一種小麥新興功能活性成分
——苯并惡唑啉酮的含量解析與降血糖評價

龔凌霄，楊若言，王 靜?

（北京工商大學 食品與健康學院，中加食品營養(yǎng)與健康聯(lián)合實驗室（北京），食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京100048）

苯并噁嗪類化合物（Benzoxazinoids，BXs）是一類具有藥理學特性和保健特性的天然化合物，按化學方法分為苯并惡唑啉酮類、內酰胺類和異羥肟酸類[1]，多項研究表明苯并惡唑啉酮類的功能活性相對 BXs中其他物質的功能活性更豐富，其中 6-甲氧基-2-苯唑啉酮（6-Methoxybenzoxazolin-2-one，MBOA）和2-苯并惡唑啉酮（Benzoxazolin-2-one，BOA）是兩種主要的苯并惡唑啉酮類化合物[2]。MBOA、BOA在食品加工領域受到越來越多的關注，不僅因為MBOA、BOA存在于小麥等谷物食品中，還因為其具有一定的保健功效。

已報道的關于MBOA、BOA的提取與檢測方法各有不同，包括樣品前處理、提取溶劑及比例、提取方式三個方面，樣品前處理主要分為在液氮下研磨[3]和凍干后磨粉[4]兩種方式。提取溶劑的選擇多為 80%甲醇水溶液，或加入少量甲酸（1%）。提取方式包括加速溶劑萃取儀萃取[5]、震蕩[6]、超聲[7]等，但大部分選用加速溶劑萃取儀加速萃取。在檢測方法上主要包括HPLC-MS[8]、LC-ESI-MS[9]、UPLC-Q-TOF[10]、UPLC-Q-TOFMS[11]等?，F在檢測和提取方式尚未形成統(tǒng)一的標準[12]，因此，建立MBOA、BOA的檢測方法，并在食品領域對 MBOA、BOA進行系統(tǒng)的含量測定與分析具有重要的研究意義。

研究發(fā)現MBOA具有抑制食欲、減輕體重、刺激生殖系統(tǒng)，抗癌以及抗過敏等功效，BOA、MBOA均具有抗菌作用[13]，現階段我國對于MBOA的研究重點主要在于其對田鼠繁殖的影響及對植物生長的影響等方面，暫未見 MBOA、BOA在食品加工的應用以及保健功效方面的研究，因此，MBOA、BOA作為一種新興的功能活性成分，具有重要的研究潛力。

本研究在優(yōu)化MBOA、BOA提取以及檢測方法的基礎上，測定河南省十余種小麥中MBOA、BOA的含量，進一步選取MBOA、BOA含量較高的小麥進行不同加工處理，進而明確其含量變化與加工方式之間的關系，并以阿魏酸、阿卡波糖作為陽性對照，研究 MBOA、BOA對血糖的調控作用，為其對健康的有益作用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

淮麥：江蘇；甲醇、乙腈、乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、酒石酸鉀鈉、亞硫酸氫鈉、苯酚、氫氧化鈉：國藥集團化學試劑有限公司；乙酸乙酯：西隴化工股份有限公司；鄭麥 366、鄭麥0942、鄭麥136、溫廡0528、鄭麥1860、鄭麥26、百農207、矮抗58、鄭麥7698、周麥18、鄭麥9023、鄭麥 1354、周麥 36：河南省農業(yè)科學院；α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷3，5-二硝基水楊酸、MBOA、BOA：Sigma有限公司；阿魏酸：源葉生物。

1.2 儀器與設備

H2OPRO-UV-T型超純水系統(tǒng)：德國賽多利斯公司；FreeZone? 6L型冷凍干燥機：美國Labconco公司；FW-100型高速萬能粉碎機：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；JK-MSH-Pro-6A型六聯(lián)磁力攪拌器：上海精學科學儀器公司；ME104型電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；CR22N型高速離心機：日本日立公司；PT 2500 E型水浴鍋：杰瑞爾電器有限公司；1260型HPLC、6420型QQQ：安捷倫公司；R-300型旋蒸儀：瑞士步琦BUCHI公司；HMJ-A35A1型和面機：小熊電器股份有限公司；SZ28T1型蒸鍋：浙江蘇泊爾股份有限公司；BioTekSynergy H1MDG型酶標儀：美國伯騰儀器有限公司；Cary 100型紫外分光光度計：安捷倫科技（中國）有限公司。

1.3 小麥中MBOA、BOA的提取

取小麥樣品–80 ℃凍干12 h，直至樣品質量不在減輕。將凍干后的樣品磨碎至粉狀，稱取一定量的樣品置于80%甲醇水溶液中（w/v=1/5），磁力攪拌3 h。將搖勻后的樣品于7 000 rpm，7 ℃離心10 min。取用上清液，旋蒸濃縮，將甲醇全部蒸出后加入等體積乙酸乙酯萃取3次，取乙酸乙酯層。將乙酸乙酯提取物旋蒸至干，1 mL甲醇水溶液復溶。將復溶后樣品過0.22 μm的有機濾膜進行過濾用于含量分析。

1.4 不同加工方式提取MBOA、BOA

采用樣品的熱處理、水熱加工處理、水冷加工處理的方式提取處理后不同種小麥中的MBOA、BOA。熱處理采用 50 ℃烘箱將小麥烘烤至干，水熱加工處理參考 Hans等[14]方法，取一定量的小麥種子置于托盤上，第一天早晨使用種子∶水=1∶15的比例將種子潤濕，晚上采用種子∶水=1∶10的比例重復潤濕。之后的 4天每天早晚采用種子∶水=1∶10的比例重復潤濕，共 8次以上，總水熱加工（HTP）為5天。收集小麥種子，在 50 ℃條件下烘干直至重量不減輕。將收集得到的小麥種子磨粉，提取得到最終樣品。水冷加工處理方式同樣參考Hans等[14]方法，在HTP 處理5天后收集小麥種子，在凍干機中凍干，直至重量不減輕。將收集到的小麥種子磨粉，進行提取。

1.5 液質聯(lián)用分析不同小麥品種中的MBOA和BOA含量

采用Agilent HPLC 1260 和QQQ檢測器進行檢測，色譜柱為Phenomenex Synergi Polar RP-80A，250 × 2 mm, 粒徑為 4 μm。采用的流動相為A相：7%乙腈和20 mmol/L的乙酸，B相：78%乙腈和20 mmol/L的乙酸。進樣量為5 μL，流速為0.2 mL/min。洗脫條件為梯度洗脫：0～5 min：16%的 B，5～22 min：16%～30%的 B，22～30 min：30%～50%的 B，30～33 min：50%～16%的 B，33～40 min：16%的 B?？傔\行時間為 40 min。ESI設定為負離子模式，并在MRM模式下進行檢測，離子源溫度：350 ℃；錐孔電壓：45 psi；毛細管電壓：4 kV；柱溫30 ℃。根據繪制得到的標準曲線計算樣品中的 MBOA、BOA的含量。BOA和MBOA的標準品質譜圖如圖1所示。

圖1 BOA和MBOA的標準品質譜圖Fig.1 Chromatogram of BOA and MBOA

1.6 降血糖功能活性測定

1.6.1 α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

參考龔凌霄等方法[15]，分別將MBOA、BOA用甲醇溶解并配制成濃度為0.1 g/mL的儲備液，0.1 mol/L，pH 6.8的磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋備用；以阿魏酸和阿卡波糖為陽性對照，配制質量濃度為10 mg/mL阿卡波糖溶液，用PBS緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.8）稀釋備用。

分別取10 μL不同質量濃度的供測樣液與45 μL α-葡萄糖苷酶（0.5 U/mL）磷酸鹽溶液（0.1 mol/L，pH 6.8）振蕩混勻，在37 ℃條件下水浴10 min。之后加入 45 μL 4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷溶液，37 ℃反應20 min，再加入100 μL碳酸鈉溶液（0.2 mol/L）終止反應，在405 nm波長下測定吸光度。以PBS緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.8）代替α-葡萄糖苷酶溶液作為樣品空白（Ab）；以PBS緩沖液代替供測樣品作為酶液空白（A0）。按照公式計算抑制率，并用 SPSS軟件求出各供測樣品的半抑制濃度（IC50）。

式中：Ac為未添加樣品反應液的吸光度；As為添加樣品反應液的吸光度。

1.6.2 α-淀粉酶抑制活性測定

分別取MBOA、BOA用甲醇溶解并配制成濃度為0.1 g/mL的儲備液，并用0.02 mol/L且pH 6.8的PBS緩沖液稀釋備用；以阿卡波糖和阿魏酸為陽性對照。配置3,5二硝基水楊酸（DNS）溶液，用0.02 mol/L PBS，pH值為6.8的PBS溶液配制13 U/m L的α-淀粉酶溶液。

參考Hemalatha等[16]方法并做改動，測定方法：100 μL 抑制劑樣品+ 100 μL α-淀粉酶溶液，于37 ℃條件下培養(yǎng)10 min。再加入100 μL 1%的可溶性淀粉溶液（0.02 mol/L PBS），置于37 ℃條件下培養(yǎng)10 min。加入0.2 mL DNS溶液，沸水浴5 min，冷卻至室溫。加入4 mL蒸餾水稀釋，在540 nm下測定吸光度。按照公式計算出α-淀粉酶抑制率，并用SPSS軟件求出IC50值。

式中：A0為酶液空白吸光度；Ac為未添加樣品反應液的吸光度；As為添加樣品反應液的吸光度；Ab為樣品空白吸光度。

1.6.3 α-葡萄糖苷酶抑制作用的動力學

參考姜麗麗等[17]的方法并稍作改動，其中，α-葡萄糖苷酶濃度（0.05 U/mL）不變，分別設置6個不同濃度的底物（0.1、0.25、0.5、1、2.5、5 mmol/L），BOA、MBOA兩種抑制劑也選取三個不同濃度（0、25、50 mg/mL)，并測定吸光度值A，橫坐標為底物濃度的倒數（1/ S），縱坐標為反應速度的倒數（1/ V），繪制Lineweaver-Burk雙倒數曲線圖，得到BOA與MBOA對α-葡萄糖苷酶的抑制類型。

底物濃度為 5 mmol/L，設置 6個不同的 α-葡萄糖苷酶濃度（0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5 U/mL），BOA、MBOA兩種抑制劑采取三個不同濃度（0、25、50 mg/mL），測定吸光度值A，以酶濃度為橫坐標，以反應速度為縱坐標，分析BOA、MBOA 對 α-葡萄糖苷酶的抑制作用是否可逆。

1.6.4 α-淀粉酶抑制作用的動力學

α-淀粉酶濃度（1 U/mL）不變，設置6個不同濃度的底物（0.25、0.5、1、2.5、5、10 mg/mL），BOA、MBOA兩種抑制劑采取三個不同濃度（0、25、50 mg/mL），測定吸光度值A，繪制Lineweaver-Burk雙倒數曲線，分析BOA、MBOA對α-淀粉酶的抑制類型。

底物濃度為10 mg/mL，設置6個不同的α-淀粉酶濃度（0.25、0.5、1、2.5、5、10 U/mL），BOA、MBOA兩種抑制劑采取三個不同濃度（0、25、50 mg/mL），測定吸光度值 A，以酶濃度為橫坐標，以反應速度為縱坐標，分析BOA、MBOA對α-淀粉酶的抑制作用是否可逆。

1.7 數據分析

采用均數±標準差（X±SD）形式表示測定結果，并使用Microsoft Excel進行數據分析并做圖，使用 SPSS數據分析軟件進行單因素方差分析（ANOVA），以P＜0.05標準判斷差異的顯著性情況。

2 結果與討論

2.1 加工處理對小麥中MBOA、BOA含量的影響

以其中兩種小麥（周麥18、鄭麥1860）為例，分別進行三種處理方式后測定。經過三種處理方式的全麥粉中MBOA和BOA含量均有所增加，并且水冷加工處理與熱處理的方式相對水熱加工（HTP）較低；并且由表1中數據可知，相對HTP中的水熱處理兩個步驟中，水加工處理是提高MBOA與BOA的含量的關鍵步驟。造成這種差異的原因主要是水加工處理會使得小麥發(fā)芽，而相對小麥籽粒，小麥胚芽及幼苗中MBOA和BOA含量較高，進而增加了全麥粉中兩種化合物的含量。另有研究表明[18]，MBOA與BOA是苯并噁嗪化合物中結構較為穩(wěn)定的化合物，而熱加工可以促進苯并噁嗪類其他化合物向MBOA與BOA的轉化，從而增加兩種化合物的含量，且苯并惡唑啉酮含量的增加與羥肟酸在烘烤過程中發(fā)生的化學降解反應相一致，羥肟酸的生物合成主要發(fā)生在HTP處理過程中。

表1 不同處理方式下周麥18和鄭麥1860中BOA和MBOA的含量Table 1 The content of BOA and MBOA in wheat 18 and wheat 1860 under different treatments

2.2 加工處理對不同小麥品種中MBOA和BOA含量的影響

將收集到的十三種小麥均進行未處理全麥粉與HTP處理后全麥粉進行MBOA與BOA含量測定，得到結果如表2。結果表明不同品種小麥中MBOA與BOA的含量差異比較明顯，不同小麥品種的MBOA含量較接近，在4.30～5.02 ng/g之間，其中鄭麥1860的MBOA含量最高；BOA含量范圍為1.62～7.98 ng/g，以周麥26的BOA含量最高，是含量最低的溫廡0528的5倍。另外，每種小麥的MBOA和BOA的含量比例4∶1到4∶7不等，這些差異性分析原因可能與小麥的生長環(huán)境、土壤因素與抗蟲害能力有關。經過不同加工處理方式得到的樣品中的MBOA與BOA含量也有顯著差異，且MBOA與BOA含量變化趨勢相近，按MBOA與BOA含量由低到高分別為：未經加工處理的全麥粉＜熱處理后全麥粉（50 ℃）＜水冷加工處理后全麥粉＜水熱加工處理后全麥粉。其中，經過熱處理的全麥粉中MBOA和BOA含量是未處理的全麥粉的1.5～12倍不等，水熱加工和水冷加工全麥粉中 MBOA、BOA的含量是未處理全麥的500～1 000倍。

表2 全麥粉與HTP后全麥粉中BOA和MBOA的含量Table 2 The content of BOA and MBOA in whole wheat powder

2.3 MBOA、BOA降血糖功能活性評價

2.3.1 α-葡萄糖苷酶抑制活性

如圖2和圖3所示，MBOA、BOA對α-葡萄糖苷酶均有抑制活性，且抑制能力呈濃度劑量依賴性。其中，抑制能力由大到小排序為：阿卡波糖＞MBOA＞阿魏酸＞BOA。MBOA的抑制能力強于阿魏酸，但相對降糖藥阿卡波糖差距較大。阿卡波糖濃度為1 mg/mL時，抑制率高達93.4%，而MBOA、BOA和阿魏酸的抑制率分別為21.6%、5.5%和13.2%。

圖2 MBOA、BOA與阿魏酸在不同濃度下對α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig. 2 Inhibition of MBOA, BOA and ferulic acid on α-glucosidase in different concentrations

圖3 阿卡波糖在不同濃度下對α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig. 3 Inhibition of acarbose on α-glucosidase in different concentrations

2.3.2 α-淀粉酶抑制活性

如圖4和圖5所示，MBOA、BOA對α-淀粉酶均有抑制活性，且抑制能力呈濃度劑量依賴性。其中，抑制力由大到小排序為：阿卡波糖＞阿魏酸＞BOA＞MBOA。當阿卡波糖濃度為 1 mg/mL時，抑制率為58.7%，而MBOA、BOA和阿魏酸的抑制率分別為9.4%、24.7%和29.7%。

圖4 MBOA、BOA與阿魏酸在不同濃度下對α-淀粉酶的抑制率Fig. 4 Inhibition of MBOA, BOA and ferulic acid on α-amylase in different concentrations

圖5 阿卡波糖在不同濃度下對α-淀粉酶的抑制率Fig. 5 Inhibition of acarbose on α-amylase in different concentrations

運用SPSS軟件計算MBOA、BOA與對照組阿卡波糖、阿魏酸的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的IC50值，選取logit模型，設置濃度、抑制率、總數三個變量，通過軟件進行曲線擬合，自動生成曲線方程。表3結果表明BOA對α-葡萄糖苷酶的抑制能力最低，MBOA對α-葡萄糖苷酶的抑制能力雖優(yōu)于阿魏酸，卻遠小于阿卡波糖；而MBOA對 α-淀粉酶抑制能力最弱，BOA對 α-淀粉酶的抑制能力與阿魏酸相近，但IC50值約為阿卡波糖的33倍。

表3 MBOA、BOA、阿魏酸與阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的IC50Table 3 IC50 values of MBOA, BOA, ferulic acid and acarbose for α-glucosidase and α-amylase inhibition mg/mL

因此，降糖功能方面，MBOA、BOA對 α-葡萄糖苷酶以及 α-淀粉酶均具有一定的抑制作用，且接近甚至優(yōu)于阿魏酸的酶抑制能力，可以作為營養(yǎng)因子在控制血糖方面發(fā)揮積極作用。

2.3.3 α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制動力學

通過酶抑制動力學分析進一步分析確定MBOA、BOA的抑制機制。由圖6可知，在α-葡萄糖苷酶體系分別加入不同濃度的MBOA、BOA，反應速度隨抑制劑濃度的增加而減小，米氏常數保持不變。說明 MBOA、BOA對 α-葡萄糖苷酶的抑制作用是非競爭的。

圖6 BOA、MBOA對α-葡萄糖苷酶的抑制類型Fig. 6 Inhibition type of MBOA and BOA on α-glucosidase

由圖7可知，在α-淀粉酶體系分別加入不同濃度的MBOA、BOA，反應速度隨抑制劑濃度的增加而減小，米氏常數保持不變。說明MBOA、BOA對α-淀粉酶的抑制作用是非競爭的。

圖7 BOA、MBOA對α-淀粉酶的抑制類型Fig. 7 Inhibition type of BOA and MBOA on α-amylase

3 結論

近幾年才報道有關包括MBOA、BOA在內的苯并噁嗪類化合物在成熟谷物及谷類制品中的研究，而且此類物質的研究多見于國外。國內苯并噁嗪類化合物的研究重點在于MBOA、DIMBOA這兩種化感類物質，且主要關注其在植物保護與昆蟲防御方面。與其他谷物相比，玉米、小麥、黑麥中 MBOA、BOA含量相對較高且易檢測，而這幾類谷物作為人類膳食的重要組成部分與人體健康息息相關。而 MBOA、BOA作為其中的功能活性成分，其提取、檢測方法尚未有明確標準，關于我國小麥中 MBOA、BOA的含量與比例關系尚不明確，關于 MBOA、BOA及其它苯并噁嗪類化合物的功能活性研究也不全面。本研究對我國的13個小麥品種中MBOA、BOA含量進行分析比較，結果表明同品種全小麥中的MBOA、BOA含量具有較大差異，而適當加工方法可以大幅提高 MBOA、BOA含量，進一步對MBOA、BOA的降血糖功能活性進行評價，MBOA、BOA 對 α-葡萄糖苷酶以及 α-淀粉酶均具有一定的抑制作用，且接近甚至優(yōu)于阿魏酸的酶抑制能力，可以作為營養(yǎng)因子在控制血糖方面發(fā)揮積極作用。雖然全麥籽粒中MBOA和BOA的含量較低，但經合適的加工方式可顯著提高其含量水平。作為潛在的食源性健康因子，后續(xù)需進一步完善其他苯并噁嗪類化合物的提取、檢測方法，明確不同加工處理方式對其含量的影響，并在體外研究相對完善時通過動物試驗甚至臨床試驗等進一步明確其對人體健康的影響。