棉籽蛋白ACE抑制肽的酶法制備及其體外穩(wěn)定性研究

常 暢，劉治平，陳哲漪，閆巧娟，江正強,*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院/中國輕工業(yè)食品生物工程重點實驗室， 北京 100083；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院， 北京 100083)

高血壓是引發(fā)冠心病和腦出血等重大疾病的主要因素，全球約有11.3億人患有高血壓病。2019年，全球由高血壓及其并發(fā)癥導(dǎo)致的死亡人數(shù)高達(dá)1 080萬[1]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin-I-converting enzyme, ACE)是促使人體血壓升高的重要分子[2]，化學(xué)合成ACE抑制劑(卡托普利、賴諾普利)是臨床治療高血壓的主要藥物，但伴有竇性心動過速和血管神經(jīng)性水腫等不良反應(yīng)，長期服用會對患者造成嚴(yán)重的身體和精神負(fù)擔(dān)[3]。食源性ACE抑制肽因安全性高、易吸收、無過度降壓危險而備受關(guān)注[4]。圍繞ACE抑制肽的制備方法、降壓機(jī)理和構(gòu)效關(guān)系等方面已有大量研究[5]，但相關(guān)產(chǎn)品不多。源于酪蛋白的纈氨酸- 脯氨酸- 脯氨酸和異亮氨酸- 脯氨酸- 脯氨酸是目前應(yīng)用最多的ACE抑制肽，如日本生產(chǎn)的乳酸菌飲料、芬蘭生產(chǎn)的發(fā)酵乳品以及荷蘭生產(chǎn)的功能性水溶粉劑，以及美國和法國生產(chǎn)的鰹魚肽片劑和膠囊。除酪蛋白肽和鰹魚肽外，其他食源性ACE抑制肽仍處于研究階段，尚未實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。

我國棉籽產(chǎn)量居世界第一，提油后的棉籽粕蛋白質(zhì)含量高達(dá)60%，高于大豆粕的蛋白質(zhì)含量。棉籽蛋白的主要成分是球蛋白(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90%)，包括2S(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%)、7S和12S(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%)球蛋白。棉籽蛋白質(zhì)量近似于豆類蛋白，營養(yǎng)價值高于谷物蛋白[6]。de Oliveira Filho等[7]通過熱處理協(xié)同蛋白酶水解制備的棉籽蛋白水解物具有抗氧化和ACE抑制活性，其中，堿性蛋白酶水解物的ACE抑制率高達(dá)99.5%。Gao等[8]利用單因素實驗結(jié)合響應(yīng)面中心組合設(shè)計試驗優(yōu)化木瓜蛋白酶水解條件，制備的FPAIGMK(IC50=38.9 μmol/L)是迄今報道的活性最高的棉籽蛋白ACE抑制肽。目前，酶法制備棉籽蛋白ACE抑制肽的研究較多，但其抑制活性有待進(jìn)一步提高，且尚未見評價棉籽蛋白水解物及其ACE抑制肽的消化吸收穩(wěn)定性的研究。食源性ACE抑制肽經(jīng)口服后需通過胃腸道消化降解、小腸上皮吸收滲透等多重生理屏障，而這些生理屏障會導(dǎo)致活性肽體內(nèi)穩(wěn)定性降低，限制人體對活性肽的有效生物利用。研究ACE抑制肽的消化吸收穩(wěn)定性對于推動活性肽在功能性食品中的應(yīng)用具有重要作用。

本研究以脫酚棉籽蛋白為原料，擬利用不同蛋白酶水解制備ACE抑制肽并優(yōu)化其水解條件，通過分離純化和質(zhì)譜鑒定，挖掘具有ACE抑制活性的新型肽段，探究其體外消化吸收穩(wěn)定性，以期為活性肽體內(nèi)吸收的基礎(chǔ)研究和棉籽蛋白在功能性降壓食品中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫酚棉籽蛋白(總蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為74.8%)，北京中棉紫光生物科技有限公司；Caco-2細(xì)胞株，中國科學(xué)院細(xì)胞庫；堿性蛋白酶(Alcalase 2.4L，來源于地衣芽孢桿菌)、復(fù)合蛋白酶(來源于芽孢桿菌屬)、風(fēng)味蛋白酶(來源于米曲霉)，丹麥Novozymes公司；木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶，上海源葉生物科技有限公司；L-酪氨酸、福林酚、ACE、馬尿酰- 組氨酰- 亮氨酸(N-hippuryl-His-Leu hydrate，HHL)、鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde, OPA)、胎牛血清、Dulbecco’s modification of eagle’s medium(DMEM)培養(yǎng)基，美國Sigma-Aldrich公司；鹽酸、氫氧化鈉、乙酸乙酯、四硼酸鈉、氯化鈉、硼酸、碳酸鈉、異丙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、甲醇、甲酸、乙腈等化學(xué)試劑均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

pH計，德國賽德利斯北京有限公司；TU- 1901型分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；LGJ- 10型冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；UPC- 900KTA型蛋白純化系統(tǒng)，美國GE Healthcare公司；Acquity nano型高效液相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Waters公司；HH- 1型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州榮華儀器制造有限公司；QP- 50型生物培養(yǎng)箱，山東博科集團(tuán)；TD6M型高速離心機(jī)，長沙平凡儀器儀表有限公司；EVOM2型電阻儀、Transwell型培養(yǎng)板(孔徑0.4 μm、膜面積1.12 cm2、12孔的聚酯膜)，美國Millipore公司。

1.3 實驗方法

1.3.1不同蛋白酶水解棉籽蛋白條件的優(yōu)化

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的棉籽蛋白溶液(pH值為7.0)，分別加入1 500 U/g堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶，調(diào)節(jié)酶解反應(yīng)體系至不同蛋白酶的最適pH值和溫度(表1)。搖床振蕩(200 r/min)酶解6 h后，100 ℃水浴加熱5 min滅酶，冷卻后離心(10 000 r/min，5 min)取上清液，真空冷凍干燥，-20 ℃保存。以水解度、蛋白回收率和ACE抑制率為評價指標(biāo)，確定最適蛋白酶。

表1 不同蛋白酶的最適水解條件Tab.1 Optimal hydrolysis conditions of different proteases

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的棉籽蛋白溶液(pH值8.0)，最適蛋白酶加酶量為1 500 U/g，50 ℃分別水解1～6 h，探究水解時間對蛋白回收率和ACE抑制率的影響。再配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的棉籽蛋白溶液(pH值8.0)，最適蛋白酶加酶量為750～3 000 U/g，50 ℃水解5 h，探討加酶量對蛋白回收率和ACE抑制率的影響。

1.3.2水解度和蛋白回收率的測定

采用OPA法測定水解度(DH)。取400 μL棉籽蛋白水解液(質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL)加入3 mL OPA試劑，反應(yīng)2 min，在340 nm處測定吸光值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：取0～400 μL絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)液(質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL)于5 mL試管中，去離子水補足體積至400 μL，加入3 mL OPA試劑，反應(yīng)2 min，在340 nm處測定吸光值，利用吸光值與絲氨酸濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。水解度的計算方法見式(1)。

(1)

式(1)中，htot是原料蛋白肽鍵的質(zhì)量摩爾濃度，mmol/g(棉籽蛋白的htot為7.54 mmol/g)；h是水解蛋白相對于原料蛋白的被水解肽鍵的質(zhì)量摩爾濃度，mmol/g。

采用微量凱氏定氮法，分別測定水解前的總蛋白質(zhì)含量和水解后的蛋白質(zhì)含量，計算棉籽蛋白水解物的蛋白回收率，計算方法見式(2)。

(2)

式(2)中，m1為水解物中蛋白質(zhì)質(zhì)量，mg；m2為原料總蛋白質(zhì)質(zhì)量，mg。

1.3.3ACE抑制活性的測定

采用HHL方法測定ACE抑制率[9]。將HHL溶于50 mmol/L硼酸鹽緩沖液(含300 mmol/L NaCl、pH值8.3)，制得5 mmol/L HHL溶液。取20 μL棉籽蛋白水解物溶液(質(zhì)量濃度為2 mg/mL)與120 μL HHL溶液混合，再加入10 μL ACE溶液(0.1 U/mL)，在37 ℃反應(yīng)60 min。加入150 μL鹽酸(1 mmol/L)終止反應(yīng)，然后加入1 mL乙酸乙酯充分振蕩萃取10 s后，在10 000 r/min下離心5 min，收集酯層750 μL烘干。冷卻后加入500 μL去離子水溶解殘渣，采用紫外分光光度計測定228 nm處的吸光值。以20 μL硼酸鹽緩沖液替代棉籽蛋白水解物溶液，作為空白對照。在反應(yīng)前，加入150 μL鹽酸(1 mmol/L)滅活A(yù)CE，作為陽性對照。利用樣品吸光值(Aa)、空白對照吸光值(Ab)和陽性對照吸光值(Ac)，計算ACE抑制率，見式(3)。

(3)

將樣品溶液稀釋至不同濃度，測定ACE抑制率，以ACE抑制率為縱坐標(biāo)，樣品濃度的log值為橫坐標(biāo)，利用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行非線性擬合計算半抑制濃度(IC50)。

1.3.4棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物的分離和鑒定

采用快速蛋白液相色譜(fast protein liquid chromatography, FPLC)聯(lián)用KTA純化系統(tǒng)，以Sephadex G- 15型(100 cm×12 mm)層析柱，分離50 mg/mL棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物。分離前，采用0.22 μm微濾膜除雜。上樣量為1.5 mL，洗脫液為磷酸緩沖液(10 mmol/L、pH值7.0)，洗脫速度為0.8 mL/min，紫外檢測波長為280 nm，收集洗脫液，冷凍干燥，測定ACE抑制活性。

利用納米高效液相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用儀，鑒定具有較高ACE抑制活性水解組分的序列組成，色譜柱為Thermo Acclaim PepMap C18型柱(75 mm×2 mm, 3 μm)。將水解組分(質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL)溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸水溶液，上樣量7 μL。以含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%甲酸的乙腈溶液為洗脫液，以1 mL/min的速度在65 min內(nèi)進(jìn)行梯度洗脫(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%～35%)，通過PEAKS Studio軟件分析肽序列。利用AHTpin數(shù)據(jù)庫挑選ACE抑制肽進(jìn)行合成(國肽生物科技有限公司)，測定ACE抑制活性。

1.3.5體外消化吸收穩(wěn)定性的測定

將2 g NaCl和7 mL體積分?jǐn)?shù)為36%的鹽酸溶于去離子水，定容至1 000 mL后，加入3.2 g胃蛋白酶制備胃液(pH值為1.2)。將6.8 g磷酸二氫鉀和77 mL 0.2 mol/L氫氧化鈉溶于750 mL去離子水，加入10 g胰蛋白酶，并用0.1 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至6.8，定容至1 000 mL制備腸液。將棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%)溶于胃液，在37 ℃消化1.5 h，加熱至100 ℃滅酶10 min，冷卻后離心(10 000 r/min)10 min取上清液，測定ACE抑制率。取10 mL離心前的胃液樣品，將pH值調(diào)節(jié)至6.8，加入10 mL腸液，在37 ℃消化3 h，加熱至100 ℃滅酶10 min，冷卻后離心(10 000 r/min)10 min取上清液，測定ACE抑制率。

將Caco-2細(xì)胞接種于25 cm2卡式培養(yǎng)瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為1%的DMEM培養(yǎng)液(含有100 U/mL青霉素和鏈霉素)、10%的胎牛血清、1%的L-谷氨酰胺和1%的非必需氨基酸，在37 ℃、95%相對濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度以3×105個/mL接種于12孔Transwell板的濾膜上。在Transwell板的上室和下室中分別加入0.5 mL細(xì)胞懸液和1.5 mL DMEM培養(yǎng)液。培養(yǎng)21 d，利用細(xì)胞電阻電壓歐姆儀測定跨膜單層細(xì)胞電阻值(transepithelial electrical resistance, TEER)，明確Caco-2細(xì)胞單層膜的緊密性和完整性[10]。分別在Caco-2細(xì)胞單層膜的刷狀緣膜(AP)側(cè)和基底膜(BP)側(cè)加入HBSS(Hank’s balanced salt solution)緩沖液0.5 mL和1.5 mL，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。細(xì)胞活性實驗證實棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物在質(zhì)量濃度為0.4～2.0 mg/mL時，未對Caco-2細(xì)胞顯示出細(xì)胞毒性(圖1)。因此，AP側(cè)加入0.5 mL含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1～2 mg/mL棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物的HBSS緩沖液，BP側(cè)加入1.5 mL空白HBSS緩沖液。在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，取BP側(cè)培養(yǎng)液測定ACE抑制率。以未加入棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物的樣品作為空白對照。

圖1 棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物對Caco-2細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effect of cottonseed protein hydrolysate prepared by protamex on cell viability of Caco-2 cells

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用IBM SPSS 22.0軟件分析實驗數(shù)據(jù)，每個實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用一維方差分析(One-Way ANOVA)中的Tukey’s多重比較進(jìn)行顯著性分析，P<0.05表示數(shù)據(jù)具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉籽蛋白的酶解條件優(yōu)化結(jié)果

不同蛋白酶水解棉籽蛋白制備ACE抑制肽的結(jié)果如表2。由表2可知，在同等酶活力下，不同蛋白酶水解棉籽蛋白的能力具有顯著性差異(P<0.05)。棉籽蛋白水解物的ACE抑制率顯著高于未經(jīng)水解的棉籽蛋白ACE抑制率(15.0%)。風(fēng)味蛋白酶水解物的水解度(55.6%)和蛋白回收率(43.9%)顯著高于其他蛋白酶水解物，但其ACE抑制率較低(47.1%)。木瓜蛋白酶水解物的水解度(33.3%)和蛋白回收率(17.8%)較低，但其ACE抑制率卻處于較高水平(70.7%)。復(fù)合蛋白酶水解物的ACE抑制率最高(85.7%)，水解度(32.5%)和蛋白回收率(40.6%)也處于較高水平。因此，選用復(fù)合蛋白酶水解棉籽蛋白制備ACE抑制肽。進(jìn)一步優(yōu)化復(fù)合蛋白酶水解時間和加酶量，結(jié)果如圖2。由圖2(a)可知，隨著水解時間的延長，蛋白回收率緩慢增加，而ACE抑制率在1～5 h內(nèi)不斷升高，在5 h時達(dá)到最大值，隨后略微降低。當(dāng)加酶量不斷增加時，蛋白回收率不斷升高，但ACE抑制率先升高后降低。當(dāng)復(fù)合蛋白酶加酶量為1 500 U/g，水解pH值為8.0，溫度為55 ℃，水解時間為5 h時，ACE抑制率最高，為93.7%，蛋白回收率為39.8%[圖2(b)]。因此，在復(fù)合蛋白酶的最適pH值和溫度下，加酶量為1500 U/g，水解棉籽蛋白5 h，棉籽蛋白水解物(質(zhì)量濃度為2 mg/mL)的ACE抑制率為93.7%。

表2 棉籽蛋白不同蛋白酶水解物的水解度、蛋白回收率和ACE抑制率Tab.2 Effects of proteases on degree of hydrolysis, protein recovery rate, and ACE inhibitory activity of cottonseed protein hydrolysates

圖2 復(fù)合蛋白酶水解時間和加酶量對棉籽蛋白水解物的蛋白回收率和ACE抑制率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time and protamex concentration on protein recovery rate and ACE inhibitory activity of cottonseed protein hydrolysates

本研究中，復(fù)合蛋白酶水解物的ACE抑制率高于de Oliveira Filho等[7]和Gao等[11]研究中木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶水解棉籽蛋白的ACE抑制率(55%～74%)。風(fēng)味蛋白酶具有內(nèi)切酶和外切酶的作用特性，酶切位點廣泛，可產(chǎn)生小肽和游離氨基酸[7,12]。風(fēng)味蛋白酶的水解效率較高，但過度酶切導(dǎo)致水解物的ACE抑制率顯著低于其他蛋白酶水解物[13]。風(fēng)味蛋白酶的酶切特性導(dǎo)致肽段羧基端的疏水性氨基酸較少，如Leu、Ile、Val，而這些氨基酸是ACE抑制肽的重要組成[14]，因此，風(fēng)味蛋白酶不適用于制備ACE抑制肽。Margatan等[15]研究發(fā)現(xiàn)，木瓜蛋白酶僅部分選擇性水解棉籽蛋白中的7S球蛋白，導(dǎo)致水解度和蛋白回收率較低。復(fù)合蛋白酶和堿性蛋白酶均為內(nèi)切酶，堿性蛋白酶的酶切位點主要是羧基端的疏水性氨基酸，而復(fù)合蛋白酶具有更廣泛的酶切位點，可以切割肽鍵和螺旋結(jié)構(gòu)中的氫鍵，進(jìn)而產(chǎn)生具有較高活性的中小型ACE抑制肽[7,12]。綜合文獻(xiàn)報道和棉籽蛋白不同蛋白酶水解物的實驗結(jié)果，本研究選用復(fù)合蛋白酶水解棉籽蛋白。

2.2 棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物的分離及肽段鑒定結(jié)果

不同數(shù)目的*表示水解組分(F1～F5)間的差異顯著(P<0.05)。圖3 棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物的分離組分及其ACE抑制活性Fig.3 Fractions of cottonseed protein hydrolysate prepared by protamex and their ACE inhibitory activities

利用液相色譜分離棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物，得到5個水解組分(F1、F2、F3、F4、F5)，分析各組分的ACE抑制活性，結(jié)果如圖3。由圖3(b)可見，各水解組分的ACE抑制活性具有顯著性差異(P<0.05)，其中，F(xiàn)1組分的ACE抑制活性最低(IC50=599.8 μg/mL)，F(xiàn)2、F3和F5組分的活性較為相近(IC50≈316.8 μg/mL)，而F4組分的ACE抑制活性最高(IC50=220.1 μg/mL)。經(jīng)質(zhì)譜(圖4)和AHTpin數(shù)據(jù)庫分析，F(xiàn)4組分的251條肽段中發(fā)現(xiàn)3條具有ACE抑制活性且尚未被報道的肽段：VFNNNPQE、LLSQTPRY和VFPGCPET。雖然3條肽段的分子質(zhì)量較為相近，且肽鏈長度相同，但表現(xiàn)出不同的ACE抑制活性(P<0.05)(表3)，其中，LLSQTPRY具有較高的ACE抑制活性(IC50=105.2 μmol/L)。

圖4 棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物中F4組分的質(zhì)譜總離子流圖Fig.4 Total ion chromatography of fraction 4 from cottonseed protein hydrolysate prepared by protamex

表3 3種棉籽蛋白活性肽的分子質(zhì)量和ACE抑制活性Tab.3 Molecular weights and ACE inhibitory activities of three peptides from cottonseed protein hydrolysate prepared by protamex

目前，常用超濾、凝膠層析和離子交換色譜等方法對水解物進(jìn)行分離純化，富集ACE抑制肽。Gao等[8,11]利用木瓜蛋白酶水解棉籽蛋白，通過超濾結(jié)合凝膠層析的方法分離水解物，得到ACE抑制活性較高的組分(分子質(zhì)量為0.8～2.4 kDa，IC50=159 μg/mL)；利用反相高效液相色譜結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜，進(jìn)一步純化鑒定，發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量為 763 Da 的肽段FPAIGMK具有較高的ACE抑制活性。Ma等[16]利用堿性蛋白酶水解辣木葉蛋白，超濾分離水解物后，收集ACE抑制率(84.7%)較高的水解組分(分子質(zhì)量<1 kDa)進(jìn)行肽段鑒定，發(fā)現(xiàn)2條新型ACE抑制肽：LGF(IC50=153.7 μmol/L)和GLFF(IC50=139.2 μmol/L)。雖然，上述研究通過蛋白酶水解制備新型ACE抑制肽，但其活性均低于本研究發(fā)現(xiàn)的LLSQTPRY。ACE抑制肽一般由2～20個氨基酸組成[17]，羧基端具有疏水性氨基酸(Trp、Leu、Ile等)，氨基端具有脂肪族氨基酸(Val、Leu、Pro、Ile、Ala、Met)。帶正電的氨基酸(Lys、Arg、His)容易接近ACE羧基端活性口袋中帶負(fù)電的Glu403和Glu162，從而抑制ACE活性[18]，而位于羧基端第三位的Pro可通過疏水作用力與ACE活性中心結(jié)合，抑制ACE活性[19]。本研究中，VFNNNPQE、LLSQTPRY和VFPGCPET氨基端由脂肪族氨基酸構(gòu)成，羧基端第三位為Pro，其中，LLSQTPRY含有帶正電的Arg。由于親水性氨基酸(Asn、Tyr、Thr)的存在，3條ACE抑制肽的活性均低于FPAIGMK[8]。然而，LLSQTPRY的ACE抑制活性卻高于大豆蛋白和菜籽蛋白等同類蛋白源ACE抑制肽的活性[18,20]。

2.3 棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物的體外消化吸收穩(wěn)定性分析

利用人工胃腸液結(jié)合Caco-2細(xì)胞單層膜模型，評價棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物的體外消化吸收穩(wěn)定性，結(jié)果如圖5。由圖5可見，水解物經(jīng)人工胃腸液消化和Caco-2細(xì)胞單層膜轉(zhuǎn)運吸收后，ACE抑制率顯著降低(P<0.05)。經(jīng)人工胃液消化后，水解物的ACE抑制率由93.7%降低至68.4%，經(jīng)人工腸液進(jìn)一步消化，最終產(chǎn)物的ACE抑制率為53.8%。利用Caco-2細(xì)胞單層膜模型分析水解物在小腸上皮細(xì)胞的吸收作用發(fā)現(xiàn)，水解物可被刷狀緣膜中的細(xì)胞肽酶降解，導(dǎo)致ACE抑制率顯著降低(P<0.05)，但仍保持一定ACE抑制活性(20.5%)，水解物濃度對轉(zhuǎn)運吸收作用并無顯著性影響(P>0.05)。

不同數(shù)目的*表示樣品間的顯著性差異(P<0.05)。CPH- P，棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物；CPH- PP，棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物經(jīng)人工胃液消化；CPH- PPT，棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物經(jīng)人工胃腸液消化；CPH- PH，質(zhì)量濃度為2 mg/mL棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物經(jīng)Caco-2細(xì)胞單層膜轉(zhuǎn)運吸收處理；CPH- PL，質(zhì)量濃度為1 mg/mL棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物經(jīng)Caco-2細(xì)胞單層膜轉(zhuǎn)運吸收處理。圖5 棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物的體外消化吸收穩(wěn)定性Fig.5 In vitro digestion and absorption stabilities of cottonseed protein hydrolysate prepared by protamex

由于消化類蛋白酶和細(xì)胞肽酶可降解活性肽為短肽或游離氨基酸，許多ACE抑制肽進(jìn)行體內(nèi)實驗后活性減弱，甚至喪失。ACE抑制肽普遍以水解物形式口服進(jìn)入人體，需要克服消化道酶和腸道黏膜等一系列屏障，以活性形式轉(zhuǎn)運至體液循環(huán)發(fā)揮生理作用。本研究中，棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物經(jīng)體外模擬消化后，ACE抑制率降低，這與小麥面筋蛋白水解物和酪蛋白水解物結(jié)果類似[21-22]。對于消化率較低的蛋白質(zhì)而言，適度酶解可為后續(xù)胃腸消化激發(fā)ACE抑制肽釋放奠定良好基礎(chǔ)。Vermeirssen等[22]和郝欣悅等[23]研究發(fā)現(xiàn)，由于胃蛋白酶和胰蛋白酶可將大分子肽降解，米糠蛋白堿性蛋白酶水解物和瑞士乳桿菌干酪水解物的ACE抑制活性和多肽含量在體外模擬消化后顯著增加。研究表明，ACE抑制肽的小腸吸收機(jī)制主要包括載體介導(dǎo)主動轉(zhuǎn)運、細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運和胞飲轉(zhuǎn)運。盡管吸收效率可能受到肽鏈長度、疏水性和表面電荷等因素的影響，但肽鏈長度是最關(guān)鍵的因素[24]。本研究中，棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物中ACE抑制肽多具有較長肽鏈，難以完整地穿過腸上皮細(xì)胞屏障，限制其在Caco-2細(xì)胞單層膜上的轉(zhuǎn)運吸收。水解物易被刷狀緣膜中的肽酶降解為游離氨基酸[25]，ACE抑制活性降低至20.5%。實驗所用的Caco-2細(xì)胞單層膜比人體腸道細(xì)胞更為致密，阻礙部分活性序列轉(zhuǎn)運吸收[22]，因此，本研究中的棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物經(jīng)實際體內(nèi)吸收后，也可能表現(xiàn)出較高的ACE抑制活性。

3 結(jié) 論

本研究通過復(fù)合蛋白酶水解棉籽蛋白制備ACE抑制肽，經(jīng)酶解條件優(yōu)化，提高水解物ACE抑制率至93.7%。通過高效液相色譜分離和質(zhì)譜鑒定，發(fā)現(xiàn)3條新型ACE抑制肽：VFNNNPQE、LLSQTPRY和VFPGCPET，其中LLSQTPRY的ACE抑制活性最高(IC50=105.2 μmol/L)。棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物經(jīng)人工胃腸液消化和Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運吸收后，仍保留一定ACE抑制活性。后期可利用微膠囊化技術(shù)，通過篩選壁材、調(diào)整芯壁比、優(yōu)化制備方法及條件等，提高棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物及其ACE抑制肽穩(wěn)定性和生物利用率。鑒于新型ACE抑制肽較高的活性及其生物利用率，棉籽蛋白復(fù)合蛋白酶水解物有望作為功能性食品配料，為降壓食品的開發(fā)及產(chǎn)業(yè)化提供依據(jù)。