常的關(guān)節(jié)應(yīng)力環(huán)境改變會(huì)加速軟骨退變。本課題組已從KOA軟骨細(xì)胞凋亡、軟骨細(xì)胞增殖、軟骨細(xì)胞合成及分解代謝等幾個(gè)方面證實(shí)了，針刀可以通過(guò)其力學(xué)效應(yīng)發(fā)揮對(duì)KOA軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，KOA患者關(guān)節(jié)軟骨間隙可見骨軟骨連接處存在異常血管生成并延伸至關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)，同時(shí)伴有軟骨細(xì)胞退變、軟骨基質(zhì)鈣化，由此可以明確抑制軟骨中血管生成可以成為治療KOA的新靶點(diǎn)［12，15］。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)HE染色觀察到KOA發(fā)生時(shí)，軟骨細(xì)胞代償性啟動(dòng)血管生成，軟骨下骨微血管侵入鈣化軟骨層，并隨著KOA病程發(fā)展，骨與軟骨交界處新生血管密度增加，同時(shí)潮線出現(xiàn)重復(fù)、結(jié)構(gòu)趨于紊亂甚至消失，部分新生血管逐漸突破潮線，侵入非鈣化軟骨層，最終蔓延至表層軟骨，這與Pesesse等［16］的發(fā)現(xiàn)相一致。與此同時(shí)，骨軟骨交界處血管密度與軟骨退變嚴(yán)重程度直接相關(guān)。CD34作為最敏感的血管內(nèi)皮標(biāo)志物［16］，其含量變化直接反映了骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織血管的多少；CD105直接參與血管生成，其特異性極好［17］。MVD計(jì)數(shù)作為標(biāo)記血管生成的基本方法，MVD標(biāo)志著血管形成活動(dòng)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化染色觀察鈣化軟骨層和非鈣化軟骨層CD34、CD105表達(dá)，分別計(jì)算MVD值發(fā)現(xiàn)，模型組、電針組和針刀組MVD值均依次遞減，且針刀干預(yù)療效顯著優(yōu)于電針，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此可以認(rèn)為針刀干預(yù)通過(guò)抑制CD34、CD105的表達(dá)以達(dá)到減少血管重建的效果。

VEGF作為與血管生成關(guān)系最密切的細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)新血管形成［18］，直接參與KOA軟骨血管化，在關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制研究中最為廣泛且最具靶向性。除了促進(jìn)KOA軟骨新血管形成外，VEGF還抑制軟骨中聚蛋白多糖和Ⅱ型膠原表達(dá)加速軟骨基質(zhì)降解［19］，而軟骨基質(zhì)最主要的組成成分——聚蛋白多糖和Ⅱ型膠原的表達(dá)減少將導(dǎo)致軟骨退變。Saetan等［20］通過(guò)采集并檢測(cè)KOA患者的組織液證實(shí)，其軟骨中VEGF表達(dá)水平顯著升高。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)觀察血清及滑液中VEGF的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)KOA兔模型中血清及滑液VEGF表達(dá)量均顯著上調(diào)，與模型組相比，針刀和電針干預(yù)可以顯著減少血清、滑液中VEGF含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且針刀組VEGF表達(dá)水平顯著低于電針組。故可以認(rèn)為針刀干預(yù)是通過(guò)抑制血清及滑液中VEGF的表達(dá)，從而達(dá)到減緩新血管生成的目的。

因此，通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以認(rèn)為針刀干預(yù)可以通過(guò)“調(diào)筋”恢復(fù)關(guān)節(jié)良性應(yīng)力環(huán)境，有效抑制KOA軟骨血管異常生成，發(fā)揮軟骨保護(hù)作用從而“治骨”。