常 暢,劉治平,陳哲漪,閆巧娟,江正強(qiáng),*
(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院/中國輕工業(yè)食品生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100083;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院, 北京 100083)
高血壓是引發(fā)冠心病和腦出血等重大疾病的主要因素,全球約有11.3億人患有高血壓病。2019年,全球由高血壓及其并發(fā)癥導(dǎo)致的死亡人數(shù)高達(dá)1 080萬[1]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin-I-converting enzyme, ACE)是促使人體血壓升高的重要分子[2],化學(xué)合成ACE抑制劑(卡托普利、賴諾普利)是臨床治療高血壓的主要藥物,但伴有竇性心動過速和血管神經(jīng)性水腫等不良反應(yīng),長期服用會對患者造成嚴(yán)重的身體和精神負(fù)擔(dān)[3]。食源性ACE抑制肽因安全性高、易吸收、無過度降壓危險(xiǎn)而備受關(guān)注[4]。圍繞ACE抑制肽的制備方法、降壓機(jī)理和構(gòu)效關(guān)系等方面已有大量研究[5],但相關(guān)產(chǎn)品不多。源于酪蛋白的纈氨酸- 脯氨酸- 脯氨酸和異亮氨酸- 脯氨酸- 脯氨酸是目前應(yīng)用最多的ACE抑制肽,如日本生產(chǎn)的乳酸菌飲料、芬蘭生產(chǎn)的發(fā)酵乳品以及荷蘭生產(chǎn)的功能性水溶粉劑,以及美國和法國生產(chǎn)的鰹魚肽片劑和膠囊。除酪蛋白肽和鰹魚肽外,其他食源性ACE抑制肽仍處于研究階段,尚未實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。
我國棉籽產(chǎn)量居世界第一,提油后的棉籽粕蛋白質(zhì)含量高達(dá)60%,高于大豆粕的蛋白質(zhì)含量。棉籽蛋白的主要成分是球蛋白(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90%),包括2S(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%)、7S和12S(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%)球蛋白。棉籽蛋白質(zhì)量近似于豆類蛋白,營養(yǎng)價(jià)值高于谷物蛋白[6]。de Oliveira Filho等[7]通過熱處理協(xié)同蛋白酶水解制備的棉籽蛋白水解物具有抗氧化和ACE抑制活性,其中,堿性蛋白酶水解物的ACE抑制率高達(dá)99.5%。Gao等[8]利用單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化木瓜蛋白酶水解條件,制備的FPAIGMK(IC50=38.9 μmol/L)是迄今報(bào)道的活性最高的棉籽蛋白ACE抑制肽。目前,酶法制備棉籽蛋白ACE抑制肽的研究較多,但其抑制活性有待進(jìn)一步提高,且尚未見評價(jià)棉籽蛋白水解物及其ACE抑制肽的消化吸收穩(wěn)定性的研究。食源性ACE抑制肽經(jīng)口服后需通過胃腸道消化降解、小腸上皮吸收滲透等多重生理屏障,而這些生理屏障會導(dǎo)致活性肽體內(nèi)穩(wěn)定性降低,限制人體對活性肽的有效生物利用。研究ACE抑制肽的消化吸收穩(wěn)定性對于推動活性肽在功能性食品中的應(yīng)用具有重要作用。
本研究以脫酚棉籽蛋白為原料,擬利用不同蛋白酶水解制備ACE抑制肽并優(yōu)化其水解條件,通過分離純化和質(zhì)譜鑒定,挖掘具有ACE抑制活性的新型肽段,探究其體外消化吸收穩(wěn)定性,以期為活性肽體內(nèi)吸收的基礎(chǔ)研究和棉籽蛋白在功能性降壓食品中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
脫酚棉籽蛋白(總蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為74.8%),北京中棉紫光生物科技有限公司;Caco-2細(xì)胞株,中國科學(xué)院細(xì)胞庫;堿性蛋白酶(Alcalase 2.4L,來源于地衣芽孢桿菌)、復(fù)合蛋白酶(來源于芽孢桿菌屬)、風(fēng)味蛋白酶(來源于米曲霉),丹麥Novozymes公司;木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶,上海源葉生物科技有限公司;L-酪氨酸、福林酚、ACE、馬尿酰- 組氨酰- 亮氨酸(N-hippuryl-His-Leu hydrate,HHL)、鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde, OPA)、胎牛血清、Dulbecco’s modification of eagle’s medium(DMEM)培養(yǎng)基,美國Sigma-Aldrich公司;鹽酸、氫氧化鈉、乙酸乙酯、四硼酸鈉、氯化鈉、硼酸、碳酸鈉、異丙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、甲醇、甲酸、乙腈等化學(xué)試劑均為分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
pH計(jì),德國賽德利斯北京有限公司;TU- 1901型分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限公司;LGJ- 10型冷凍干燥機(jī),北京松源華興科技發(fā)展有限公司;UPC- 900KTA型蛋白純化系統(tǒng),美國GE Healthcare公司;Acquity nano型高效液相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國Waters公司;HH- 1型數(shù)顯恒溫水浴鍋,常州榮華儀器制造有限公司;QP- 50型生物培養(yǎng)箱,山東博科集團(tuán);TD6M型高速離心機(jī),長沙平凡儀器儀表有限公司;EVOM2型電阻儀、Transwell型培養(yǎng)板(孔徑0.4 μm、膜面積1.12 cm2、12孔的聚酯膜),美國Millipore公司。
1.3.1不同蛋白酶水解棉籽蛋白條件的優(yōu)化
配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的棉籽蛋白溶液(pH值為7.0),分別加入1 500 U/g堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶,調(diào)節(jié)酶解反應(yīng)體系至不同蛋白酶的最適pH值和溫度(表1)。搖床振蕩(200 r/min)酶解6 h后,100 ℃水浴加熱5 min滅酶,冷卻后離心(10 000 r/min,5 min)取上清液,真空冷凍干燥,-20 ℃保存。以水解度、蛋白回收率和ACE抑制率為評價(jià)指標(biāo),確定最適蛋白酶。
表1 不同蛋白酶的最適水解條件Tab.1 Optimal hydrolysis conditions of different proteases
配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的棉籽蛋白溶液(pH值8.0),最適蛋白酶加酶量為1 500 U/g,50 ℃分別水解1~6 h,探究水解時(shí)間對蛋白回收率和ACE抑制率的影響。再配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的棉籽蛋白溶液(pH值8.0),最適蛋白酶加酶量為750~3 000 U/g,50 ℃水解5 h,探討加酶量對蛋白回收率和ACE抑制率的影響。
1.3.2水解度和蛋白回收率的測定
采用OPA法測定水解度(DH)。取400 μL棉籽蛋白水解液(質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL)加入3 mL OPA試劑,反應(yīng)2 min,在340 nm處測定吸光值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:取0~400 μL絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)液(質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL)于5 mL試管中,去離子水補(bǔ)足體積至400 μL,加入3 mL OPA試劑,反應(yīng)2 min,在340 nm處測定吸光值,利用吸光值與絲氨酸濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。水解度的計(jì)算方法見式(1)。
(1)
式(1)中,htot是原料蛋白肽鍵的質(zhì)量摩爾濃度,mmol/g(棉籽蛋白的htot為7.54 mmol/g);h是水解蛋白相對于原料蛋白的被水解肽鍵的質(zhì)量摩爾濃度,mmol/g。
采用微量凱氏定氮法,分別測定水解前的總蛋白質(zhì)含量和水解后的蛋白質(zhì)含量,計(jì)算棉籽蛋白水解物的蛋白回收率,計(jì)算方法見式(2)。
(2)
式(2)中,m1為水解物中蛋白質(zhì)質(zhì)量,mg;m2為原料總蛋白質(zhì)質(zhì)量,mg。
1.3.3ACE抑制活性的測定
采用HHL方法測定ACE抑制率[9]。將HHL溶于50 mmol/L硼酸鹽緩沖液(含300 mmol/L NaCl、pH值8.3),制得5 mmol/L HHL溶液。取20 μL棉籽蛋白水解物溶液(質(zhì)量濃度為2 mg/mL)與120 μL HHL溶液混合,再加入10 μL ACE溶液(0.1 U/mL),在37 ℃反應(yīng)60 min。加入150 μL鹽酸(1 mmol/L)終止反應(yīng),然后加入1 mL乙酸乙酯充分振蕩萃取10 s后,在10 000 r/min下離心5 min,收集酯層750 μL烘干。冷卻后加入500 μL去離子水溶解殘?jiān)?,采用紫外分光光度?jì)測定228 nm處的吸光值。以20 μL硼酸鹽緩沖液替代棉籽蛋白水解物溶液,作為空白對照。在反應(yīng)前,加入150 μL鹽酸(1 mmol/L)滅活A(yù)CE,作為陽性對照。利用樣品吸光值(Aa)、空白對照吸光值(Ab)和陽性對照吸光值(Ac),計(jì)算ACE抑制率,見式(3)。
(3)
將樣品溶液稀釋至不同濃度,測定ACE抑制率,以ACE抑制率為縱坐標(biāo),樣品濃度的log值為橫坐標(biāo),利用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行非線性擬合計(jì)算半抑制濃度(IC50)。
1.3.4棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物的分離和鑒定
采用快速蛋白液相色譜(fast protein liquid chromatography, FPLC)聯(lián)用KTA純化系統(tǒng),以Sephadex G- 15型(100 cm×12 mm)層析柱,分離50 mg/mL棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物。分離前,采用0.22 μm微濾膜除雜。上樣量為1.5 mL,洗脫液為磷酸緩沖液(10 mmol/L、pH值7.0),洗脫速度為0.8 mL/min,紫外檢測波長為280 nm,收集洗脫液,冷凍干燥,測定ACE抑制活性。
利用納米高效液相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用儀,鑒定具有較高ACE抑制活性水解組分的序列組成,色譜柱為Thermo Acclaim PepMap C18型柱(75 mm×2 mm, 3 μm)。將水解組分(質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL)溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸水溶液,上樣量7 μL。以含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%甲酸的乙腈溶液為洗脫液,以1 mL/min的速度在65 min內(nèi)進(jìn)行梯度洗脫(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%~35%),通過PEAKS Studio軟件分析肽序列。利用AHTpin數(shù)據(jù)庫挑選ACE抑制肽進(jìn)行合成(國肽生物科技有限公司),測定ACE抑制活性。
1.3.5體外消化吸收穩(wěn)定性的測定
將2 g NaCl和7 mL體積分?jǐn)?shù)為36%的鹽酸溶于去離子水,定容至1 000 mL后,加入3.2 g胃蛋白酶制備胃液(pH值為1.2)。將6.8 g磷酸二氫鉀和77 mL 0.2 mol/L氫氧化鈉溶于750 mL去離子水,加入10 g胰蛋白酶,并用0.1 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至6.8,定容至1 000 mL制備腸液。將棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%)溶于胃液,在37 ℃消化1.5 h,加熱至100 ℃滅酶10 min,冷卻后離心(10 000 r/min)10 min取上清液,測定ACE抑制率。取10 mL離心前的胃液樣品,將pH值調(diào)節(jié)至6.8,加入10 mL腸液,在37 ℃消化3 h,加熱至100 ℃滅酶10 min,冷卻后離心(10 000 r/min)10 min取上清液,測定ACE抑制率。
將Caco-2細(xì)胞接種于25 cm2卡式培養(yǎng)瓶中,加入體積分?jǐn)?shù)為1%的DMEM培養(yǎng)液(含有100 U/mL青霉素和鏈霉素)、10%的胎牛血清、1%的L-谷氨酰胺和1%的非必需氨基酸,在37 ℃、95%相對濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%~80%時(shí),加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶消化,調(diào)整細(xì)胞濃度以3×105個(gè)/mL接種于12孔Transwell板的濾膜上。在Transwell板的上室和下室中分別加入0.5 mL細(xì)胞懸液和1.5 mL DMEM培養(yǎng)液。培養(yǎng)21 d,利用細(xì)胞電阻電壓歐姆儀測定跨膜單層細(xì)胞電阻值(transepithelial electrical resistance, TEER),明確Caco-2細(xì)胞單層膜的緊密性和完整性[10]。分別在Caco-2細(xì)胞單層膜的刷狀緣膜(AP)側(cè)和基底膜(BP)側(cè)加入HBSS(Hank’s balanced salt solution)緩沖液0.5 mL和1.5 mL,在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)證實(shí)棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物在質(zhì)量濃度為0.4~2.0 mg/mL時(shí),未對Caco-2細(xì)胞顯示出細(xì)胞毒性(圖1)。因此,AP側(cè)加入0.5 mL含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1~2 mg/mL棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物的HBSS緩沖液,BP側(cè)加入1.5 mL空白HBSS緩沖液。在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后,取BP側(cè)培養(yǎng)液測定ACE抑制率。以未加入棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物的樣品作為空白對照。
圖1 棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物對Caco-2細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effect of cottonseed protein hydrolysate prepared by protamex on cell viability of Caco-2 cells
采用IBM SPSS 22.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用一維方差分析(One-Way ANOVA)中的Tukey’s多重比較進(jìn)行顯著性分析,P<0.05表示數(shù)據(jù)具有顯著性差異。
不同蛋白酶水解棉籽蛋白制備ACE抑制肽的結(jié)果如表2。由表2可知,在同等酶活力下,不同蛋白酶水解棉籽蛋白的能力具有顯著性差異(P<0.05)。棉籽蛋白水解物的ACE抑制率顯著高于未經(jīng)水解的棉籽蛋白ACE抑制率(15.0%)。風(fēng)味蛋白酶水解物的水解度(55.6%)和蛋白回收率(43.9%)顯著高于其他蛋白酶水解物,但其ACE抑制率較低(47.1%)。木瓜蛋白酶水解物的水解度(33.3%)和蛋白回收率(17.8%)較低,但其ACE抑制率卻處于較高水平(70.7%)。復(fù)合蛋白酶水解物的ACE抑制率最高(85.7%),水解度(32.5%)和蛋白回收率(40.6%)也處于較高水平。因此,選用復(fù)合蛋白酶水解棉籽蛋白制備ACE抑制肽。進(jìn)一步優(yōu)化復(fù)合蛋白酶水解時(shí)間和加酶量,結(jié)果如圖2。由圖2(a)可知,隨著水解時(shí)間的延長,蛋白回收率緩慢增加,而ACE抑制率在1~5 h內(nèi)不斷升高,在5 h時(shí)達(dá)到最大值,隨后略微降低。當(dāng)加酶量不斷增加時(shí),蛋白回收率不斷升高,但ACE抑制率先升高后降低。當(dāng)復(fù)合蛋白酶加酶量為1 500 U/g,水解pH值為8.0,溫度為55 ℃,水解時(shí)間為5 h時(shí),ACE抑制率最高,為93.7%,蛋白回收率為39.8%[圖2(b)]。因此,在復(fù)合蛋白酶的最適pH值和溫度下,加酶量為1500 U/g,水解棉籽蛋白5 h,棉籽蛋白水解物(質(zhì)量濃度為2 mg/mL)的ACE抑制率為93.7%。
表2 棉籽蛋白不同蛋白酶水解物的水解度、蛋白回收率和ACE抑制率Tab.2 Effects of proteases on degree of hydrolysis, protein recovery rate, and ACE inhibitory activity of cottonseed protein hydrolysates
圖2 復(fù)合蛋白酶水解時(shí)間和加酶量對棉籽蛋白水解物的蛋白回收率和ACE抑制率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time and protamex concentration on protein recovery rate and ACE inhibitory activity of cottonseed protein hydrolysates
本研究中,復(fù)合蛋白酶水解物的ACE抑制率高于de Oliveira Filho等[7]和Gao等[11]研究中木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶水解棉籽蛋白的ACE抑制率(55%~74%)。風(fēng)味蛋白酶具有內(nèi)切酶和外切酶的作用特性,酶切位點(diǎn)廣泛,可產(chǎn)生小肽和游離氨基酸[7,12]。風(fēng)味蛋白酶的水解效率較高,但過度酶切導(dǎo)致水解物的ACE抑制率顯著低于其他蛋白酶水解物[13]。風(fēng)味蛋白酶的酶切特性導(dǎo)致肽段羧基端的疏水性氨基酸較少,如Leu、Ile、Val,而這些氨基酸是ACE抑制肽的重要組成[14],因此,風(fēng)味蛋白酶不適用于制備ACE抑制肽。Margatan等[15]研究發(fā)現(xiàn),木瓜蛋白酶僅部分選擇性水解棉籽蛋白中的7S球蛋白,導(dǎo)致水解度和蛋白回收率較低。復(fù)合蛋白酶和堿性蛋白酶均為內(nèi)切酶,堿性蛋白酶的酶切位點(diǎn)主要是羧基端的疏水性氨基酸,而復(fù)合蛋白酶具有更廣泛的酶切位點(diǎn),可以切割肽鍵和螺旋結(jié)構(gòu)中的氫鍵,進(jìn)而產(chǎn)生具有較高活性的中小型ACE抑制肽[7,12]。綜合文獻(xiàn)報(bào)道和棉籽蛋白不同蛋白酶水解物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本研究選用復(fù)合蛋白酶水解棉籽蛋白。
不同數(shù)目的*表示水解組分(F1~F5)間的差異顯著(P<0.05)。圖3 棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物的分離組分及其ACE抑制活性Fig.3 Fractions of cottonseed protein hydrolysate prepared by protamex and their ACE inhibitory activities
利用液相色譜分離棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物,得到5個(gè)水解組分(F1、F2、F3、F4、F5),分析各組分的ACE抑制活性,結(jié)果如圖3。由圖3(b)可見,各水解組分的ACE抑制活性具有顯著性差異(P<0.05),其中,F(xiàn)1組分的ACE抑制活性最低(IC50=599.8 μg/mL),F(xiàn)2、F3和F5組分的活性較為相近(IC50≈316.8 μg/mL),而F4組分的ACE抑制活性最高(IC50=220.1 μg/mL)。經(jīng)質(zhì)譜(圖4)和AHTpin數(shù)據(jù)庫分析,F(xiàn)4組分的251條肽段中發(fā)現(xiàn)3條具有ACE抑制活性且尚未被報(bào)道的肽段:VFNNNPQE、LLSQTPRY和VFPGCPET。雖然3條肽段的分子質(zhì)量較為相近,且肽鏈長度相同,但表現(xiàn)出不同的ACE抑制活性(P<0.05)(表3),其中,LLSQTPRY具有較高的ACE抑制活性(IC50=105.2 μmol/L)。
圖4 棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物中F4組分的質(zhì)譜總離子流圖Fig.4 Total ion chromatography of fraction 4 from cottonseed protein hydrolysate prepared by protamex
表3 3種棉籽蛋白活性肽的分子質(zhì)量和ACE抑制活性Tab.3 Molecular weights and ACE inhibitory activities of three peptides from cottonseed protein hydrolysate prepared by protamex
目前,常用超濾、凝膠層析和離子交換色譜等方法對水解物進(jìn)行分離純化,富集ACE抑制肽。Gao等[8,11]利用木瓜蛋白酶水解棉籽蛋白,通過超濾結(jié)合凝膠層析的方法分離水解物,得到ACE抑制活性較高的組分(分子質(zhì)量為0.8~2.4 kDa,IC50=159 μg/mL);利用反相高效液相色譜結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜,進(jìn)一步純化鑒定,發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量為 763 Da 的肽段FPAIGMK具有較高的ACE抑制活性。Ma等[16]利用堿性蛋白酶水解辣木葉蛋白,超濾分離水解物后,收集ACE抑制率(84.7%)較高的水解組分(分子質(zhì)量<1 kDa)進(jìn)行肽段鑒定,發(fā)現(xiàn)2條新型ACE抑制肽:LGF(IC50=153.7 μmol/L)和GLFF(IC50=139.2 μmol/L)。雖然,上述研究通過蛋白酶水解制備新型ACE抑制肽,但其活性均低于本研究發(fā)現(xiàn)的LLSQTPRY。ACE抑制肽一般由2~20個(gè)氨基酸組成[17],羧基端具有疏水性氨基酸(Trp、Leu、Ile等),氨基端具有脂肪族氨基酸(Val、Leu、Pro、Ile、Ala、Met)。帶正電的氨基酸(Lys、Arg、His)容易接近ACE羧基端活性口袋中帶負(fù)電的Glu403和Glu162,從而抑制ACE活性[18],而位于羧基端第三位的Pro可通過疏水作用力與ACE活性中心結(jié)合,抑制ACE活性[19]。本研究中,VFNNNPQE、LLSQTPRY和VFPGCPET氨基端由脂肪族氨基酸構(gòu)成,羧基端第三位為Pro,其中,LLSQTPRY含有帶正電的Arg。由于親水性氨基酸(Asn、Tyr、Thr)的存在,3條ACE抑制肽的活性均低于FPAIGMK[8]。然而,LLSQTPRY的ACE抑制活性卻高于大豆蛋白和菜籽蛋白等同類蛋白源ACE抑制肽的活性[18,20]。
利用人工胃腸液結(jié)合Caco-2細(xì)胞單層膜模型,評價(jià)棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物的體外消化吸收穩(wěn)定性,結(jié)果如圖5。由圖5可見,水解物經(jīng)人工胃腸液消化和Caco-2細(xì)胞單層膜轉(zhuǎn)運(yùn)吸收后,ACE抑制率顯著降低(P<0.05)。經(jīng)人工胃液消化后,水解物的ACE抑制率由93.7%降低至68.4%,經(jīng)人工腸液進(jìn)一步消化,最終產(chǎn)物的ACE抑制率為53.8%。利用Caco-2細(xì)胞單層膜模型分析水解物在小腸上皮細(xì)胞的吸收作用發(fā)現(xiàn),水解物可被刷狀緣膜中的細(xì)胞肽酶降解,導(dǎo)致ACE抑制率顯著降低(P<0.05),但仍保持一定ACE抑制活性(20.5%),水解物濃度對轉(zhuǎn)運(yùn)吸收作用并無顯著性影響(P>0.05)。
不同數(shù)目的*表示樣品間的顯著性差異(P<0.05)。CPH- P,棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物;CPH- PP,棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物經(jīng)人工胃液消化;CPH- PPT,棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物經(jīng)人工胃腸液消化;CPH- PH,質(zhì)量濃度為2 mg/mL棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物經(jīng)Caco-2細(xì)胞單層膜轉(zhuǎn)運(yùn)吸收處理;CPH- PL,質(zhì)量濃度為1 mg/mL棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物經(jīng)Caco-2細(xì)胞單層膜轉(zhuǎn)運(yùn)吸收處理。圖5 棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物的體外消化吸收穩(wěn)定性Fig.5 In vitro digestion and absorption stabilities of cottonseed protein hydrolysate prepared by protamex
由于消化類蛋白酶和細(xì)胞肽酶可降解活性肽為短肽或游離氨基酸,許多ACE抑制肽進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)后活性減弱,甚至喪失。ACE抑制肽普遍以水解物形式口服進(jìn)入人體,需要克服消化道酶和腸道黏膜等一系列屏障,以活性形式轉(zhuǎn)運(yùn)至體液循環(huán)發(fā)揮生理作用。本研究中,棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物經(jīng)體外模擬消化后,ACE抑制率降低,這與小麥面筋蛋白水解物和酪蛋白水解物結(jié)果類似[21-22]。對于消化率較低的蛋白質(zhì)而言,適度酶解可為后續(xù)胃腸消化激發(fā)ACE抑制肽釋放奠定良好基礎(chǔ)。Vermeirssen等[22]和郝欣悅等[23]研究發(fā)現(xiàn),由于胃蛋白酶和胰蛋白酶可將大分子肽降解,米糠蛋白堿性蛋白酶水解物和瑞士乳桿菌干酪水解物的ACE抑制活性和多肽含量在體外模擬消化后顯著增加。研究表明,ACE抑制肽的小腸吸收機(jī)制主要包括載體介導(dǎo)主動轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運(yùn)和胞飲轉(zhuǎn)運(yùn)。盡管吸收效率可能受到肽鏈長度、疏水性和表面電荷等因素的影響,但肽鏈長度是最關(guān)鍵的因素[24]。本研究中,棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物中ACE抑制肽多具有較長肽鏈,難以完整地穿過腸上皮細(xì)胞屏障,限制其在Caco-2細(xì)胞單層膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收。水解物易被刷狀緣膜中的肽酶降解為游離氨基酸[25],ACE抑制活性降低至20.5%。實(shí)驗(yàn)所用的Caco-2細(xì)胞單層膜比人體腸道細(xì)胞更為致密,阻礙部分活性序列轉(zhuǎn)運(yùn)吸收[22],因此,本研究中的棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物經(jīng)實(shí)際體內(nèi)吸收后,也可能表現(xiàn)出較高的ACE抑制活性。
本研究通過復(fù)合蛋白酶水解棉籽蛋白制備ACE抑制肽,經(jīng)酶解條件優(yōu)化,提高水解物ACE抑制率至93.7%。通過高效液相色譜分離和質(zhì)譜鑒定,發(fā)現(xiàn)3條新型ACE抑制肽:VFNNNPQE、LLSQTPRY和VFPGCPET,其中LLSQTPRY的ACE抑制活性最高(IC50=105.2 μmol/L)。棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物經(jīng)人工胃腸液消化和Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)吸收后,仍保留一定ACE抑制活性。后期可利用微膠囊化技術(shù),通過篩選壁材、調(diào)整芯壁比、優(yōu)化制備方法及條件等,提高棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物及其ACE抑制肽穩(wěn)定性和生物利用率。鑒于新型ACE抑制肽較高的活性及其生物利用率,棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物有望作為功能性食品配料,為降壓食品的開發(fā)及產(chǎn)業(yè)化提供依據(jù)。