氟西汀調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB/NLRP3炎癥體信號(hào)通路改善CUMS大鼠抑郁樣行為

呂霞，黃麗，張美琳，樊珺婷，馬澤微，劉歡

抑郁癥是一種以情緒低落、興趣減退和快感喪失為主要癥狀的精神類疾病，目前全球抑郁癥的患病率約為4.3%［1］，中國人的終生患病率約為3.3%［2］，已成為非正常死亡和致殘的主要原因之一。抑郁癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，近年來研究表明神經(jīng)炎癥與抑郁癥密切相關(guān)［3］，其中NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）炎癥小體是固有免疫的重要組成因子，介導(dǎo)多種動(dòng)物模型外周和中樞炎癥反應(yīng)及抑郁樣行為表現(xiàn)［4-5］。Toll樣受體4（TLR4）與炎癥體信號(hào)通路存在復(fù)雜的關(guān)聯(lián)［6］，而核因子κB（NF-κB）傳遞信號(hào)對(duì)NLRP3的激活是必需的［7］。氟西?。╢luoxetine）是一種選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑（SSRIs），主要通過抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸前釋放的5-羥色胺再攝取，增加腦內(nèi)5-羥色胺供給，從而有效控制抑郁癥狀。研究發(fā)現(xiàn)，氟西汀在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有抗炎潛力，可抑制促炎因子的水平［8］。但氟西汀能否通過調(diào)控TLR4/NF-κB/NLRP3炎癥體信號(hào)通路而改善抑郁大鼠的抑郁樣行為尚鮮見相關(guān)報(bào)道。本研究采用慢性不可預(yù)知性輕度應(yīng)激（CUMS）構(gòu)建大鼠抑郁癥模型，在明確氟西汀改善CUMS大鼠抑郁樣行為的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究其對(duì)TLR4/NF-κB/NLRP3炎癥體信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠18只，6~7周齡，平均體質(zhì)量（180±20）g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司［動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010］。于北京靈賦生物科技有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)環(huán)境內(nèi)飼養(yǎng)，溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度60%±5%，光照/黑暗12 h交替。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及主要儀器 氟西汀購自上海吉至生化科技有限公司；白細(xì)胞介素（IL）-1β和IL-18酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒和山羊抗兔二抗購于山東思科捷生物技術(shù)有限公司；山羊抗兔NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）、TLR4、NF-κB、胱 天 蛋 白 酶1（Caspase-1）和 活 化 的Caspase-1（cleaved Caspase-1）抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；山羊抗兔熒光二抗購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。ChemiDocTM XRS成像系統(tǒng)、多功能酶標(biāo)儀和電泳儀均購自美國Bio-Rad公司；倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3 研究方法

1.3.1 動(dòng)物分組、給藥及CUMS模型的建立 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組和氟西汀組，每組6只。模型組和氟西汀組參照文獻(xiàn)［9］進(jìn)行CUMS造模。刺激方式包括：禁食12 h，禁水12 h，晝夜顛倒，墊料潮濕8 h，60 Hz噪聲刺激1 h，夾尾2 min，搖晃鼠籠15 min，4℃冰水游泳5~10 min，束縛2 h。每天從9種刺激方式中隨機(jī)選擇2種，3 d內(nèi)不重復(fù)，持續(xù)刺激11周。CUMS干預(yù)第7周開始，氟西汀組灌胃氟西?。?0 mg·kg-1·d-1），其余組灌胃1 mL生理鹽水，連續(xù)給藥5周。給藥5周后，進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)。行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后所有大鼠禁食過夜，采用吸入CO2安樂死處理，斷頭后取出完整腦組織，右側(cè)腦組織經(jīng)液氮快速冷凍后保存于-80℃冰箱備用，左側(cè)腦組織于4%多聚甲醛固定并進(jìn)行石蠟包埋。

1.3.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)觀察大鼠抑郁樣行為 在第11周CUMS干預(yù)結(jié)束后進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，將每只大鼠單獨(dú)放置在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱（100 cm×100 cm×40 cm）的底部中心區(qū)域，實(shí)驗(yàn)箱底部分成16個(gè)相等的正方形。經(jīng)過30 s的適應(yīng)后，使用自動(dòng)視頻跟蹤系統(tǒng)記錄5 min內(nèi)動(dòng)物的水平運(yùn)動(dòng)距離及垂直站立次數(shù)。每次實(shí)驗(yàn)后，用乙醇清潔設(shè)備。

1.3.3 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)觀察大鼠抑郁樣行為 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)設(shè)備是由2個(gè)開臂（50 cm×10 cm）、2個(gè)閉臂（50 cm×10 cm×40 cm）和1個(gè)中心平臺(tái)（10 cm×10 cm）組成一個(gè)十字形結(jié)構(gòu)。在每次測(cè)試前，將大鼠單獨(dú)放在中心平臺(tái)上，面向同一個(gè)閉臂，并允許其自由探索迷宮5 min。采用自動(dòng)視頻跟蹤系統(tǒng)記錄其水平運(yùn)動(dòng)距離及停留在閉臂的時(shí)間。每次實(shí)驗(yàn)后，用乙醇清潔設(shè)備。

1.3.4 ELISA檢測(cè)腦組織IL-1β和IL-18的含量 取適量腦組織，按質(zhì)量體積比1︰9加入PBS，使用手持勻漿儀于冰上研磨后，低溫14 000 r/min離心15 min，取上清液。先使用BCA試劑盒定量上清液中的總蛋白，然后嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋，加樣，并依次完成溫育、洗滌、加酶、溫育、洗滌、顯色、終止反應(yīng)等過程后，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處依序測(cè)量各組大鼠腦組織中炎性因子IL-1β和IL-18的光密度（OD）值，最終根據(jù)稀釋倍數(shù)及BCA蛋白定量計(jì)算腦組織中炎性因子IL-1β和IL-18的含量。

1.3.5 免疫熒光染色觀察海馬CA3區(qū)及皮質(zhì)區(qū)NLRP3、ASC和Caspase-1的表達(dá) 石蠟包埋的左側(cè)腦組織切片（4μm），于60℃恒溫箱烤片15 min后進(jìn)行免疫熒光染色。依次進(jìn)行脫蠟、水化、封閉、抗原修復(fù)、封閉、抗體孵育等過程，使用抗熒光淬滅劑封片，并用倒置熒光顯微鏡拍照保存。

1.3.6 Western blot檢測(cè)各組大鼠腦組織TLR4/NF-κB/NLRP3炎癥體信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 右側(cè)腦組織于冰上解凍后加入適量組織裂解液，充分研磨后離心取上清液為蛋白質(zhì)樣品，BCA法計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，各組等蛋白質(zhì)量上樣、電泳和轉(zhuǎn)膜，3%脫脂牛奶封閉1 h后，加入一抗稀釋液（1︰10 000），4℃孵育過夜。TBST洗滌3次，加入二抗稀釋液，于室溫孵育1 h，TBST洗滌3次。顯影劑顯色，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行蛋白條帶的曝光和成像。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氟西汀對(duì)CUMS大鼠行為學(xué)的影響 與對(duì)照組相比，模型組大鼠在曠場(chǎng)的運(yùn)動(dòng)距離及站立次數(shù)均顯著減少（P＜0.05），在高架十字迷宮的運(yùn)動(dòng)距離減少，且在閉臂的停留時(shí)間增加（P＜0.05）；與模型組相比，氟西汀組大鼠在曠場(chǎng)的運(yùn)動(dòng)距離及站立次數(shù)均明顯增多（P＜0.05），在高架十字迷宮中的運(yùn)動(dòng)距離增加，且在閉臂的停留時(shí)間減少（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Depression-like behavior changes of rats in each group表1 各組大鼠抑郁樣行為變化（n=6，）

Tab.1 Depression-like behavior changes of rats in each group表1 各組大鼠抑郁樣行為變化（n=6，）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與模型組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照組模型組氟西汀組F曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)總運(yùn)動(dòng)距離（m）12.14±3.89 3.75±2.25a 10.66±2.12b 14.555＊＊站立次數(shù)10.67±4.84 3.17±3.12a 10.67±3.39b 7.550＊＊高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)總運(yùn)動(dòng)距離（m）8.24±1.79 2.21±1.18a 7.96±1.62b 28.763＊＊閉臂停留時(shí)間（s）237.98±7.32 284.32±7.99a 208.38±27.41b 30.342＊＊

2.2 氟西汀對(duì)CUMS大鼠腦組織IL-1β和IL-18含量的影響 與對(duì)照組相比，模型組大鼠腦組織IL-1β和IL-18的含量顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，氟西汀組大鼠腦組織IL-1β和IL-18的含量顯著降低（P＜0.05），見圖1。

Fig.1 Comparison of IL-1βand IL-18 in brain tissue of CUMS rats between the three groups圖1 各組CUMS大鼠腦組織IL-1β和IL-18含量比較

2.3 氟西汀對(duì)CUMS大鼠腦組織NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 免疫熒光染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠海馬CA3區(qū)和皮質(zhì)區(qū)NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白的表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，氟西汀組NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白的表達(dá)明顯降低（P＜0.05），見圖2、3。

2.4 氟西汀對(duì)CUMS大鼠TLR4/NF-κB/NLRP3炎癥體信號(hào)通路的影響 與對(duì)照組比較，模型組大鼠TLR4、NF-κB、NLRP3、cleaved Caspase-1和Caspase-1蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，氟西汀組大鼠上述蛋白表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05），見圖4、表2。

3 討論

3.1 氟西汀可以改善CUMS大鼠的抑郁樣行為 CUMS刺激符合抑郁癥誘發(fā)因素（長(zhǎng)期、慢性、低強(qiáng)度的壓力刺激）的特征，能夠高效度地模擬人類應(yīng)激狀態(tài)時(shí)的情緒，誘導(dǎo)嚙齒類動(dòng)物產(chǎn)生焦慮、抑郁樣行為［10］，具有良好的表觀效度、構(gòu)造效度和預(yù)測(cè)效度［11］，是抑郁癥有效且使用最廣的制備模型［12］。本研究采用CUMS刺激建立抑郁癥模型后發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出自主活動(dòng)能力和探索能力的降低，表明抑郁癥模型制備成功。而氟西汀治療能夠顯著改善CUMS所致的大鼠運(yùn)動(dòng)能力降低及探索行為的減少，表明氟西汀具有改善CUMS大鼠抑郁樣行為的作用，與以往的研究結(jié)果一致［13］。

Fig.2 Expression levels of NLRP3,ASC and Caspase-1 proteins in hippocampal CA3 area and cortex of rats in each group(immunofluorescence staining, ×200)圖2 各組大鼠NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白在海馬CA3區(qū)及皮質(zhì)區(qū)的表達(dá)（免疫熒光染色，×200）

Fig.3 Comparison of relative expression levels of NLRP3,ASC and Caspase-1 in brain tissue of rats between the three groups圖3 各組大鼠NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較

Fig.4 Effects of fluoxetine on TLR4/NF-κB/NLRP3 inflammasome signal pathway of CUMS rats圖4 氟西汀對(duì)CUMS大鼠TLR4/NF-κB/NLRP3炎癥體信號(hào)通路的影響

Tab.2 Comparison of expression levels of TLR4,NF-κB,cleaved Caspase-1,NLRP3 and Caspase-1 between the three groups表2 各組大鼠TLR4、NF-κB、cleaved Caspase-1、NLRP3和Caspase-1蛋白表達(dá)水平比較（n=6

Tab.2 Comparison of expression levels of TLR4,NF-κB,cleaved Caspase-1,NLRP3 and Caspase-1 between the three groups表2 各組大鼠TLR4、NF-κB、cleaved Caspase-1、NLRP3和Caspase-1蛋白表達(dá)水平比較（n=6

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與模型組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照組模型組氟西汀組F Caspase-1 1.00±0.00 1.42±0.14a 1.07±0.17b 34.212＊＊TLR4 1.00±0.00 1.42±0.27a 1.12±0.21b 16.689＊＊NF-κB 1.00±0.00 1.44±0.33a 0.97±0.19b 16.095＊＊cleaved Caspase-1 1.00±0.00 1.36±0.14a 1.06±0.17b 28.289＊＊NLRP3 1.00±0.00 1.28±0.28a 0.97±0.25b 16.172＊＊

3.2 氟西汀可以抑制CUMS大鼠腦內(nèi)NLRP3炎癥小體的激活 炎癥因子在抑郁癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，在抑郁動(dòng)物模型［14］和臨床研究［15］中均發(fā)現(xiàn)IL-1β和IL-18等炎癥因子的表達(dá)顯著升高。本研究發(fā)現(xiàn)，慢性應(yīng)激可以顯著增加大鼠腦組織中IL-1β和IL-18的含量，而氟西汀治療可以顯著降低CUMS大鼠腦組織中IL-1β和IL-18的含量，從而減輕抑郁樣行為，進(jìn)一步說明了降低促炎細(xì)胞因子的水平是改善CUMS大鼠抑郁樣行為的關(guān)鍵。炎癥因子IL-1β和IL-18的分泌與NLRP3炎癥小體的激活相關(guān)。NLRP3炎癥小體是一種調(diào)節(jié)先天性免疫炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)復(fù)合物，包括NLRP3、ASC和效應(yīng)蛋白Caspase-1［16］，是目前研究最廣泛的炎癥小體。NLRP3炎癥小體可被應(yīng)激和細(xì)胞因子等刺激激活，誘導(dǎo)IL-1β和IL-18成熟并釋放到胞外，從而誘發(fā)神經(jīng)炎癥。研究表明NLRP3炎癥小體參與了抑郁和焦慮的發(fā)病機(jī)制［17］；而且NLRP3基因敲除（NLRP3-/-）能改善小鼠因慢性應(yīng)激引起的抑郁樣行為［14］，可見其是連接慢性應(yīng)激與抑郁狀態(tài)之間的關(guān)鍵介質(zhì)。本研究顯示，氟西汀治療可以逆轉(zhuǎn)CUMS刺激引起的腦組織NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白的表達(dá)上調(diào)，并降低腦組織內(nèi)IL-1β和IL-18的含量，表明氟西汀可抑制NLRP3炎癥小體的激活，減少IL-1β和IL-18的成熟和釋放，進(jìn)而改善CUMS大鼠的抑郁樣行為。

3.3 氟西汀抑制NLRP3炎癥小體的激活與TLR4/NF-κB信號(hào)有關(guān) NLRP3炎癥小體被激活誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)前需要接受啟動(dòng)信號(hào)，如TLR4/NF-κB信號(hào)的激活，活化的NF-κB進(jìn)一步上調(diào)NLRP3、pro-IL-1β的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，激活炎癥小體，活化的炎癥小體誘導(dǎo)IL-1β和IL-18的成熟與釋放并啟動(dòng)下游炎癥反應(yīng)。在抑郁癥小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，作為啟動(dòng)信號(hào)的TLR4與NLRP3呈現(xiàn)一致的高表達(dá)［15］；而且NF-κB信號(hào)與NLRP3炎癥小體共同調(diào)節(jié)IL-1β的轉(zhuǎn)錄和功能［18］；慢性應(yīng)激可以顯著增加海馬中TLR4和NF-κB的表達(dá)，加重嚙齒類動(dòng)物的抑郁樣行為，而敲除TLR4基因可以降低TLR4和NF-κB的表達(dá)，改善CUMS所致的抑郁樣行為［19］。以上研究表明TLR4/NF-κB信號(hào)是誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體的激活及啟動(dòng)下游炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)，可能作為抑郁癥治療的新靶點(diǎn)。本研究結(jié)果表明CUMS刺激后，TLR4/NFκB信號(hào)和NLRP3呈現(xiàn)一致的高表達(dá)，而氟西汀治療又可逆轉(zhuǎn)這種高表達(dá)，提示氟西汀可能通過TLR4/NF-κB信號(hào)調(diào)控NLRP3炎癥小體的激活，影響其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮對(duì)CUMS大鼠抑郁樣行為的保護(hù)作用。

綜上所述，本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了氟西汀可以改善CUMS大鼠的抑郁樣行為，其機(jī)制可能與抑制TLR4/NF-κB/NLRP3炎癥體信號(hào)通路的激活，進(jìn)而減少腦組織中促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的成熟與釋放，減輕CUMS所致的炎癥反應(yīng)有關(guān)。氟西汀作為一種傳統(tǒng)的抗抑郁藥物，不僅可以通過選擇性抑制5-羥色胺的再攝取治療抑郁癥患者，而且可以通過調(diào)控TLR4/NF-κB/NLRP3炎癥體信號(hào)通路改善CUMS大鼠的抑郁樣行為，為臨床治療抑郁癥提供了新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。