棉籽蛋白ACE抑制肽的酶法制備及其體外穩(wěn)定性研究

常 暢，劉治平，陳哲漪，閆巧娟，江正強(qiáng),*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院/中國輕工業(yè)食品生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100083；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院， 北京 100083)

高血壓是引發(fā)冠心病和腦出血等重大疾病的主要因素，全球約有11.3億人患有高血壓病。2019年，全球由高血壓及其并發(fā)癥導(dǎo)致的死亡人數(shù)高達(dá)1 080萬[1]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin-I-converting enzyme, ACE)是促使人體血壓升高的重要分子[2]，化學(xué)合成ACE抑制劑(卡托普利、賴諾普利)是臨床治療高血壓的主要藥物，但伴有竇性心動過速和血管神經(jīng)性水腫等不良反應(yīng)，長期服用會對患者造成嚴(yán)重的身體和精神負(fù)擔(dān)[3]。食源性ACE抑制肽因安全性高、易吸收、無過度降壓危險(xiǎn)而備受關(guān)注[4]。圍繞ACE抑制肽的制備方法、降壓機(jī)理和構(gòu)效關(guān)系等方面已有大量研究[5]，但相關(guān)產(chǎn)品不多。源于酪蛋白的纈氨酸- 脯氨酸- 脯氨酸和異亮氨酸- 脯氨酸- 脯氨酸是目前應(yīng)用最多的ACE抑制肽，如日本生產(chǎn)的乳酸菌飲料、芬蘭生產(chǎn)的發(fā)酵乳品以及荷蘭生產(chǎn)的功能性水溶粉劑，以及美國和法國生產(chǎn)的鰹魚肽片劑和膠囊。除酪蛋白肽和鰹魚肽外，其他食源性ACE抑制肽仍處于研究階段，尚未實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。

我國棉籽產(chǎn)量居世界第一，提油后的棉籽粕蛋白質(zhì)含量高達(dá)60%，高于大豆粕的蛋白質(zhì)含量。棉籽蛋白的主要成分是球蛋白(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90%)，包括2S(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%)、7S和12S(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%)球蛋白。棉籽蛋白質(zhì)量近似于豆類蛋白，營養(yǎng)價(jià)值高于谷物蛋白[6]。de Oliveira Filho等[7]通過熱處理協(xié)同蛋白酶水解制備的棉籽蛋白水解物具有抗氧化和ACE抑制活性，其中，堿性蛋白酶水解物的ACE抑制率高達(dá)99.5%。Gao等[8]利用單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化木瓜蛋白酶水解條件，制備的FPAIGMK(IC50=38.9 μmol/L)是迄今報(bào)道的活性最高的棉籽蛋白ACE抑制肽。目前，酶法制備棉籽蛋白ACE抑制肽的研究較多，但其抑制活性有待進(jìn)一步提高，且尚未見評價(jià)棉籽蛋白水解物及其ACE抑制肽的消化吸收穩(wěn)定性的研究。食源性ACE抑制肽經(jīng)口服后需通過胃腸道消化降解、小腸上皮吸收滲透等多重生理屏障，而這些生理屏障會導(dǎo)致活性肽體內(nèi)穩(wěn)定性降低，限制人體對活性肽的有效生物利用。研究ACE抑制肽的消化吸收穩(wěn)定性對于推動活性肽在功能性食品中的應(yīng)用具有重要作用。

本研究以脫酚棉籽蛋白為原料，擬利用不同蛋白酶水解制備ACE抑制肽并優(yōu)化其水解條件，通過分離純化和質(zhì)譜鑒定，挖掘具有ACE抑制活性的新型肽段，探究其體外消化吸收穩(wěn)定性，以期為活性肽體內(nèi)吸收的基礎(chǔ)研究和棉籽蛋白在功能性降壓食品中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫酚棉籽蛋白(總蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為74.8%)，北京中棉紫光生物科技有限公司；Caco-2細(xì)胞株，中國科學(xué)院細(xì)胞庫；堿性蛋白酶(Alcalase 2.4L，來源于地衣芽孢桿菌)、復(fù)合蛋白酶(來源于芽孢桿菌屬)、風(fēng)味蛋白酶(來源于米曲霉)，丹麥Novozymes公司；木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶，上海源葉生物科技有限公司；L-酪氨酸、福林酚、ACE、馬尿酰- 組氨酰- 亮氨酸(N-hippuryl-His-Leu hydrate，HHL)、鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde, OPA)、胎牛血清、Dulbecco’s modification of eagle’s medium(DMEM)培養(yǎng)基，美國Sigma-Aldrich公司；鹽酸、氫氧化鈉、乙酸乙酯、四硼酸鈉、氯化鈉、硼酸、碳酸鈉、異丙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、甲醇、甲酸、乙腈等化學(xué)試劑均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

pH計(jì)，德國賽德利斯北京有限公司；TU- 1901型分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；LGJ- 10型冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；UPC- 900KTA型蛋白純化系統(tǒng)，美國GE Healthcare公司；Acquity nano型高效液相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Waters公司；HH- 1型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州榮華儀器制造有限公司；QP- 50型生物培養(yǎng)箱，山東博科集團(tuán)；TD6M型高速離心機(jī)，長沙平凡儀器儀表有限公司；EVOM2型電阻儀、Transwell型培養(yǎng)板(孔徑0.4 μm、膜面積1.12 cm2、12孔的聚酯膜)，美國Millipore公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1不同蛋白酶水解棉籽蛋白條件的優(yōu)化

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的棉籽蛋白溶液(pH值為7.0)，分別加入1 500 U/g堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶，調(diào)節(jié)酶解反應(yīng)體系至不同蛋白酶的最適pH值和溫度(表1)。搖床振蕩(200 r/min)酶解6 h后，100 ℃水浴加熱5 min滅酶，冷卻后離心(10 000 r/min，5 min)取上清液，真空冷凍干燥，-20 ℃保存。以水解度、蛋白回收率和ACE抑制率為評價(jià)指標(biāo)，確定最適蛋白酶。

表1 不同蛋白酶的最適水解條件Tab.1 Optimal hydrolysis conditions of different proteases

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的棉籽蛋白溶液(pH值8.0)，最適蛋白酶加酶量為1 500 U/g，50 ℃分別水解1～6 h，探究水解時(shí)間對蛋白回收率和ACE抑制率的影響。再配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的棉籽蛋白溶液(pH值8.0)，最適蛋白酶加酶量為750～3 000 U/g，50 ℃水解5 h，探討加酶量對蛋白回收率和ACE抑制率的影響。

1.3.2水解度和蛋白回收率的測定

采用OPA法測定水解度(DH)。取400 μL棉籽蛋白水解液(質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL)加入3 mL OPA試劑，反應(yīng)2 min，在340 nm處測定吸光值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：取0～400 μL絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)液(質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL)于5 mL試管中，去離子水補(bǔ)足體積至400 μL，加入3 mL OPA試劑，反應(yīng)2 min，在340 nm處測定吸光值，利用吸光值與絲氨酸濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。水解度的計(jì)算方法見式(1)。

(1)

式(1)中，htot是原料蛋白肽鍵的質(zhì)量摩爾濃度，mmol/g(棉籽蛋白的htot為7.54 mmol/g)；h是水解蛋白相對于原料蛋白的被水解肽鍵的質(zhì)量摩爾濃度，mmol/g。

采用微量凱氏定氮法，分別測定水解前的總蛋白質(zhì)含量和水解后的蛋白質(zhì)含量，計(jì)算棉籽蛋白水解物的蛋白回收率，計(jì)算方法見式(2)。

(2)

式(2)中，m1為水解物中蛋白質(zhì)質(zhì)量，mg；m2為原料總蛋白質(zhì)質(zhì)量，mg。

1.3.3ACE抑制活性的測定

采用HHL方法測定ACE抑制率[9]。將HHL溶于50 mmol/L硼酸鹽緩沖液(含300 mmol/L NaCl、pH值8.3)，制得5 mmol/L HHL溶液。取20 μL棉籽蛋白水解物溶液(質(zhì)量濃度為2 mg/mL)與120 μL HHL溶液混合，再加入10 μL ACE溶液(0.1 U/mL)，在37 ℃反應(yīng)60 min。加入150 μL鹽酸(1 mmol/L)終止反應(yīng)，然后加入1 mL乙酸乙酯充分振蕩萃取10 s后，在10 000 r/min下離心5 min，收集酯層750 μL烘干。冷卻后加入500 μL去離子水溶解殘?jiān)?，采用紫外分光光度?jì)測定228 nm處的吸光值。以20 μL硼酸鹽緩沖液替代棉籽蛋白水解物溶液，作為空白對照。在反應(yīng)前，加入150 μL鹽酸(1 mmol/L)滅活A(yù)CE，作為陽性對照。利用樣品吸光值(Aa)、空白對照吸光值(Ab)和陽性對照吸光值(Ac)，計(jì)算ACE抑制率，見式(3)。

(3)

將樣品溶液稀釋至不同濃度，測定ACE抑制率，以ACE抑制率為縱坐標(biāo)，樣品濃度的log值為橫坐標(biāo)，利用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行非線性擬合計(jì)算半抑制濃度(IC50)。

1.3.4棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物的分離和鑒定

采用快速蛋白液相色譜(fast protein liquid chromatography, FPLC)聯(lián)用KTA純化系統(tǒng)，以Sephadex G- 15型(100 cm×12 mm)層析柱，分離50 mg/mL棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物。分離前，采用0.22 μm微濾膜除雜。上樣量為1.5 mL，洗脫液為磷酸緩沖液(10 mmol/L、pH值7.0)，洗脫速度為0.8 mL/min，紫外檢測波長為280 nm，收集洗脫液，冷凍干燥，測定ACE抑制活性。

利用納米高效液相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用儀，鑒定具有較高ACE抑制活性水解組分的序列組成，色譜柱為Thermo Acclaim PepMap C18型柱(75 mm×2 mm, 3 μm)。將水解組分(質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL)溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸水溶液，上樣量7 μL。以含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%甲酸的乙腈溶液為洗脫液，以1 mL/min的速度在65 min內(nèi)進(jìn)行梯度洗脫(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%～35%)，通過PEAKS Studio軟件分析肽序列。利用AHTpin數(shù)據(jù)庫挑選ACE抑制肽進(jìn)行合成(國肽生物科技有限公司)，測定ACE抑制活性。

1.3.5體外消化吸收穩(wěn)定性的測定

將2 g NaCl和7 mL體積分?jǐn)?shù)為36%的鹽酸溶于去離子水，定容至1 000 mL后，加入3.2 g胃蛋白酶制備胃液(pH值為1.2)。將6.8 g磷酸二氫鉀和77 mL 0.2 mol/L氫氧化鈉溶于750 mL去離子水，加入10 g胰蛋白酶，并用0.1 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至6.8，定容至1 000 mL制備腸液。將棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%)溶于胃液，在37 ℃消化1.5 h，加熱至100 ℃滅酶10 min，冷卻后離心(10 000 r/min)10 min取上清液，測定ACE抑制率。取10 mL離心前的胃液樣品，將pH值調(diào)節(jié)至6.8，加入10 mL腸液，在37 ℃消化3 h，加熱至100 ℃滅酶10 min，冷卻后離心(10 000 r/min)10 min取上清液，測定ACE抑制率。

將Caco-2細(xì)胞接種于25 cm2卡式培養(yǎng)瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為1%的DMEM培養(yǎng)液(含有100 U/mL青霉素和鏈霉素)、10%的胎牛血清、1%的L-谷氨酰胺和1%的非必需氨基酸，在37 ℃、95%相對濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí)，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度以3×105個(gè)/mL接種于12孔Transwell板的濾膜上。在Transwell板的上室和下室中分別加入0.5 mL細(xì)胞懸液和1.5 mL DMEM培養(yǎng)液。培養(yǎng)21 d，利用細(xì)胞電阻電壓歐姆儀測定跨膜單層細(xì)胞電阻值(transepithelial electrical resistance, TEER)，明確Caco-2細(xì)胞單層膜的緊密性和完整性[10]。分別在Caco-2細(xì)胞單層膜的刷狀緣膜(AP)側(cè)和基底膜(BP)側(cè)加入HBSS(Hank’s balanced salt solution)緩沖液0.5 mL和1.5 mL，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)證實(shí)棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物在質(zhì)量濃度為0.4～2.0 mg/mL時(shí)，未對Caco-2細(xì)胞顯示出細(xì)胞毒性(圖1)。因此，AP側(cè)加入0.5 mL含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1～2 mg/mL棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物的HBSS緩沖液，BP側(cè)加入1.5 mL空白HBSS緩沖液。在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，取BP側(cè)培養(yǎng)液測定ACE抑制率。以未加入棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物的樣品作為空白對照。

圖1 棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物對Caco-2細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effect of cottonseed protein hydrolysate prepared by protamex on cell viability of Caco-2 cells

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用IBM SPSS 22.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用一維方差分析(One-Way ANOVA)中的Tukey’s多重比較進(jìn)行顯著性分析，P<0.05表示數(shù)據(jù)具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉籽蛋白的酶解條件優(yōu)化結(jié)果

不同蛋白酶水解棉籽蛋白制備ACE抑制肽的結(jié)果如表2。由表2可知，在同等酶活力下，不同蛋白酶水解棉籽蛋白的能力具有顯著性差異(P<0.05)。棉籽蛋白水解物的ACE抑制率顯著高于未經(jīng)水解的棉籽蛋白ACE抑制率(15.0%)。風(fēng)味蛋白酶水解物的水解度(55.6%)和蛋白回收率(43.9%)顯著高于其他蛋白酶水解物，但其ACE抑制率較低(47.1%)。木瓜蛋白酶水解物的水解度(33.3%)和蛋白回收率(17.8%)較低，但其ACE抑制率卻處于較高水平(70.7%)。復(fù)合蛋白酶水解物的ACE抑制率最高(85.7%)，水解度(32.5%)和蛋白回收率(40.6%)也處于較高水平。因此，選用復(fù)合蛋白酶水解棉籽蛋白制備ACE抑制肽。進(jìn)一步優(yōu)化復(fù)合蛋白酶水解時(shí)間和加酶量，結(jié)果如圖2。由圖2(a)可知，隨著水解時(shí)間的延長，蛋白回收率緩慢增加，而ACE抑制率在1～5 h內(nèi)不斷升高，在5 h時(shí)達(dá)到最大值，隨后略微降低。當(dāng)加酶量不斷增加時(shí)，蛋白回收率不斷升高，但ACE抑制率先升高后降低。當(dāng)復(fù)合蛋白酶加酶量為1 500 U/g，水解pH值為8.0，溫度為55 ℃，水解時(shí)間為5 h時(shí)，ACE抑制率最高，為93.7%，蛋白回收率為39.8%[圖2(b)]。因此，在復(fù)合蛋白酶的最適pH值和溫度下，加酶量為1500 U/g，水解棉籽蛋白5 h，棉籽蛋白水解物(質(zhì)量濃度為2 mg/mL)的ACE抑制率為93.7%。

表2 棉籽蛋白不同蛋白酶水解物的水解度、蛋白回收率和ACE抑制率Tab.2 Effects of proteases on degree of hydrolysis, protein recovery rate, and ACE inhibitory activity of cottonseed protein hydrolysates

圖2 復(fù)合蛋白酶水解時(shí)間和加酶量對棉籽蛋白水解物的蛋白回收率和ACE抑制率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time and protamex concentration on protein recovery rate and ACE inhibitory activity of cottonseed protein hydrolysates

本研究中，復(fù)合蛋白酶水解物的ACE抑制率高于de Oliveira Filho等[7]和Gao等[11]研究中木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶水解棉籽蛋白的ACE抑制率(55%～74%)。風(fēng)味蛋白酶具有內(nèi)切酶和外切酶的作用特性，酶切位點(diǎn)廣泛，可產(chǎn)生小肽和游離氨基酸[7,12]。風(fēng)味蛋白酶的水解效率較高，但過度酶切導(dǎo)致水解物的ACE抑制率顯著低于其他蛋白酶水解物[13]。風(fēng)味蛋白酶的酶切特性導(dǎo)致肽段羧基端的疏水性氨基酸較少，如Leu、Ile、Val，而這些氨基酸是ACE抑制肽的重要組成[14]，因此，風(fēng)味蛋白酶不適用于制備ACE抑制肽。Margatan等[15]研究發(fā)現(xiàn)，木瓜蛋白酶僅部分選擇性水解棉籽蛋白中的7S球蛋白，導(dǎo)致水解度和蛋白回收率較低。復(fù)合蛋白酶和堿性蛋白酶均為內(nèi)切酶，堿性蛋白酶的酶切位點(diǎn)主要是羧基端的疏水性氨基酸，而復(fù)合蛋白酶具有更廣泛的酶切位點(diǎn)，可以切割肽鍵和螺旋結(jié)構(gòu)中的氫鍵，進(jìn)而產(chǎn)生具有較高活性的中小型ACE抑制肽[7,12]。綜合文獻(xiàn)報(bào)道和棉籽蛋白不同蛋白酶水解物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究選用復(fù)合蛋白酶水解棉籽蛋白。

2.2 棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物的分離及肽段鑒定結(jié)果

不同數(shù)目的*表示水解組分(F1～F5)間的差異顯著(P<0.05)。圖3 棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物的分離組分及其ACE抑制活性Fig.3 Fractions of cottonseed protein hydrolysate prepared by protamex and their ACE inhibitory activities

利用液相色譜分離棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物，得到5個(gè)水解組分(F1、F2、F3、F4、F5)，分析各組分的ACE抑制活性，結(jié)果如圖3。由圖3(b)可見，各水解組分的ACE抑制活性具有顯著性差異(P<0.05)，其中，F(xiàn)1組分的ACE抑制活性最低(IC50=599.8 μg/mL)，F(xiàn)2、F3和F5組分的活性較為相近(IC50≈316.8 μg/mL)，而F4組分的ACE抑制活性最高(IC50=220.1 μg/mL)。經(jīng)質(zhì)譜(圖4)和AHTpin數(shù)據(jù)庫分析，F(xiàn)4組分的251條肽段中發(fā)現(xiàn)3條具有ACE抑制活性且尚未被報(bào)道的肽段：VFNNNPQE、LLSQTPRY和VFPGCPET。雖然3條肽段的分子質(zhì)量較為相近，且肽鏈長度相同，但表現(xiàn)出不同的ACE抑制活性(P<0.05)(表3)，其中，LLSQTPRY具有較高的ACE抑制活性(IC50=105.2 μmol/L)。

圖4 棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物中F4組分的質(zhì)譜總離子流圖Fig.4 Total ion chromatography of fraction 4 from cottonseed protein hydrolysate prepared by protamex

表3 3種棉籽蛋白活性肽的分子質(zhì)量和ACE抑制活性Tab.3 Molecular weights and ACE inhibitory activities of three peptides from cottonseed protein hydrolysate prepared by protamex

目前，常用超濾、凝膠層析和離子交換色譜等方法對水解物進(jìn)行分離純化，富集ACE抑制肽。Gao等[8,11]利用木瓜蛋白酶水解棉籽蛋白，通過超濾結(jié)合凝膠層析的方法分離水解物，得到ACE抑制活性較高的組分(分子質(zhì)量為0.8～2.4 kDa，IC50=159 μg/mL)；利用反相高效液相色譜結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜，進(jìn)一步純化鑒定，發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量為 763 Da 的肽段FPAIGMK具有較高的ACE抑制活性。Ma等[16]利用堿性蛋白酶水解辣木葉蛋白，超濾分離水解物后，收集ACE抑制率(84.7%)較高的水解組分(分子質(zhì)量<1 kDa)進(jìn)行肽段鑒定，發(fā)現(xiàn)2條新型ACE抑制肽：LGF(IC50=153.7 μmol/L)和GLFF(IC50=139.2 μmol/L)。雖然，上述研究通過蛋白酶水解制備新型ACE抑制肽，但其活性均低于本研究發(fā)現(xiàn)的LLSQTPRY。ACE抑制肽一般由2～20個(gè)氨基酸組成[17]，羧基端具有疏水性氨基酸(Trp、Leu、Ile等)，氨基端具有脂肪族氨基酸(Val、Leu、Pro、Ile、Ala、Met)。帶正電的氨基酸(Lys、Arg、His)容易接近ACE羧基端活性口袋中帶負(fù)電的Glu403和Glu162，從而抑制ACE活性[18]，而位于羧基端第三位的Pro可通過疏水作用力與ACE活性中心結(jié)合，抑制ACE活性[19]。本研究中，VFNNNPQE、LLSQTPRY和VFPGCPET氨基端由脂肪族氨基酸構(gòu)成，羧基端第三位為Pro，其中，LLSQTPRY含有帶正電的Arg。由于親水性氨基酸(Asn、Tyr、Thr)的存在，3條ACE抑制肽的活性均低于FPAIGMK[8]。然而，LLSQTPRY的ACE抑制活性卻高于大豆蛋白和菜籽蛋白等同類蛋白源ACE抑制肽的活性[18,20]。

2.3 棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物的體外消化吸收穩(wěn)定性分析

利用人工胃腸液結(jié)合Caco-2細(xì)胞單層膜模型，評價(jià)棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物的體外消化吸收穩(wěn)定性，結(jié)果如圖5。由圖5可見，水解物經(jīng)人工胃腸液消化和Caco-2細(xì)胞單層膜轉(zhuǎn)運(yùn)吸收后，ACE抑制率顯著降低(P<0.05)。經(jīng)人工胃液消化后，水解物的ACE抑制率由93.7%降低至68.4%，經(jīng)人工腸液進(jìn)一步消化，最終產(chǎn)物的ACE抑制率為53.8%。利用Caco-2細(xì)胞單層膜模型分析水解物在小腸上皮細(xì)胞的吸收作用發(fā)現(xiàn)，水解物可被刷狀緣膜中的細(xì)胞肽酶降解，導(dǎo)致ACE抑制率顯著降低(P<0.05)，但仍保持一定ACE抑制活性(20.5%)，水解物濃度對轉(zhuǎn)運(yùn)吸收作用并無顯著性影響(P>0.05)。

不同數(shù)目的*表示樣品間的顯著性差異(P<0.05)。CPH- P，棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物；CPH- PP，棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物經(jīng)人工胃液消化；CPH- PPT，棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物經(jīng)人工胃腸液消化；CPH- PH，質(zhì)量濃度為2 mg/mL棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物經(jīng)Caco-2細(xì)胞單層膜轉(zhuǎn)運(yùn)吸收處理；CPH- PL，質(zhì)量濃度為1 mg/mL棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物經(jīng)Caco-2細(xì)胞單層膜轉(zhuǎn)運(yùn)吸收處理。圖5 棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物的體外消化吸收穩(wěn)定性Fig.5 In vitro digestion and absorption stabilities of cottonseed protein hydrolysate prepared by protamex

由于消化類蛋白酶和細(xì)胞肽酶可降解活性肽為短肽或游離氨基酸，許多ACE抑制肽進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)后活性減弱，甚至喪失。ACE抑制肽普遍以水解物形式口服進(jìn)入人體，需要克服消化道酶和腸道黏膜等一系列屏障，以活性形式轉(zhuǎn)運(yùn)至體液循環(huán)發(fā)揮生理作用。本研究中，棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物經(jīng)體外模擬消化后，ACE抑制率降低，這與小麥面筋蛋白水解物和酪蛋白水解物結(jié)果類似[21-22]。對于消化率較低的蛋白質(zhì)而言，適度酶解可為后續(xù)胃腸消化激發(fā)ACE抑制肽釋放奠定良好基礎(chǔ)。Vermeirssen等[22]和郝欣悅等[23]研究發(fā)現(xiàn)，由于胃蛋白酶和胰蛋白酶可將大分子肽降解，米糠蛋白堿性蛋白酶水解物和瑞士乳桿菌干酪水解物的ACE抑制活性和多肽含量在體外模擬消化后顯著增加。研究表明，ACE抑制肽的小腸吸收機(jī)制主要包括載體介導(dǎo)主動轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運(yùn)和胞飲轉(zhuǎn)運(yùn)。盡管吸收效率可能受到肽鏈長度、疏水性和表面電荷等因素的影響，但肽鏈長度是最關(guān)鍵的因素[24]。本研究中，棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物中ACE抑制肽多具有較長肽鏈，難以完整地穿過腸上皮細(xì)胞屏障，限制其在Caco-2細(xì)胞單層膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收。水解物易被刷狀緣膜中的肽酶降解為游離氨基酸[25]，ACE抑制活性降低至20.5%。實(shí)驗(yàn)所用的Caco-2細(xì)胞單層膜比人體腸道細(xì)胞更為致密，阻礙部分活性序列轉(zhuǎn)運(yùn)吸收[22]，因此，本研究中的棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物經(jīng)實(shí)際體內(nèi)吸收后，也可能表現(xiàn)出較高的ACE抑制活性。

3 結(jié) 論

本研究通過復(fù)合蛋白酶水解棉籽蛋白制備ACE抑制肽，經(jīng)酶解條件優(yōu)化，提高水解物ACE抑制率至93.7%。通過高效液相色譜分離和質(zhì)譜鑒定，發(fā)現(xiàn)3條新型ACE抑制肽：VFNNNPQE、LLSQTPRY和VFPGCPET，其中LLSQTPRY的ACE抑制活性最高(IC50=105.2 μmol/L)。棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物經(jīng)人工胃腸液消化和Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)吸收后，仍保留一定ACE抑制活性。后期可利用微膠囊化技術(shù)，通過篩選壁材、調(diào)整芯壁比、優(yōu)化制備方法及條件等，提高棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物及其ACE抑制肽穩(wěn)定性和生物利用率。鑒于新型ACE抑制肽較高的活性及其生物利用率，棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物有望作為功能性食品配料，為降壓食品的開發(fā)及產(chǎn)業(yè)化提供依據(jù)。