VEGFR-3+單核細(xì)胞對(duì)高血壓小鼠左心室重塑的影響

楊國(guó)紅，余芳芳，蔡偉，牛秀瓏，張芯，趙季紅，李玉明，陳少伯△

隨著人們生活水平的提高及生活方式的變化，高血壓的患病率持續(xù)增高。2012—2015年中國(guó)高血壓調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國(guó)成人高血壓患病人數(shù)為2.45億，患病率高達(dá)27.9%，由此造成的心血管疾病的負(fù)擔(dān)也與日俱增［1］。防治高血壓及相關(guān)的靶器官損傷，進(jìn)而控制心血管疾病的發(fā)展，已刻不容緩。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的NaCl飲食下干預(yù)12周可引起收縮壓的顯著增高和心肌淋巴管的增生，而通過(guò)過(guò)表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）-C促使淋巴管過(guò)度增生，可使收縮壓及左心室重塑得到改善［2-3］。另有報(bào)道，外周血中有一部分組成性表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（VEGFR）-3的幼稚單核細(xì)胞，在特定的條件下可進(jìn)入外周組織分化為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)淋巴管的生成［4-6］?？煞裢ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)VEGFR-3+單核細(xì)胞來(lái)改善高血壓及左心室重塑，目前尚少見相關(guān)報(bào)道。本研究利用流式細(xì)胞儀分選VEGFR-3+單核細(xì)胞，對(duì)高血壓小鼠進(jìn)行干預(yù)，觀察VEGFR-3+單核細(xì)胞對(duì)高鹽誘導(dǎo)的高血壓及左心室重塑的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級(jí)6周齡雄性C57BL/6小鼠100只［動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0013］及不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaCl飼料均購(gòu)自天津市奧臣實(shí)驗(yàn)動(dòng)物銷售有限公司；山羊抗小鼠VEGFR-3-Flt-4抗體購(gòu)自R&D Systems公司；大鼠抗小鼠Ly6G-PerCP/Cy5.5、大鼠抗小鼠CD11b-PE抗體、大鼠抗小鼠F4/80-PE-Cy5抗體均購(gòu)自Biolegend公司；TRIzol購(gòu)自TAKARA公司；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR試劑購(gòu)自Roche公司，所用引物購(gòu)自北京六合華大基因科技有限公司；N-硝基-L-精氨酸甲酯（Nω-Nitro-L-arginine Methyl Ester，L-NAME）、麥胚凝集素（wheat germ agglutinin，WGA）均購(gòu)自Sigma公司；4’，6-diamidino-2-phenylindole，dihydrochloride（DAPI）購(gòu)自Roche公司；Masson染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；小鼠尾壓CODATM監(jiān)測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Kent Scientific公司；熒光定量PCR（qPCR）儀（ABI 7300）購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司；FC 500流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司；FACSAria流式細(xì)胞分選系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)BD公司；Vevo 2100超聲影像系統(tǒng)購(gòu)自加拿大Visual Sonic公司；E600POL偏振光顯微鏡和ECLIPSE 80i熒光顯微鏡均購(gòu)自日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與喂養(yǎng)方法 C57BL/6小鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，以隨機(jī)數(shù)字表法分為正常鹽（0.5%NaCl）飲食組（NS組，n=10）、高鹽（8%NaCl）飲食組（HS組，n=10），HS+LNAME組（HS+L組，n=50）及HS+L-NAME+外周血VEGFR-3+單核細(xì)胞（PBVM）干預(yù)組（HS+L+PBVM組，n=30）。所有實(shí)驗(yàn)小鼠均飼養(yǎng)于清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)條件：室溫20~24℃，相對(duì)濕度55%~65%，氨濃度＜20 mg/L，自由飲水，給光7：00—19：00。分別在干預(yù)前、8周、12周利用小鼠尾壓監(jiān)測(cè)系統(tǒng)動(dòng)態(tài)測(cè)量小鼠收縮壓。

1.2.2 PBVM的制備與干預(yù) 在高鹽飲食干預(yù)9~12周時(shí)利用FACSAria流式細(xì)胞分選系統(tǒng)采集HS+L組小鼠PBVM，具體方法如下：經(jīng)下頜下靜脈采集C57BL/6小鼠外周血1 mL加入EDTA抗凝的EP管中混勻。依次加入抗小鼠Ly6GPerCP-Cy5.5、CD11b-PE及VEGFR-3-Flt-4抗體與抗凝血混勻并避光孵育15 min，之后加入10 mL紅細(xì)胞裂解液避光孵育10 min，350×g離心5 min棄上清液后加入1 mL細(xì)胞染色緩沖液重懸細(xì)胞，再次以350×g離心5 min，隨后以1.5 mL細(xì)胞染色緩沖液重懸細(xì)胞，上機(jī)分選。分選所得PBVM經(jīng)尾靜脈注射對(duì)HS+L+PBVM組小鼠進(jìn)行干預(yù)，從高鹽飲食干預(yù)第9周開始，每周干預(yù)1次，每次5×105個(gè)PBVM，共4次。

1.2.3 小鼠心肌組織PBVM的鑒定 于PBVM注射后第1周的第1、2、3、5、7天分別處死部分HS+L+PBVM及HS+L組小鼠（每組每次4只）取心肌組織制備單個(gè)核細(xì)胞懸液，利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)單個(gè)核細(xì)胞懸液中VEGFR-3+巨噬細(xì)胞進(jìn)行鑒定。小鼠心肌剪碎后，冷PBS清洗3次，將含組織塊的PBS懸液置于Medmachine（Dako，Denmark）中制備單個(gè)核細(xì)胞。隨后用300目濾器過(guò)濾，250×g離心5 min，沉淀物以PBS重懸。制備的單個(gè)核細(xì)胞中依次加入抗小鼠F4/80-PE-Cy5及VEGFR-3-Flt-4抗體，混勻并避光孵育15 min，棄上清后加入500μL細(xì)胞染色緩沖液重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)，設(shè)門方法見圖1。應(yīng)用Flow Jo 7.6.1軟件對(duì)流式數(shù)據(jù)進(jìn)行分析［7］。

1.2.4 qPCR 12周高鹽飲食干預(yù)結(jié)束后處死各組小鼠，取左心室心肌組織，以TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，以qPCR檢測(cè)心肌組織張力應(yīng)答增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（TonEBP）以及淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物同源盒轉(zhuǎn)錄因子（Prox）-1、淋巴管透明質(zhì)酸受體（LYVE）-1、足蛋白（Podoplanin）、VEGF-C mRNA表達(dá)水平。PCR反應(yīng)體系20μL：cDNA模板1μL，上、下游引物各0.5μL，2×SYBR Green Master 10μL，MilliQ超純水8μL。PCR反應(yīng)條件：50℃2 min；95℃10 min；95℃15 s，60℃1 min，30個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平：ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）-對(duì)照組（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）。所用引物序列見表1。

Fig.1 The gating method for flow cytometry analysis of F4/80+/VEGFR-3+macrophages圖1 F4/80+/VEGFR-3+巨噬細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)分析的設(shè)門方法

Tab.1 The primer sequence of qPCR表1 qPCR引物序列

1.2.5 小鼠心臟超聲參數(shù)測(cè)定 在高鹽干預(yù)12周末進(jìn)行小鼠心臟超聲參數(shù)的測(cè)定。在麻醉狀態(tài)（2.5%異氟烷）下進(jìn)行超聲數(shù)據(jù)的采集，測(cè)定的參數(shù)包括：左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、左心室舒張末期容積（LVEDV）、左心室收縮末期容積（LVESV）和左心室后壁厚度（LVPWT），計(jì)算左心室縮短分?jǐn)?shù)（LVFS）和左心室射血分 數(shù)（LVEF），LVFS=（LVEDD-LVESD）/LVEDD，LVEF=（LVEDV-LVESV）/LVEDV［7］。

1.2.6 小鼠心肌組織病理學(xué)分析 取小鼠左心室橫截面心肌組織，經(jīng)石蠟包埋后，制備5μm厚的切片進(jìn)行病理染色分析。Masson染色后的切片在顯微鏡下獲取圖像，利用Image Pro Plus 5.0軟件計(jì)算膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）；WGA染色后的切片在熒光顯微鏡下獲取圖像，利用Image Pro Plus 5.0分析軟件計(jì)算心肌細(xì)胞橫截面積（CSA），每張切片選取10個(gè)視野，所得平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，連續(xù)型變量以表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠收縮壓比較 高鹽干預(yù)12周時(shí)，HS組、HS+L組及HS+L+PBVM組收縮壓水平高于NS組，而HS+L+PBVM組收縮壓水平較HS+L組顯著減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

Tab.2 The comparison of systolic blood pressure of mice between different groups表2 各組小鼠收縮壓的比較（n=8，mmHg，

Tab.2 The comparison of systolic blood pressure of mice between different groups表2 各組小鼠收縮壓的比較（n=8，mmHg，

＊＊P＜0.01；a與NS組比較，b與HS組比較，c與HS+L組比較，P＜0.05。1 mmHg=0.133 kPa。

組別NS組HS組HS+L組HS+L+PBVM組F基線113.13±4.82 114.25±4.17 112.25±4.23 113.63±3.11 0.335 8周115.13±5.69 134.63±4.57a 137.13±6.24a 138.00±13.71a 13.380＊＊12周113.25±4.33 136.63±13.05a 152.88±19.36ab 138.50±7.07ac 12.850＊＊

2.2 小鼠心肌組織中F4/80+/VEGFR-3+巨噬細(xì)胞的分析結(jié)果 小鼠心肌組織中VEGFR-3+巨噬細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，注射PBVM后，HS+L+PBVM組的F4/80+/VEGFR-3+巨噬細(xì)胞比例顯著高于HS+L組；HS+L+PBVM組F4/80+VEGFR-3+細(xì)胞在第3天達(dá)峰值，隨后逐漸減低，見表3。

2.3 各組小鼠淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物及TonEBP的mRNA表達(dá)水平的比較 HS組、HS+L組及HS+L+PBVM組TonEBP、VEGF-C、Prox-1、Podoplanin及LYVE-1的mRNA表達(dá)水平高于NS組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；同時(shí)，HS+L+PBVM組VEGF-C、Prox-1、Podoplanin及LYVE-1的mRNA表達(dá)水平高于HS+L組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

2.4 各組小鼠心臟超聲結(jié)果比較 與NS組比較，HS組、HS+L組及HS+L+PBVM組LVEDD顯著增加，LVEF及LVFS顯著減低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），出現(xiàn)不同程度的左心室肥厚及心臟收縮功能減低。HS+L+PBVM組LVEDD、LVPWT低于HS+L組，LVFS、LVEF高于HS+L組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2、表5。

Tab.3 The comparison of the ratio of F4/80+/VEGFR-3+macrophages in myocardial tissue of mice between the two groups表3 2組小鼠心肌組織中F4/80+/VEGFR-3+巨噬細(xì)胞比例的比較 （n=4，%）

Tab.3 The comparison of the ratio of F4/80+/VEGFR-3+macrophages in myocardial tissue of mice between the two groups表3 2組小鼠心肌組織中F4/80+/VEGFR-3+巨噬細(xì)胞比例的比較 （n=4，%）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別HS+L組HS+L+PBVM組t第1天14.62±0.28 17.58±1.96 2.990＊第2天14.92±0.39 24.67±0.74 23.310＊＊第3天14.96±0.31 27.83±0.98 25.040＊＊第5天15.07±0.23 24.76±3.46 5.589＊＊第7天14.89±0.86 17.26±1.35 2.961＊

Tab.4 The comparison of mRNA expression levels of phenotype markers of lymphatic endothelial cells and TonEBP between the four groups of mice表4 各組小鼠淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞表型標(biāo)志物及TonEBP的mRNA表達(dá)水平比較 （n=3，）

Tab.4 The comparison of mRNA expression levels of phenotype markers of lymphatic endothelial cells and TonEBP between the four groups of mice表4 各組小鼠淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞表型標(biāo)志物及TonEBP的mRNA表達(dá)水平比較 （n=3，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與NS組比較，b與HS組比較，c與HS+L組比較，P＜0.05。

組別NS組HS組HS+L組HS+L+PBVM組F TonEBP 1.00±0.00 2.17±0.27a 2.87±0.82a 2.35±0.72a 5.906＊VEGF-C 1.00±0.00 1.88±0.41a 1.80±0.40a 3.16±0.55abc 15.260＊＊Prox-1 1.00±0.00 2.77±0.48a 2.56±0.45a 3.73±0.34abc 28.360＊＊Podoplanin 1.00±0.00 2.33±0.64a 2.41±0.49a 3.95±0.46abc 20.400＊＊LYVE-1 1.00±0.00 2.69±0.49a 2.88±0.55a 4.38±1.03abc 14.330＊＊

Fig.2 The representative images of M-mode ultrasound of mice in each group圖2 各組小鼠心臟M型超聲代表性圖片

Tab.5 The comparison results of ultrasound indexes of mice between each group表5 各組小鼠心臟超聲指標(biāo)的比較結(jié)果（n=5

Tab.5 The comparison results of ultrasound indexes of mice between each group表5 各組小鼠心臟超聲指標(biāo)的比較結(jié)果（n=5

＊＊P＜0.01；a與NS組比較，b與HS組比較，c與HS+L組比較，P＜0.05。

組別NS組HS組HS+L組HS+L+PBVM組F LVEDD（mm）2.68±0.45 3.50±0.52a 4.03±0.15ab 3.25±0.06ac 12.540＊＊LVEF 0.65±0.03 0.48±0.04a 0.41±0.07ab 0.56±0.05abc 21.740＊＊LVFS 0.33±0.03 0.24±0.05a 0.19±0.02ab 0.27±0.03ac 17.120＊＊LVPWT（mm）0.76±0.11 0.88±0.06a 0.98±0.11a 0.75±0.08c 6.460＊＊

2.5 各組小鼠左心室心肌組織病理結(jié)果比較 與NS組比較，HS組、HS+L組及HS+L+PBVM組CSA及CVF顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），左心室心肌細(xì)胞均有不同程度肥大，心肌間質(zhì)纖維化程度增加。HS+L+PBVM組心肌CSA及CVF低于HS+L組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3、表6。

3 討論

高血壓是心血管疾病最重要的危險(xiǎn)因素之一［8］。隨著對(duì)高血壓發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，高鹽飲食與高血壓的關(guān)系成為研究的熱點(diǎn)［7，9-10］。長(zhǎng)期高鹽飲食不僅可以引起血壓的升高，還可獨(dú)立于血壓水平引起靶器官的損傷［11-12］。由于人們高鹽飲食習(xí)慣在短時(shí)間內(nèi)難以改變，探索高鹽攝入引起高血壓及靶器官損傷的機(jī)制，以延緩高血壓及靶器官的損傷進(jìn)程尤為重要。

成年個(gè)體新生淋巴管的生成機(jī)制目前尚不清楚。有研究報(bào)道，外周血中有一部分組成性表達(dá)VEGFR-3的幼稚單核細(xì)胞，在特定條件下可以向2個(gè)方向分化，其中一部分在腫瘤壞死因子-α和（或）其他炎性因子的刺激下轉(zhuǎn)化為能分泌VEGF-C的巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖；另一部分可以分化整合到臨近的淋巴管成為新的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞［4-6］。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期的高鹽飲食干預(yù)在引起SHR大鼠血壓顯著升高的同時(shí)，心肌巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)程度及淋巴管的密度明顯增加，并伴隨著心肌細(xì)胞的肥大及心肌間質(zhì)的纖維化，而通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞內(nèi)TonEBP/VEGF-C信號(hào)通路引起心肌淋巴管的增生，可使巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕，并明顯改善左心室重塑［2-3］。本研究發(fā)現(xiàn)，增加VEGFR-3+單核細(xì)胞比例可以改善高血壓小鼠收縮壓及左心室重塑，與此同時(shí)，心肌組織中淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)水平也顯著增高，提示VEGFR-3+單核細(xì)胞可能通過(guò)促進(jìn)淋巴管的生成進(jìn)而對(duì)血壓及左心室重塑產(chǎn)生影響。

Fig.3 The representative images of WGA staining of left ventricular muscle of mice in each group圖3 各組小鼠左心室肌WGA及Masson染色的代表性圖片

Tab.6 The pathological staining analysis results of mice in each group表6 各組小鼠左室心肌CSA及CVF比較結(jié)果（n=4）

Tab.6 The pathological staining analysis results of mice in each group表6 各組小鼠左室心肌CSA及CVF比較結(jié)果（n=4）

＊＊P＜0.01；a與NS組比較，b與HS組比較，c與HS+L組比較，P＜0.05。

組別NS組HS組HS+L組HS+L+PBVM組F CSA（μm2）368.00±41.24 436.50±30.26a 592.00±24.12ab 498.00±36.89abc 31.750＊＊CVF（%）2.23±0.31 7.33±1.04a 16.15±2.07ab 10.83±1.27abc 77.560＊＊

關(guān)于促進(jìn)淋巴管的增生可以改善高血壓及左心室重塑的機(jī)制，主要考慮以下2個(gè)方面：（1）高血壓狀態(tài)下心臟淋巴回流受阻，組織液進(jìn)入淋巴管以及淋巴液回流到靜脈的過(guò)程均被抑制，引起心肌組織的淋巴水腫，淋巴水腫造成心肌間質(zhì)壓力的增高，而心肌組織水腫液中的蛋白成分也會(huì)刺激膠原纖維的合成和沉積，進(jìn)而導(dǎo)致心肌組織纖維化的加重［13-14］。（2）長(zhǎng)期高血壓導(dǎo)致的心臟淋巴管的阻塞會(huì)引起心室肌細(xì)胞水腫、心肌纖維的變性、Z帶及閏盤的破裂以及線粒體結(jié)構(gòu)的紊亂等結(jié)構(gòu)的改變，這些改變是心室重塑的重要原因［15］。長(zhǎng)期的淋巴管阻塞造成的心肌間質(zhì)水腫可能由于氧供應(yīng)受限及誘導(dǎo)缺血而引起心功能的異常，最終引起心力衰竭［16］。本研究顯示，通過(guò)促進(jìn)淋巴管的生成，使得心肌間質(zhì)壓力及水腫程度減輕，可以改善心肌纖維化程度及心臟功能。

本研究也存在不足之處。首先，本研究利用FACSAria流式細(xì)胞分選系統(tǒng)分選VEGFR-3+單核細(xì)胞，分選過(guò)程可能會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定損傷，研究中也發(fā)現(xiàn)分選出來(lái)的細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)有部分死亡，如采用磁珠分選可能會(huì)減少細(xì)胞損傷，提高實(shí)驗(yàn)效率；其次，本研究干預(yù)策略是將VEGFR-3+單核細(xì)胞回輸給高血壓小鼠，為了減少對(duì)細(xì)胞的損傷，利用流式細(xì)胞術(shù)分析間接證實(shí)了VEGFR-3+單核細(xì)胞可進(jìn)入心肌組織，而采用細(xì)胞示蹤技術(shù)能更直觀地觀察回輸VEGFR-3+單核細(xì)胞在體內(nèi)的活動(dòng)軌跡；再者，本研究觀察了VEGFR-3+單核細(xì)胞對(duì)高血壓小鼠血壓及左心室重塑的影響，但并未對(duì)其機(jī)制進(jìn)行深入探討，需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

總之，本研究以高鹽誘導(dǎo)的高血壓小鼠為研究對(duì)象，觀察了VEGFR-3+單核細(xì)胞對(duì)高血壓性左心室重塑的影響，結(jié)果提示通過(guò)調(diào)節(jié)VEGFR-3+單核細(xì)胞可以改善高血壓小鼠收縮壓與左心室重塑，為今后高血壓及靶器官損傷的防治研究提供了參考。