基于SPME-GC-MS和電子鼻分析臭氧- 流態(tài)冰處理對大黃魚風味的影響

劉建華，朱榮榮，曾倩華，唐 煒，丁玉庭

(浙江工業(yè)大學 食品科學與工程學院/浙江省海洋漁業(yè)資源開發(fā)與利用重點實驗室/國家遠洋水產(chǎn)品加工研發(fā)分中心(杭州)， 浙江 杭州 310014)

大黃魚主要分布于南黃海、朝鮮西南岸、東海和瓊州海峽以東的南海北部沿岸，是中國四大商業(yè)魚種之一[1]，是蛋白質和不飽和脂肪酸等優(yōu)質營養(yǎng)物質的來源。大黃魚因其產(chǎn)量高、味道鮮美以及獨特的風味而深受消費者喜愛[2-3]。目前大黃魚傳統(tǒng)的冰鮮方式主要是以片冰、冷海水和冷凍海水將魚體溫度維持在0 ℃左右。近年來，流態(tài)冰在冰溫保鮮領域的應用越來越受到關注，水產(chǎn)品在應用流態(tài)冰保鮮提高新鮮度的同時，還能減少物理損傷[4]。Santiago等[5]、Athina等[6]和Amanda等[7]應用流態(tài)冰保鮮水產(chǎn)品，結果均發(fā)現(xiàn)流態(tài)冰呈現(xiàn)出比傳統(tǒng)片冰更好的抑菌效果，進而延長水產(chǎn)品保質期。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)，臭氧輔助流態(tài)冰保鮮技術能進一步延長水產(chǎn)品的貨架期。Carmen等[8]、Chen等[9]和Agustimi等[10]研究發(fā)現(xiàn)，采用適當質量濃度的臭氧耦合流態(tài)冰處理比單獨使用流態(tài)冰保鮮能更好地抑制腐敗微生物生長，對水產(chǎn)品保鮮保質效果更為顯著。

魚體在死亡后，其內源酶降解、三磷酸腺苷降解、脂肪酸氧化和肌肉變性都會導致腥味物質生成[11]，致使大黃魚新鮮度降低，貨架期縮短。因此，氣味可以作為評價魚類新鮮度的重要指標之一[12]。通過頂空固相微萃取結合氣相色譜- 質譜聯(lián)用(SPME-GC-MS)技術和電子鼻分析可以鑒別不同含量的臭氧、流態(tài)冰耦合處理條件下的魚體揮發(fā)性風味物質變化。SPME-GC-MS廣泛應用于食品中揮發(fā)性成分的測定，可以準確定量分析揮發(fā)性風味物質，具有靈敏度高、抗干擾能力強等優(yōu)點[13]。電子鼻技術通過模擬人體嗅覺系統(tǒng)，以傳感器來對氣味進行客觀判別，能對整體風味物質進行有效區(qū)分[14]。因此，二者結合可以全面分析揮發(fā)性風味物質[15]，且該方法已經(jīng)廣泛應用于食品中不同揮發(fā)性風味物質的鑒別[16]。Chen等[17]采用電子鼻分析出生羅非魚和熱加工羅非魚肌肉中的氧化物香味差異，并用SPME-GC-MS技術在羅非魚肌肉中鑒定出43種揮發(fā)性有機化合物，如醛、酮、醇等。Ding等[18]也用該技術檢測了3種淡水魚魚露中的揮發(fā)性風味物質，其中，SPME-GC-MS技術檢測到71種揮發(fā)性風味物質，主要為醛類、醇類、醚類，且電子鼻分析顯示不同魚制備的魚露風味特征有顯著性差異。

目前對臭氧- 流態(tài)冰(ozone-ice slurry，O-IS)耦合技術的研究主要集中在大黃魚肌肉品質、生化特性上[19]，關于臭氧- 流態(tài)冰對水產(chǎn)品風味作用的研究較少。因此，本研究通過SPME-GC-MS結合電子鼻技術，檢測經(jīng)不同質量濃度臭氧-流態(tài)冰處理后的大黃魚優(yōu)級品貨架期內揮發(fā)性風味物質的變化，以期為臭氧- 流態(tài)冰耦合技術應用于大黃魚保鮮提供理論支撐和技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活大黃魚，購于浙江杭州朝暉六區(qū)農(nóng)貿市場。

氯化鈉(分析純)、溴甲酚綠(生物技術級)、甲基紅(酸堿指示劑級)、氧化鎂(分析純，≥98.5%)、硼酸(優(yōu)級純)、2,4,6-三甲基吡啶(98%)、鹽酸(分析純,36%～38%)、95乙醇(優(yōu)級純)、碘化鉀(優(yōu)級純,≥99.5%)、硫代硫酸鈉(99%)，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

RF- 2.5T/SW型海水流態(tài)冰機(2.50 m3/d)，南通瑞友工貿有限公司；KT- OZ- 10G型臭氧發(fā)生器，上?？堤丨h(huán)保有限公司；IMS- 40型碎冰機，常熟雪科有限公司；K9840型自動凱氏定氮儀，濟南海能儀器股份公司；e2695型高效液相色譜儀，美國Waters公司；SuperNose- 14- ISENSO型電子鼻，上海瑞玢智能科技有限公司。GC- MS- 7890A型氣質聯(lián)用儀，美國安捷倫公司。

1.3 實驗方法

1.3.1樣品制備

鮮活大黃魚購買后于15 min之內運回實驗室，用清水沖洗后切成3 cm×5 cm×2 cm左右的魚塊，平均分成5組。實驗中碎冰由碎冰機制備，體系溫度為-0.20 ℃；流態(tài)冰由海水流態(tài)冰機制備，工作液為NaCl質量分數(shù)3.50%的鹽水，調節(jié)流量使體系含微粒冰60%、含水40%，體系終溫為-2.00 ℃；臭氧- 流態(tài)冰制備需要將臭氧發(fā)生器制備的臭氧通入海水流態(tài)冰工作液中，通過控制通入臭氧的時間與流量，最后制得質量濃度為1、3、5 mg/L臭氧- 流態(tài)冰。將分好的5組鮮活大黃魚魚塊樣品以1∶1的體積比例，按照層魚層冰的方式分別放置于不同質量濃度的臭氧- 流態(tài)冰中，且樣品與碎冰及冰漿直接接觸，并包裝于聚苯乙烯泡沫箱中，4 ℃冰箱貯藏備用。

1.3.2揮發(fā)性鹽基氮測定

揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)根據(jù)GB 5009.228—2016方法進行測定。

1.3.3SPME-GC-MS分析

稱取優(yōu)級品鮮度范圍內的大黃魚背部肌肉3.00 g絞碎，其中傳統(tǒng)碎冰(FI)組在第5天取樣， 流態(tài)冰(IS)組在第17天取樣，3個O-IS組在第18天取樣。加入6.00 mL氯化鈉溶液(0.36 g/mL)于15 mL螺紋口樣品瓶中，旋緊蓋，放入50 ℃恒溫箱中恒溫30 min。將老化后的萃取頭(65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯)插入樣品瓶中，推出纖維頭，于60 ℃水浴中吸附30 min后取下，插入氣質聯(lián)用儀進行測定。色譜條件：DB-5MS彈性毛細管柱(60.00 m×0.32 mm×1.00 μm)，不分流模式。起始溫度40 ℃，以5 ℃/min 升至100 ℃，以2 ℃/min升至180 ℃，以5 ℃/min升至240 ℃，保留5.00 min。載氣為氦氣，流量1.20 mL/min，進樣口溫度250 ℃。質譜條件：電子轟擊離子源，電子能量70 eV，離子源溫度220 ℃，傳輸線溫度240 ℃，質量掃描范圍35～450 Da。揮發(fā)性物質定性方法：通過GC-MS分離獲得揮發(fā)性風味化合物的譜圖與NIST2008譜庫和Wiley數(shù)據(jù)庫譜圖進行比對，僅報道正反匹配度均大于80(最大值為100)的結果。揮發(fā)性物質的相對含量計算為某個峰的峰面積與總峰面積比值的百分數(shù)。揮發(fā)性物質定量方法：內標物為2, 4, 6-三甲基吡啶(trimethylpyridine, TMP)，溶解于甲醇中得到10.00 g/L的標準母液。TMP標準母液進一步用純水稀釋得到10.00 mg/kg TMP工作液。將40.00 μL TMP工作液加入6.00 g魚肉樣品中，立即密封進行魚肉樣品萃取過程。

1.3.4電子鼻分析

對應1.3.3的取樣時間，每組樣品稱取20.00 g進行檢測。將樣品放置于40 mL頂空進樣樣品瓶中，旋上瓶蓋，靜置30 min，采用頂空進樣方式進行檢測。電子鼻程序設置為載氣流速1.00 L/min，清洗流量2.00 L/min，等待時間25 s，本實驗使用設備自帶WinMuster軟件進行分析。各傳感器對應性能如表1。

表1 電子鼻傳感器對應物質類別Tab.1 Corresponding substance category of electronic nose sensor

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 9.0軟件及Excel 2010軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析與繪圖，用電子鼻中自帶的WinMuster軟件對不同貯藏時間的揮發(fā)性氣味進行分析。每組樣品做3次平行實驗，結果采用平均值±標準差表示。

2 結果與討論

2.1 O-IS貯藏對大黃魚TVB-N的影響

蛋白質在酶和細菌的作用下分解生成氨以及胺類等堿性含氮揮發(fā)性化合物，TVB-N值通過測定總氮含量的變化作為評價水產(chǎn)品鮮度的重要指標。GB/T 18108—2019《鮮海水魚通則》規(guī)定TVB-N值≤15 mg/100 g時，魚肉屬于優(yōu)級品。圖1顯示了不同質量濃度O-IS貯藏對大黃魚TVB-N值的影響。可以看出，在大黃魚的貯藏過程中，對照FI組僅能將大黃魚優(yōu)級品貨架期維持在5 d，而不同質量濃度O-IS處理的大黃魚優(yōu)級品貨架期被延長。其中IS處理組的大黃魚優(yōu)級品貨架期被延長至15 d，其余3個O-IS組大黃魚的優(yōu)級品貨架期延長至18 d。說明相較于FI，O-IS憑借其較高的預冷速度和低溫有效抑制腐敗微生物和初期自溶階段內源酶的分解作用，減少小分子胺類物質的產(chǎn)生，進而更高效地維持大黃魚的新鮮度，延長其貨架期。并且O-IS的臭氧質量濃度越高，殺滅微生物以及使內源酶失活的能力就越強。

圖1 不同質量濃度臭氧- 流態(tài)冰貯藏對大黃魚TVB-N的影響Fig.1 Effects of different ozone concentrations in iceslurry on TVB-N in Pseudosciaena crocea

2.2 O-IS貯藏對大黃魚揮發(fā)性成分的影響

2.2.1揮發(fā)性風味物質分析

經(jīng)SPME-GC-MS檢測大黃魚的揮發(fā)性風味物質，分析匹配度大于80%的風味成分，其中具有風味特征的揮發(fā)性物質結果見表2。大黃魚中主要揮發(fā)性成分為醛類、醇類、酮類、酯類、烴類及其他化合物和含氮及雜環(huán)類，揮發(fā)性成分種類及相對含量變化見表3。由表3可知，新鮮組樣品中共檢出揮發(fā)性風味物質34種，IF組中檢出28種，IS組與1.00 mg/L O-IS組中均檢出29種，3.00 mg/L O-IS組和5.00 mg/L O-IS組檢出揮發(fā)性風味物質24種。其中醛類、醇類和烴類物質檢出的種類較多。

表2 不同質量濃度臭氧- 流態(tài)冰處理的優(yōu)品級大黃魚揮發(fā)性成分變化Tab.2 Changes in volatile components of Pseudosciaena crocea of excellent grade treated with different ozone concentration in ice slurry

表3 優(yōu)品級大黃魚揮發(fā)性成分種類及相對含量變化Tab.3 Changes in types and relative contents of volatile components of Pseudosciaena crocea of excellent grade

魚腥味物質主要為羰基類化合物等二級脂肪氧化產(chǎn)物，在貯藏過程中由魚體內大量的不飽和脂肪酸酶促氧化或自動氧化等途徑產(chǎn)生。羰基類化合物主要是醛類和酮類。研究表明，飽和的直鏈醛、低級醛閾值較低且是魚體風味的重要影響因素。由表2、表3可知，在新鮮的大黃魚上檢出10種揮發(fā)性醛類物質，其中己醛、庚醛、壬醛和(E,E)-2,4-庚二烯醛總量占比較大，而己醛、壬醛、癸醛是公認的魚腥味物質。FI組、IS組、1 mg/L O-IS組、3 mg/L O-IS組和5 mg/L O-IS組檢出的醛類物質分別為9、7、7、5、5種。隨著臭氧質量濃度的升高，醛類揮發(fā)性物質種類在減少，具有腥味特征的醛類物質含量也降低，表明O-IS耦合處理可以很好地抑制魚體腥味生成。酮類物質主要呈現(xiàn)桉葉味、脂肪味和焦燃味，可增加腥味，其閾值遠高于醛類。但是檢出的酮類物質3,5-辛二烯-2-酮，可以與醛類等物質相互作用對腥味物質產(chǎn)生增強或改變的效果[22]。

魚體中的醇類物質是脂肪酸衍生物及羰基化合物的還原產(chǎn)物，不飽和醇和長鏈醇能夠產(chǎn)生土腥味及一些金屬性氣味，對風味的影響更為顯著，其中1-辛醇是土腥味的標志性物質[23]。由表2可知，1-辛醇是醇類物質中含量最高的，且隨著臭氧質量濃度的升高有所降低；但是從表3來看，醇類物質的檢出種類及相對含量在各組之間整體變化不大，說明O-IS處理對揮發(fā)性醇類物質影響較小。值得一提的是，1-辛烯-3-醇是大黃魚重要的腥味物質之一，并且與脂肪氧化產(chǎn)物高度相關[24]，在表2中1-辛烯-3-醇的含量隨臭氧質量濃度升高而升高，是因為O-IS耦合處理的氧化作用以及大黃魚貯藏過程中的自身氧化，致使大黃魚中硫代巴比妥酸值升高。

烴類化合物主要來自脂肪酸烷基自由基的均裂，其閾值較高，所以對魚體風味物質影響不大，但是魚體中的烯烴經(jīng)反應可轉變?yōu)槿╊惢蛘咄愇镔|增強魚體風味[12]。大黃魚中還檢出了二丁基羥基甲苯，它一般是由脂類氧化分解代謝產(chǎn)生，反映了脂肪的氧化程度，而該物質含量變化趨勢與臭氧質量濃度正相關，此趨勢與1-辛烯-3-醇變化規(guī)律相吻合。

本研究表明，O-IS耦合處理對優(yōu)級品貨架期內的大黃魚醛類物質含量升高有抑制作用。這是因為冰漿的兩相特性使細小的冰晶顆粒覆蓋在魚體上方，很好地阻隔了大黃魚與空氣接觸，降低脂肪氧化程度減少醛類物質生成。貯藏加工過程中，生物酶降解及微生物生長也可產(chǎn)生腥味物質。O-IS耦合處理能進一步抑制生物酶的活性以及微生物生長。醛類物質溶于水的特性致使其在冰漿的更換過程中會被除去。因此，O-IS耦合處理可以起到降低大黃魚腥味的作用。但是由于臭氧的氧化作用，較高濃度的臭氧會促進脂肪氧化，尤其結合1-辛烯-3-醇和二丁基羥基甲苯含量來看，1 mg/L O-IS組大黃魚腥味物質被較好地降解。

2.2.2香氣活度值分析

風味物質的特征是由揮發(fā)性風味物質在風味體系中的濃度及其感覺閾值共同決定，因此可以通過香氣活度值(OAV)判斷不同O-IS耦合處理下的大黃魚中主體風味物質[25]。通過OAV確定新鮮大黃魚中壬醛、1-辛烯-3-醇、辛醛和己醛(OAV>1)這4種物質是關鍵風味物質(表2)；庚醛、癸醛、十四碳醛、1-辛醇和(E，E)-2，4-庚二烯醛對整體風味起到修飾作用(0.1

2.3 電子鼻檢測結果分析

2.3.1主成分分析

電子鼻模擬人的嗅覺S系統(tǒng)，內置14個傳感器，由于每個傳感器對不同氣味的敏感程度不同，電子鼻的傳感器載荷分析能夠通過相應圖譜有效反映某個傳感器對樣品整體信息的貢獻率大小。不同O-IS處理后大黃魚的電子鼻分析結果見圖2。紅色五角星代表電子鼻的傳感器標記，各種顏色圓點代表輸入的 Y 數(shù)據(jù)。距離越近就認為它們之間的相關性比較大。主成分PC1的貢獻率為45.18%，傳感器S9、S1和S2主要是反映醇類、烴類和醛類貢獻，且其主成分占比與含量呈正相關，而這3種物質是魚體腥味的主要組成部分。因此，由圖2可知，1、3、5 mg/L O-IS組中的腥味物質對大黃魚呈味貢獻低于IF組和新鮮組，所以，O-IS耦合處理技術能夠有效降低大黃魚中腥味物質。主成分PC2的貢獻率為35.76%，傳感器S4和S8對第二主成分貢獻率最大，即對硫化物和短鏈烷烴有選擇性，但是這2種揮發(fā)性物質對腥味貢獻較低，所以1、3 mg/L O-IS組的大黃魚腥味物質含量少于其他處理組；與風味物質分析中醛類、醇類和烴類物質是關鍵風味物質的結果吻合。傳感器S5、S6和S11位于第三象限與主成分PC1和PC2呈負相關，其中S6對應的有機胺、苯酮醇醛是主要腥味物質。而PC3與PC4兩者總貢獻率小于9.06%，且新鮮組與S5、S6和S11距離最近，同樣說明O-IS組的腥味物質被降解。O-IS耦合處理技術可以降低大黃魚中腥味物質含量，且1、3 mg/L O-IS的處理條件更具優(yōu)勢。

001～005為每組樣品的5次平行實驗結果。圖3 不同質量濃度臭氧- 流態(tài)冰貯藏的大黃魚主成分降維結果分析Fig.3 Analysis of reduced dimensional results of principal components of Pseudosciaena crocea stored in ozone-ice slurry with different ozone concentrations

PCA將電子鼻的14個傳感器提取的樣品信息進行數(shù)據(jù)轉換和降維處理，并對處理結果進行線性分類，最后在坐標軸上形成一個二維散點圖，從而快速歸納解釋樣品整體信息[27]。一般情況下，PCA分析兩主成分總貢獻率達到70%～85%，由于高貢獻率與主成分反映的原始多指標信息呈正相關[28]，所以分析方法可使用。PCA分析結果見圖3。由圖3可知，F(xiàn)I組與其余樣品距離較遠，表明FI組氣味和其他樣品氣味差異較大。不同處理組的魚塊與新鮮魚塊均存在一定距離，但新鮮組與1 mg/L O-IS組存在重疊區(qū)域，說明使用1 mg/L O-IS 貯藏的大黃魚與新鮮大黃魚最接近，該條件下保鮮效果最好。IS組與其他O-IS組距離最大，說明IS組大黃魚新鮮度與其他O-IS組大黃魚新鮮度差異最明顯。5 mg/L O-IS組與3 mg/L O-IS組有較小重疊區(qū)域，說明這2個處理組大黃魚魚塊的新鮮度差異較小。結果表明，1 mg/L O-IS組在降低大黃魚腥味物質方面效果最顯著，且與揮發(fā)性風味物質中醛類物質含量變化相吻合。

2.3.2判別函數(shù)分析

判別函數(shù)分析(LDA)又稱分辨法，是在分類確定的條件下，根據(jù)某一研究對象的各種特征值判別其類型歸屬問題的一種多變量統(tǒng)計分析方法。LDA具有分類效果好、易實現(xiàn)等優(yōu)點，通?？膳cPCA法同時使用，以達到更好的分析效果[29]。

001～005為每組樣品的5次平行實驗結果。圖4 不同質量濃度臭氧- 流態(tài)冰貯藏的大黃魚判別函數(shù)分析Fig.4 LDA of Pseudosciaena crocea stored in ozone-ice slurry with different ozone concentrations

LDA分析法通過將高維度的原始數(shù)據(jù)信息通過數(shù)學運算法則映射投影到低維度方向，對原始數(shù)據(jù)進行壓縮處理，再對樣品組間點分布狀態(tài)與組類間分布距離進行分析，可使組間變異與組類變異比率達到最大[30]。LDA分析結果見圖4。由圖4可知，主成分1、主成分2及主成分3的總貢獻率為99.74%，大于75.00%，可以代表樣品大部分信息。且不同處理組的魚塊在響應值區(qū)域間距離明顯，表明在大黃魚優(yōu)級品貨架期內，利用LDA分析法能夠區(qū)分不同處理組的新鮮度，且能證明各組魚塊的新鮮度差異顯著(P<0.05)。其中FI組的大黃魚魚塊響應值區(qū)間距離新鮮組最遠，結合PC1分析可得出FI組中大黃魚魚塊腥味含量最高，風味品質降低。除此之外，1 mg/L O-IS組的大黃魚魚塊相應區(qū)間也相距新鮮組較遠，結合GC-MS中OAV分析，1-丁烯-3-醇作為最重要的風味物質，在1 mg/L O-IS組中含量降低，說明1 mg/L O-IS組處理條件對魚塊中腥味物質降解效果最顯著。

2.3.3分類模型分析

001～005為每組樣品的5次平行實驗結果。圖5 PCA-SVM分類模型建立Fig.5 Establishment of PCA-SVM classification model

利用PCA-SVM支持向量機分類模型算法對不同新鮮度的大黃魚樣品進行分類模型建立，最終得到樣品分類模型(圖5)。根據(jù)圖6模型準確度分析可知，該模型準確度為0.944 4(越接近1表示準確度越高，1代表分類完全準確)。這說明本分類模型可以明確區(qū)分出不同新鮮度的大黃魚，利用該模型，可對未知大黃魚的新鮮度進行預測。

圖6 PCA-SVM混淆矩陣Fig.6 PCA-SVM confusion matrix

3 結 論

本研究采用SPME-GC-MS結合電子鼻技術比較了不同質量濃度臭氧- 流態(tài)冰耦合處理對大黃魚優(yōu)級品鮮度貨架期內揮發(fā)性風味物質的影響。由TVB-N分析可知，相比較傳統(tǒng)碎冰，O-IS耦合技術將大黃魚優(yōu)級品貨架期由5 d延長至18 d，其中臭氧質量濃度對于優(yōu)級品貨架期無明顯影響。SPME-GC-MS分析得出，O-IS耦合處理可以降低醛類物質含量，且臭氧質量濃度越大消降作用越明顯。但是從1-辛烯-3-醇來看，臭氧質量濃度增加會致使大黃魚氧化現(xiàn)象加重。因此，結合TVB-N結果來看，臭氧質量濃度為1 mg/L時與流態(tài)冰耦合處理對魚體腥味物質的消降效果最好。此外，由電子鼻PCA分析和LAD分析可知，揮發(fā)性風味物質較易被傳感器識別，同樣得出，揮發(fā)性腥味物質在O-IS耦合處理組中不占據(jù)主要貢獻地位。本研究結果表明：1 mg/L O-IS耦合處理大黃魚可以延長大黃魚優(yōu)級品鮮度貨架期，并且能夠明顯降低大黃魚腥味物質含量。本研究旨在為臭氧- 流態(tài)冰耦合技術在大黃魚保鮮過程中品質控制的應用提供參考。