m6A識(shí)別蛋白HuR調(diào)控lncRNA TRG-AS1抑制結(jié)直腸癌生長(zhǎng)的機(jī)制研究

柴小兵，張利，褚菲菲，吳慧麗

結(jié)直腸癌（CRC）是一種侵襲性癌癥，發(fā)生在結(jié)腸或直腸，是全球第三大常見惡性腫瘤［1］。盡管治療CRC可采取手術(shù)、化學(xué)療法、放射療法和分子療法，但CRC患者的存活率仍然較低［2-3］。因此，深入了解CRC的發(fā)病機(jī)制對(duì)于制定新的治療策略和改善CRC患者的預(yù)后具有重要意義。近年來，RNA甲基化修飾尤其是N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）甲基化修飾被證實(shí)在腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。m6A甲基化修飾是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，主要受甲基化轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物、去甲基化酶、結(jié)合蛋白的調(diào)控［4］。人類抗原R（HuR）是m6A甲基化修飾的識(shí)別蛋白。HuR在CRC中高表達(dá)，沉默HuR可抑制CRC細(xì)胞轉(zhuǎn)移［5］。但其具體調(diào)控機(jī)制尚不完全明確。生物信息分析顯示，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）T細(xì)胞受體γ位點(diǎn)反義RNA1（T cell receptor gamma locus antisense RNA1，TRG-AS1）上存在m6A位點(diǎn)，且TRG-AS1能與HuR蛋白相互作用。相關(guān)研究顯示，沉默TRG-AS1可明顯抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲［6］。但HuR能否通過調(diào)控TRG-AS1影響CRC細(xì)胞惡性生物學(xué)行為尚不明確。因此，本研究旨在探究HuR對(duì)CRC細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2019年5月—2021年5月在鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院首次確診為CRC患者的癌組織以及距離癌組織3 cm處的癌旁組織，共19對(duì)。所有組織收集后立即凍存于液氮中?；颊呔炇鹬橥鈺狙芯康玫洁嵵荽髮W(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（倫理號(hào)：201901）。人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460及CRC細(xì)胞HCT116、SW480、LO?VO均購(gòu)自上海佰曄生物科技中心。35只5周齡的雌性BALB/c裸鼠購(gòu)自廣州銳格生物科技有限公司［生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2021-0059］。HuR小干擾RNA（si-HuR，序列：5′-UCAAAGACGCCAACUUGUA-3′）及其陰性對(duì)照（si-NC，序列：5′-UAAGGCUAUGAAGAGAUAC-3′）、HuR過表達(dá)物（OE-HuR）及其陰性對(duì)照（OE-NC）、TRG-AS1過表達(dá)物（pcDNA-TRG-AS1）及其陰性對(duì)照（pcDNA）均購(gòu)自河南睿英生物公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自武漢益普生物公司；EpiQuik M6A RNA甲基化定量檢測(cè)試劑盒（比色法）購(gòu)自廈門慧嘉生物公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自杭州昊鑫生物公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自翌圣生物科技公司；兔源一抗HuR、m6A、IgG、GAPDH及羊抗兔IgG二抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。ABI-7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自北京賽百奧科技有限公司；蛋白電泳儀購(gòu)自北京六一生物科技有限公司；FK-SY96A酶標(biāo)儀購(gòu)自山東方科儀器有限公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自上海睿鈺生物公司；XDS-100D型倒置光學(xué)顯微鏡購(gòu)自上海蔡康光學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將NCM460、HCT116、SW480、LOVO細(xì)胞置于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，并在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2 比色法檢測(cè)m6A含量 按照EpiQuik m6A RNA甲基化定量檢測(cè)試劑盒（比色法）說明書檢測(cè)組織和細(xì)胞中的m6A含量。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)組織和細(xì)胞中TRGAS1表達(dá) 使用TRIzol提取組織和細(xì)胞中RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板在ABI-7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)體系：上、下游引物各1μL，cDNA模板1μL，SYBR premix 10μL，補(bǔ)無菌水至總體積為20μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性10 s，60℃退火30 s，共45個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，通過2-ΔΔCt法計(jì)算TRG-AS1的表達(dá)水平。引物及序列見表1。

Tab.1 qPCR primer sequences表1 qPCR引物序列

1.2.4 Western blot檢測(cè)組織和細(xì)胞中HuR蛋白的表達(dá) 在冰上用RIPA裂解緩沖液裂解組織勻漿和細(xì)胞30 min，10 000 r/min離心20 min，收集上清液，通過BCA試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度，將30μg蛋白質(zhì)進(jìn)行10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳分離后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，再用5%脫脂奶粉封閉1 h，經(jīng)TBST洗滌后，將PVDF膜與一抗HuR（1∶2 000）、GAPDH（1∶1 000）在4℃下孵育過夜，再加入二抗（1∶1 000）在常溫下孵育1.5 h。加入ECL試劑觀察蛋白條帶，以GAPDH為內(nèi)參，通過Quantity One軟件計(jì)算蛋白灰度值。

1.2.5 細(xì)胞分組 OE-NC、OE-HuR、si-NC、si-HuR、si-HuR+pcDNA、si-HuR+pcDNA-TRG-AS1分別轉(zhuǎn)染于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT116細(xì)胞，命名為OE-NC組、OE-HuR組、si-NC組、si-HuR組、si-HuR+pcDNA組、si-HuR+pcDNA-TRG-AS1組，另取正常培養(yǎng)的HCT116細(xì)胞作為Ct組，轉(zhuǎn)染48 h后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將各組細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種在96孔板中培養(yǎng)48 h后，加入10μL CCK-8試劑。孵育2 h后，使用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處的光密度（OD）。

1.2.7 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力 將350個(gè)HCT116細(xì)胞接種于6 cm細(xì)胞培養(yǎng)板中，在含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d。棄培養(yǎng)液，將細(xì)胞用甲醇固定、0.1%結(jié)晶紫染色，并觀察克隆形成情況?？寺⌒纬陕剩?）=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 將1×105個(gè)細(xì)胞重懸于100μL結(jié)合緩沖液中。用5μL Annexin V-FITC和5μL碘化丙啶溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙重染色。使用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率。將第二、三象限的細(xì)胞定為凋亡細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率=（凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.2.9 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 將各組細(xì)胞以1×106個(gè)/孔接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到100%時(shí)，使用100μL移液器吸頭刮擦細(xì)胞層以制造劃痕，并將含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基替換為無FBS的DMEM培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞在0、48 h時(shí)的劃痕愈合情況。劃痕愈合率（%）=（0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.10 Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲 Transwell小室上室預(yù)涂有Matrigel，將含有5×104個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液添加到孔徑為8μm的Transwell上室中。下室填充有600μL含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。孵育48 h后，去除上表面殘留的細(xì)胞，侵襲的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，0.5%結(jié)晶紫染色。在倒置光學(xué)顯微鏡下對(duì)染色的細(xì)胞進(jìn)行拍照和計(jì)數(shù)。

1.2.11 裸鼠體內(nèi)移植瘤實(shí)驗(yàn) 將1.2.5中的各組細(xì)胞以5×105個(gè)懸浮在100μL PBS中，然后通過右側(cè)腋窩皮下接種于小鼠體內(nèi)，并命名為裸鼠Ct組、裸鼠OE-NC組、裸鼠OEHuR組、裸鼠si-NC組、裸鼠si-HuR組、裸鼠si-HuR+pcDNA組、裸鼠si-HuR+pcDNA-TRG-AS1組，每組5只。注射40 d后，處死裸鼠并分離出腫瘤，稱量腫瘤質(zhì)量。

1.2.12 甲基化RNA免疫共沉淀（MeRIP）檢測(cè)TRG-AS1上是否存在m6A位點(diǎn) 分離HCT116細(xì)胞的RNA，磁珠在室溫下用5μg抗m6A抗體或抗IgG抗體包被30 min。然后，將抗體包被的珠子與50μg總RNA在4℃下孵育過夜。經(jīng)蛋白酶K消化后，通過苯酚/氯仿/異戊醇法提取沉淀m6A結(jié)合的RNA，通過qPCR檢測(cè)TRG-AS1的表達(dá)量，方法同1.2.3。

1.2.13 RNA pull-down實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HuR與TRG-AS1結(jié)合 將生物素化的TRG-AS1陰性對(duì)照（NC）和TRG-AS1分別轉(zhuǎn)染到HCT116中。48 h后，將細(xì)胞裂解液與鏈酶親和素標(biāo)記的磁珠混合形成蛋白質(zhì)-生物/RNA-磁珠復(fù)合物，用高鹽洗脫得到蛋白質(zhì)-生物/RNA復(fù)合物，分別命名為bio-NC組、bio-TRG-AS1組，以Input作為陽(yáng)性對(duì)照。Western blot檢測(cè)HuR蛋白在蛋白質(zhì)-生物/RNA混合物中的表達(dá)，方法同1.2.4。

1.2.14 RIP檢測(cè)TRG-AS1與HuR蛋白結(jié)合 在RIP裂解緩沖液中裂解細(xì)胞，利用蛋白A/G磁珠對(duì)HuR抗體進(jìn)行免疫沉淀，用磁鐵固定與復(fù)合物結(jié)合的磁珠并洗掉未結(jié)合的部分，提取RNA，通過qPCR分析TRG-AS1的相對(duì)表達(dá)量，IgG蛋白作為對(duì)照參考。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 m6A含量、TRG-AS1和HuR蛋白在組織中的表達(dá) 與癌旁組織比較，癌組織中HuR蛋白、TRGAS1表達(dá)升高，m6A含量降低（P＜0.05），見圖1、表2。

Fig.1 Western blot detection of HuR protein expression in tissue圖1 Western blot檢測(cè)組織中HuR蛋白表達(dá)

Tab.2 Comparison of HuR protein,m6A content and TRG-AS1 expression in cancer and adjacent tissues表2癌組織和癌旁組織HuR蛋白、m6A含量和TRG-AS1表達(dá)比較 （n=19）

Tab.2 Comparison of HuR protein,m6A content and TRG-AS1 expression in cancer and adjacent tissues表2癌組織和癌旁組織HuR蛋白、m6A含量和TRG-AS1表達(dá)比較 （n=19）

＊＊P＜0.01。

組別癌旁組織癌組織t HuR蛋白0.42±0.03 1.35±0.21 19.110＊＊m6A含量（%）0.92±0.08 0.31±0.02 32.244＊＊TRG-AS1 1.00±0.00 2.22±0.21 25.323＊＊

2.2 m6A含量、TRG-AS1和HuR蛋白在細(xì)胞中的表達(dá) 與NCM460細(xì)胞比較，HCT116、SW480、LOVO細(xì)胞中HuR蛋白、TRG-AS1表達(dá)升高，m6A含量減少（P＜0.05），且HCT116細(xì)胞中HuR蛋白、TRG-AS1表達(dá)高于SW480、LOVO細(xì)胞，m6A含量低于SW480、LOVO細(xì)胞（P＜0.05），選擇HCT116細(xì)胞為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，見圖2、表3。

2.3 m6A含量、HuR蛋白、TRG-AS1在各組HCT116細(xì)胞中的表達(dá) 與Ct組、OE-NC組比較，OE-HuR組的HCT116細(xì)胞中HuR蛋白、TRG-AS1表達(dá)升高，m6A含量降低（P＜0.05）；與Ct組、si-NC組比較，si-HuR組HCT116細(xì)胞中HuR蛋白、TRG-AS1表達(dá)降低，m6A含量升高（P＜0.05）；與si-HuR組、si-HuR+pcDNA組比較，si-HuR+pcDNA-TRG-AS1組HCT116細(xì)胞中HuR蛋白、m6A含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TRG-AS1表達(dá)升高（P＜0.05），見圖3、表4。

Fig.2 Western blot detection of HuR protein expression in cells圖2 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中HuR蛋白表達(dá)

Tab.3 Comparison of m6A content,HuR protein and TRG-AS1 expression between normal colonic epithelial cells and CRC cells表3正常結(jié)腸上皮細(xì)胞及CRC細(xì)胞m6A含量、HuR蛋白、TRG-AS1表達(dá)比較 （n=6，s）

Tab.3 Comparison of m6A content,HuR protein and TRG-AS1 expression between normal colonic epithelial cells and CRC cells表3正常結(jié)腸上皮細(xì)胞及CRC細(xì)胞m6A含量、HuR蛋白、TRG-AS1表達(dá)比較 （n=6，s）

＊＊P＜0.01；a與NCM460細(xì)胞比較，b與HCT116細(xì)胞比較，P＜0.05。

組別NCM460 HCT116 SW480 LOVO F TRG-AS1 1.00±0.00 2.58±0.24a 2.27±0.22ab 2.04±0.23ab 70.881＊＊HuR 0.36±0.03 1.48±0.23a 1.21±0.20ab 1.01±0.09ab 53.645＊＊m6A含量（%）1.23±0.11 0.27±0.02a 0.38±0.03ab 0.46±0.04ab 305.547＊＊

2.4 過表達(dá)或沉默HuR對(duì)HCT116細(xì)胞增殖、凋亡的影響 與Ct組、OE-NC組比較，OE-HuR組HCT116細(xì)胞OD450值、克隆形成率升高，細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）；與Ct組、si-NC組比較，si-HuR組HCT116細(xì)胞OD450值、克隆形成率降低，細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）；與si-HuR組、si-HuR+pcDNA組比較，si-HuR+pcDNA-TRG-AS1組HCT116細(xì)胞OD450值、克隆形成率升高，細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05），見圖4、5，表5。

Fig.3 Western blot detection of HuR protein expression in HCT116 cells圖3 Western blot檢測(cè)HCT116細(xì)胞中HuR蛋白表達(dá)

Tab.4 Comparison of HuRprotein,m6Acontent and TRGAS1 expression in HCT116 cells between the seven groups表4各組HCT116細(xì)胞中的HuR蛋白、m6A含量、TRG-AS1表達(dá)比較 （n=6）

Tab.4 Comparison of HuRprotein,m6Acontent and TRGAS1 expression in HCT116 cells between the seven groups表4各組HCT116細(xì)胞中的HuR蛋白、m6A含量、TRG-AS1表達(dá)比較 （n=6）

＊＊P＜0.01；a與Ct組比較，b與OE-NC組比較，c與si-NC組比較，d與si-HuR組比較，e與si-HuR+pcDNA組比較，P＜0.05；表5、6同。

組別Ct組OE-NC組OE-HuR組si-NC組si-HuR組si-HuR+pcDNA組si-HuR+pcDNA-TRG-AS1組F HuR 1.46±0.21 1.47±0.22 1.98±0.25ab 1.45±0.22 0.35±0.03ac 0.35±0.04 0.36±0.03 95.617＊＊m6A含量（%）0.28±0.03 0.26±0.02 0.10±0.01ab 0.27±0.01 1.12±0.08ac 1.14±0.09 1.13±0.10 381.869＊＊TRG-AS1 1.00±0.00 1.02±0.08 2.34±0.22ab 1.01±0.09 0.71±0.12ac 0.69±0.13 0.94±0.11de 125.637＊＊

Fig.4 Effects of silencing or overexpression of HuR on HCT116 cell clone formation圖4 沉默或過表達(dá)HuR對(duì)HCT116細(xì)胞克隆形成的影響

Fig.5 Effects of silencing or overexpression of HuR on apoptosis of HCT116 cells detected by Annexin V-FITC/PI double staining圖5 Annexin V-FITC/PI雙重染色檢測(cè)沉默或過表達(dá)HuR對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡的影響

Tab.5 Comparison of OD450 value,clone formation rate and apoptosis rate between different groups of HCT116 cells表5 各組HCT116細(xì)胞OD450值、克隆形成率、細(xì)胞凋亡率比較 （n=6）

Tab.5 Comparison of OD450 value,clone formation rate and apoptosis rate between different groups of HCT116 cells表5 各組HCT116細(xì)胞OD450值、克隆形成率、細(xì)胞凋亡率比較 （n=6）

組別Ct組OE-NC組OE-HuR組si-NC組si-HuR組si-HuR+pcDNA組si-HuR+pcDNA-TRG-AS1組F OD450值0.82±0.08 0.83±0.09 1.25±0.12ab 0.84±0.08 0.32±0.02ac 0.33±0.03 0.69±0.05de 112.818＊＊克隆形成率（%）62.23±5.14 63.15±5.09 83.36±6.05ab 62.78±5.16 26.69±2.44ac 26.75±2.38 48.87±4.12de 126.394＊＊細(xì)胞凋亡率（%）41.27±3.68 42.26±3.71 24.48±2.39ab 42.33±5.08 65.54±5.62ac 64.57±5.41 46.67±3.08de 67.001＊＊

2.5 過表達(dá)或沉默HuR對(duì)HCT116細(xì)胞遷移、侵襲的影響 與Ct組、OE-NC組比較，OE-HuR組HCT116細(xì)胞劃痕愈合率、侵襲細(xì)胞數(shù)目升高（P＜0.05）；與Ct組、si-NC組比較，si-HuR組HCT116細(xì)胞劃痕愈合率、侵襲細(xì)胞數(shù)目降低（P＜0.05）；與si-HuR組、si-HuR+pcDNA組比較，si-HuR+pcDNATRG-AS1組HCT116細(xì)胞劃痕愈合率、侵襲細(xì)胞數(shù)目升高（P＜0.05），見表6，圖6、7。

2.6 過表達(dá)或沉默HuR對(duì)裸鼠體內(nèi)移植瘤生長(zhǎng)的影響 各組間移植瘤質(zhì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=210.787，P＜0.01）。與Ct組（0.28 g±0.02 g）、OE-NC組（0.29 g±0.01 g）比較，OE-HuR組（0.56 g±0.04 g）裸鼠體內(nèi)移植瘤質(zhì)量升高（P＜0.05）；與Ct組、si-NC組（0.30 g±0.03 g）比較，si-HuR組（0.12 g±0.01 g）裸鼠體內(nèi)移植瘤質(zhì)量降低（P＜0.05）；與si-HuR組、si-HuR+pcDNA組（0.13 g±0.01 g）比 較，si-HuR+pcDNA-TRG-AS1組（0.22 g±0.02 g）裸鼠體內(nèi)移植瘤質(zhì)量升高（P＜0.05），見圖8。

Tab.6 Comparison of wound healing rate and the number of invasive cells between different groups of HCT116 cells表6 各組HCT116細(xì)胞劃痕愈合率、侵襲細(xì)胞數(shù)目比較（n=6）

Tab.6 Comparison of wound healing rate and the number of invasive cells between different groups of HCT116 cells表6 各組HCT116細(xì)胞劃痕愈合率、侵襲細(xì)胞數(shù)目比較（n=6）

組別Ct組OE-NC組OE-HuR組si-NC組si-HuR組si-HuR+pcDNA組si-HuR+pcDNA-TRG-AS1組F劃痕愈合率（%）51.17±4.66 51.28±5.02 69.44±6.24ab 51.34±5.13 21.25±2.06ac 21.36±2.09 36.67±3.24de 100.512＊＊侵襲細(xì)胞數(shù)目（個(gè)）74.43±6.25 74.58±6.12 113.35±10.04ab 73.96±6.11 27.75±2.16ac 28.14±2.02 51.14±4.33de 159.505＊＊

2.7 HuR識(shí)別并結(jié)合TRG-AS1上的m6A修飾位點(diǎn) RMVar數(shù)據(jù)庫(kù)（https://rmvar.renlab.org/）提示TRG-AS1上存在潛在的m6A位點(diǎn)，見圖9。MeRIP結(jié)果表明，存在m6A抗體時(shí)能夠富集到大量TRGAS1（18.62±1.03），而對(duì)照IgG富集到極少量TRGAS1（0.25±0.02），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=43.678，P＜0.01），表明TRG-AS1上存在m6A位點(diǎn)。RNA下拉實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TRG-AS1能與HuR蛋白相互作用，見圖10。RIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明IgG蛋白（4.15±0.32）富集到的TRG-AS1明顯低于HuR抗體（23.68±2.11）（t=22.416，P＜0.01）。

Fig.6 The effect of silencing or overexpressing HuR on the migration of HCT116 cells圖6 沉默或過表達(dá)HuR對(duì)HCT116細(xì)胞遷移的影響

3 討論

Fig.7 The effect of silencing or overexpressing HuR on the invasion of HCT116 cells(crystal violet dyeing,×200)圖7 沉默或過表達(dá)HuR對(duì)HCT116細(xì)胞侵襲的影響（結(jié)晶紫染色，×200）

Fig.8 Comparison of tumor quality in each group圖8 各組移植瘤質(zhì)量比較

Fig.9 RMVar database showing potential m6A sites on TRG-AS1圖9 RMVar數(shù)據(jù)庫(kù)顯示TRG-AS1上存在潛在的m6A位點(diǎn)

Fig.10 RNA pull-down experiments showing HuR binds to TRG-AS1圖10 RNA下拉實(shí)驗(yàn)表明HuR與TRG-AS1結(jié)合

m6A修飾是最常見的RNA甲基化事件之一，主要參與mRNA和非編碼RNA的剪接、運(yùn)輸、穩(wěn)定和降解過程［7］。越來越多的證據(jù)表明，m6A修飾在人類不同的癌癥中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。如肝癌組織中m6A含量低于癌旁組織［8］；白血病耐藥細(xì)胞株中m6A含量低于白血病細(xì)胞株［9］，表明m6A修飾在肝癌、白血病等腫瘤中能夠影響腫瘤發(fā)生和病理進(jìn)程。m6A甲基化修飾的識(shí)別蛋白HuR在膠質(zhì)瘤組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，上調(diào)HuR可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡［10］；下調(diào)HuR抑制了肝癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲［11］；低表達(dá)HuR可以抑制胃癌MGC-803細(xì)胞的侵襲、遷移［12］；敲低HuR可以抑制CRC細(xì)胞轉(zhuǎn)移［13］。由此表明HuR在多種腫瘤中具有致癌的作用。本研究結(jié)果與既往研究一致，在CRC組織和細(xì)胞中HuR蛋白高表達(dá)，m6A含量降低，且HCT116細(xì)胞中HuR蛋白表達(dá)量最高，m6A含量最低，因此選擇HCT116細(xì)胞為研究對(duì)象進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)HuR可促進(jìn)HCT116細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及體內(nèi)移植瘤的生長(zhǎng)，抑制細(xì)胞凋亡，降低m6A含量；而沉默HuR則呈相反趨勢(shì)，證實(shí)HuR可通過調(diào)節(jié)m6A含量影響HCT116細(xì)胞惡性生物學(xué)行為。

HuR通過識(shí)別靶基因的m6A位點(diǎn)發(fā)揮其功能［14］。為確認(rèn)HuR下游靶基因，本研究通過生物信息分析顯示TRG-AS1上存在m6A位點(diǎn)。TRG-AS1是一種lncRNA，下調(diào)TRG-AS1抑制舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［15］；過表達(dá)TRG-AS1可促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖［16］；上調(diào)TRG-AS1可促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖和侵襲［17］。以上研究表明TRG-AS1在舌鱗狀細(xì)胞癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、肺癌等腫瘤中發(fā)揮癌基因的作用。而關(guān)于TRGAS1在CRC中的研究鮮有報(bào)道。本研究顯示，TRGAS1在CRC組織和細(xì)胞中高表達(dá)，過表達(dá)HuR后，HCT116細(xì)胞中TRG-AS1表達(dá)升高，m6A含量降低；沉默HuR后，HCT116細(xì)胞中TRG-AS1表達(dá)降低，m6A含量升高；且MeRIP結(jié)果表明TRG-AS1上存在m6A位點(diǎn)，RNA pull-down和RIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TRG-AS1能與HuR蛋白相互作用，推測(cè)沉默HuR可能通過識(shí)別TRG-AS1上的m6A位點(diǎn)來抑制TRGAS1表達(dá)進(jìn)而抑制HCT116細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及體內(nèi)移植瘤的生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。為驗(yàn)證該推測(cè)，本研究在沉默HuR的基礎(chǔ)上增加pcDNA-TRG-AS1來干預(yù)HCT116細(xì)胞，結(jié)果顯示，pcDNA-TRG-AS1減弱了沉默HuR對(duì)HCT116細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及體內(nèi)移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用，以及對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。

綜上所述，沉默HuR可通過抑制TRG-AS1表達(dá)進(jìn)而抑制HCT116細(xì)胞增殖、遷移與侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究將TRG-AS1鑒定為HuR介導(dǎo)的m6A修飾的新型下游效應(yīng)子，證實(shí)了m6A修飾在調(diào)節(jié)lncRNA的生物過程發(fā)生中的關(guān)鍵作用，并表明TRG-AS1可能成為治療CRC的潛在靶點(diǎn)，為CRC進(jìn)展的潛在機(jī)制提供了新線索。