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    榆干離褶傘溶栓酶對(duì)高脂血癥大鼠血管內(nèi)皮的保護(hù)作用

    2023-02-09 07:25:44李芳芳張蕊萌沈明花
    關(guān)鍵詞:高脂血癥脂質(zhì)內(nèi)皮

    蘇 新,李 鈺,李芳芳,張蕊萌,沈明花

    (延邊大學(xué) 醫(yī)學(xué)院, 吉林 延吉 133002)

    高脂血癥是以血脂水平異常升高為主要特征的代謝性疾病。正常生理狀態(tài)下,脂類的分解與合成處于動(dòng)態(tài)平衡,長期的高脂肪飲食可導(dǎo)致機(jī)體脂類代謝紊亂,是引發(fā)高脂血癥的重要因素之一。先前的研究表明,脂肪的過量攝入會(huì)促進(jìn)機(jī)體氧自由基的生成,誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)[1],影響血管內(nèi)皮的結(jié)構(gòu)和功能[2-3],增加動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)。因此,降低血脂、保護(hù)血管內(nèi)皮是預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的有效途徑。目前,對(duì)于高脂血癥的治療,核心措施是調(diào)整生活方式聯(lián)合藥物治療,其中最為常用的藥物是他汀類降脂藥[4];但在長期或大量服用他汀類藥物后會(huì)產(chǎn)生肝毒性、肌肉不適等不良反應(yīng)[5]。因此,尋找具有降脂作用或具有血管內(nèi)皮保護(hù)作用的天然產(chǎn)物具有重要的意義。

    榆干離褶傘(Lyophyllumulmarium)又名大榆蘑、榆生離褶傘,屬擔(dān)子菌亞門、層菌綱、口蘑科、離褶傘屬,分布于我國河北、吉林、黑龍江等地,具有保肝[6]、抗炎[7]、溶栓[8]等作用。在前期工作中從榆干離褶傘菌絲體中分離純化了分子質(zhì)量為50 kDa的溶栓酶。榆干離褶傘溶栓酶(Lyophyllumulmariumfibrinolytic enzyme,LUFE)通過提高抗氧化酶活性,抑制脂質(zhì)過氧化,減輕酒精誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷[9]。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,LUFE可以抑制酒精所致的脂類代謝紊亂,降低血脂,減輕大鼠酒精性肝損傷[10]。LUFE有降血脂、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用,但是LUFE對(duì)高脂血癥誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用還有待進(jìn)一步探究。本研究擬通過高脂飲食建立高脂血癥大鼠模型,探究LUFE對(duì)高脂血癥所致血管內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用,并初步探討其作用機(jī)制,以期為榆干離褶傘的功能性食品開發(fā)提供理論依據(jù)和參考。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼料

    雄性SD大鼠[SYXK(吉)2020-0009]70只,體質(zhì)量(150±10)g,延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有實(shí)驗(yàn)操作通過延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),倫理編號(hào):20222400。SD大鼠飼養(yǎng)在溫度20~25 ℃、濕度50%~60%、環(huán)境清潔、無噪聲、光照周期晝夜交替12 h的環(huán)境下。高脂飼料由延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心配制,組成成分見表1。

    表1 高脂飼料成分及比例Tab.1 Composition and proportion of high-fat diet %

    1.2 材料與試劑

    根據(jù)參考文獻(xiàn)[11]從榆干離褶傘菌絲體中分離純化獲得LUFE。根據(jù)前期研究結(jié)果,選取LUFE干預(yù)劑量為400 mg/(kg·d)[6,8,10]。阿托伐他汀鈣片,齊魯制藥有限公司;白糖、豬油、雞蛋,購自當(dāng)?shù)爻?;膽固醇、?;悄懰徕c、丙基硫氧嘧啶、飽和油紅O染色液、核蛋白提取試劑盒,北京索萊寶科技有限公司;總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、過氧化氫酶(CAT)、6-酮前列腺素F1α(6-keta-PGF1α)、內(nèi)皮素-1(ET-1)、丙二醛(MDA)試劑盒,南京建成生物工程研究所;高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒,上海酶聯(lián)生物科技有限公司;超氧化物歧化酶2(SOD2)試劑盒,碧云天生物科技有限公司;核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)抗體,北京博奧森生物技術(shù)有限公司;乙酰化超氧化物歧化酶2[Ac-SOD2(Lys68)]抗體,江蘇親科生物研究中心有限公司;超氧化物歧化酶2(SOD2)抗體、PCNA抗體,沈陽萬類生物科技有限公司;血紅素加氧酶-1(HO-1)抗體、沉默信息調(diào)節(jié)因子3(Sirt3)抗體、β-actin抗體,美國Cell Signaling Technology公司。

    1.3 儀器與設(shè)備

    BX53F型顯微鏡,日本OLYMPUS公司;RT- 2100型酶標(biāo)儀,深圳雷杜公司;Azure C280型凝膠成像儀,美國Bio-Rad公司。

    1.4 實(shí)驗(yàn)方法

    1.4.1動(dòng)物分組及處理

    取70只SD大鼠隨機(jī)分為4組,正常對(duì)照組、模型組、陽性對(duì)照組、LUFE組,除陽性對(duì)照組10只,其余每組各20只。觀察大鼠飲食飲水情況、精神狀態(tài)、有無大鼠死亡,并記錄大鼠體質(zhì)量。正常對(duì)照組喂養(yǎng)普通飼料,其余組根據(jù)體質(zhì)量給予高脂飼料75 g/kg。LUFE組同時(shí)按體質(zhì)量灌胃生理鹽水溶解的LUFE(400 mg·kg-1·d-1),其余各組給予等量生理鹽水。實(shí)驗(yàn)4周后,除陽性對(duì)照組,每組各隨機(jī)抽取10只大鼠禁食12 h,根據(jù)體質(zhì)量腹腔注射7 mL/kg烏拉坦麻醉,腹主動(dòng)脈取血并分離取出主動(dòng)脈弓至髂主動(dòng)脈部分。陽性對(duì)照組于實(shí)驗(yàn)第5周開始每日灌胃生理鹽水溶解的阿托伐他汀鈣片5 mg·kg-1·d-1,其余各組大鼠的處理方式不變。實(shí)驗(yàn)8周后,大鼠禁食12 h,根據(jù)體質(zhì)量腹腔注射7 mL/kg 烏拉坦麻醉,腹主動(dòng)脈取血并分離取出主動(dòng)脈弓至髂主動(dòng)脈部分。將血液于4 ℃靜置 30 min,2 000 r/min 離心20 min,小心吸取上層血清至1.5 mL離心管中分裝備用。將主動(dòng)脈置于生理鹽水中清洗干凈,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.4.2主動(dòng)脈組織形態(tài)學(xué)檢測

    截取主動(dòng)脈弓下方1.5 cm處的胸主動(dòng)脈置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛中固定,脫水、包埋,蘇木精- 伊紅(HE)染色,于400倍光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

    1.4.3主動(dòng)脈油紅O染色

    使用眼科剪將全段主動(dòng)脈縱向剖開,置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛中室溫固定10 min,生理鹽水漂洗,浸于45 ℃預(yù)熱的油紅O工作液中10 min,經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精分化至正常乳白色,觀察主動(dòng)脈脂質(zhì)斑塊的分布情況,使用image j圖像分析軟件測定脂質(zhì)斑塊及主動(dòng)脈的面積,并計(jì)算脂質(zhì)斑塊分布的相對(duì)面積(斑塊總面積與血管總面積比值)。

    1.4.4血清生理生化指標(biāo)檢測

    取1.4.1節(jié)制備的血清,按照試劑盒說明書測定血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、MDA、ET-1、6-keta-PGF1α水平以及CAT、SOD2活性。

    1.4.5Western blot檢測

    將主動(dòng)脈截取50 mg,按照每1 mg動(dòng)脈組織加入10 μL蛋白裂解液于冰上勻漿,裂解30 min,經(jīng)4 000 r/min離心5 min,獲取總蛋白提取液。另取動(dòng)脈70 mg,按照核蛋白提取試劑盒的步驟分別在相對(duì)應(yīng)的步驟中加入300 μL磷酸鹽緩沖液、200 μL漿蛋白抽提試劑、60 μL核蛋白抽提試劑,于4 ℃以4 000 r/min離心10 min,獲取核蛋白提取液。

    采用BCA法對(duì)總蛋白、核蛋白提取液進(jìn)行定量。蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉- 聚丙烯酰胺凝膠電泳,電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉溶液封閉1 h,洗膜,加入相應(yīng)一抗,4 ℃孵育過夜,洗膜后加入二抗室溫孵育1 h,加入顯影液進(jìn)行曝光。

    據(jù)了解,中央新聞紀(jì)錄廠20世紀(jì)50年代的老資料《第一屆人大通過憲法》10 s的價(jià)格是1 200元,1957年拍攝的《一個(gè)小鎮(zhèn)的變化》資料反映的是湖南吉首50年代發(fā)展與變遷,每分鐘的價(jià)格是4 500元。因此可以看出時(shí)間老、年代久遠(yuǎn)的資料也是十分珍貴的。它代表著一種積淀與厚度,是價(jià)值生命力的充分體現(xiàn)。

    1.5 動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)計(jì)算

    根據(jù)式(1)計(jì)算SD大鼠動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)(AI)。

    (1)

    式(1)中,c(TC)為血清中TC濃度,mmol/L;c(HDL-C)為血清中HDL-C濃度,mmol/L。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)單因素方差分析、t檢驗(yàn)分析,P<0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,應(yīng)用GraphPad Prism 6.0軟件作圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 LUFE對(duì)大鼠體質(zhì)量影響

    LUFE對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2。由表2可知,各組大鼠初始體質(zhì)量無顯著差異。實(shí)驗(yàn)中觀察各組大鼠基本狀態(tài)并記錄體質(zhì)量,飲食誘導(dǎo)4周后,正常對(duì)照組大鼠食欲良好、精神活潑,體質(zhì)量稍有增加。與正常對(duì)照組相比,模型組與陽性對(duì)照組大鼠狀態(tài)未見明顯異常,體質(zhì)量增長顯著(P<0.05);而LUFE組大鼠體質(zhì)量顯著低于模型組與陽性對(duì)照組(P<0.05)。誘導(dǎo)8周后,與正常對(duì)照組相比,模型組大鼠體質(zhì)量增長顯著(P<0.01),陽性對(duì)照組與LUFE組大鼠體質(zhì)量顯著低于模型組(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,長期高脂飲食可造成大鼠體質(zhì)量增加,阿托伐他汀鈣片與LUFE可以控制大鼠體質(zhì)量的顯著增長。

    表2 LUFE對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響Tab.2 Effect of LUFE on body mass of rats

    2.2 LUFE對(duì)高脂血癥大鼠胸主動(dòng)脈組織形態(tài)的影響

    大鼠主動(dòng)脈形態(tài)檢測結(jié)果如圖1。由圖1可知,飲食誘導(dǎo)4周后,正常對(duì)照組、LUFE組大鼠胸主動(dòng)脈組織結(jié)構(gòu)均未見明顯異常,模型組大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜可見輕度增厚,未見顯著的病理性變化。誘導(dǎo)8周后,正常對(duì)照組大鼠胸主動(dòng)脈形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,血管內(nèi)皮連續(xù)光滑。模型組大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜增厚、不連續(xù),內(nèi)皮細(xì)胞脫落,內(nèi)膜中膜界限不清。與模型組相比,LUFE組與陽性對(duì)照組胸主動(dòng)脈損傷明顯減輕,內(nèi)膜連續(xù),未見內(nèi)皮細(xì)胞脫落。

    左側(cè)為管腔,紅色箭頭指示血管內(nèi)皮細(xì)胞脫落處。圖放大倍率為400倍。圖1 LUFE對(duì)高脂血癥大鼠主動(dòng)脈形態(tài)的影響Fig.1 Effects of LUFE on aortic morphology in hyperlipidemia rats

    A為正常對(duì)照組,B為模型組,C為陽性對(duì)照組,D為LUFE組。與正常對(duì)照組比較,*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01);與模型組比較,#表示差異顯著(P<0.05),##表示差異極顯著(P<0.01);n=5。圖2 LUFE對(duì)高脂血癥大鼠主動(dòng)脈脂質(zhì)斑塊分布的影響Fig.2 Effect of LUFE on lipid plaque distribution in aorta of hyperlipidemia rats

    2.3 LUFE對(duì)高脂血癥大鼠主動(dòng)脈脂質(zhì)斑塊分布的影響

    油紅O染色結(jié)果見圖2。由圖2可知,飲食誘導(dǎo)8周后,正常對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)側(cè)平整光滑,無脂質(zhì)沉積。模型組大鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)膜增厚、粗糙,可見大面積脂質(zhì)斑塊沉積,觸及質(zhì)硬、無彈性。與模型組相比,LUFE組與陽性對(duì)照組的動(dòng)脈質(zhì)地柔軟,少量脂質(zhì)斑塊沉積。使用image j圖像分析軟件分析主動(dòng)脈沉積斑塊面積,與正常對(duì)照組相比,模型組脂質(zhì)斑塊分布的相對(duì)面積極顯著升高(P<0.01)。而與模型組相比,LUFE組與陽性對(duì)照組脂質(zhì)斑塊分布的相對(duì)面積極顯著降低(P<0.01)。

    2.4 LUFE對(duì)高脂血癥大鼠血脂代謝的影響

    血清TC、TG、 LDL-C 、HDL-C常被認(rèn)為是衡量體內(nèi)血脂水平的指標(biāo)[12],根據(jù)其計(jì)算的AI值常被用來評(píng)價(jià)動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)程度[13]。大鼠血脂和AI檢測結(jié)果如圖3和圖4。由圖3和圖4可知,高脂飲食4、8周后,與正常對(duì)照組相比,模型組大鼠表現(xiàn)為高脂血癥血脂特征,AI值和血清TC、TG、LDL-C水平均極顯著升高(P<0.01),HDL-C水平無顯著變化(P>0.05)。與模型組相比,LUFE組大鼠AI值和血清TC、TG、LDL-C水平均不同程度下降,HDL-C的水平無顯著變化(P>0.05)。與模型組相比,陽性對(duì)照組AI值和血清TC、TG水平顯著降低,血清LDL-C、HDL-C水平無顯著變化(P>0.05)。與陽性對(duì)照組相比,LUFE組大鼠AI值和血清TG、LDL-C水平均不同程度下降,說明LUFE和阿托伐他汀鈣片具有降脂、降低高脂血癥大鼠進(jìn)一步發(fā)展為動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)的作用,且LUFE作用較為顯著。

    圖3 LUFE對(duì)高脂血癥大鼠血脂代謝的影響Fig.3 Effect of LUFE on lipid metabolism of hyperlipidemia rats

    A為正常對(duì)照組,B為模型組,C為陽性對(duì)照組,D為LUFE組。與正常對(duì)照組比較,*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01);與模型組比較,#表示差異顯著(P<0.05),##表示差異極顯著(P<0.01);與陽性對(duì)照組比較,△表示差異顯著(P<0.05),△△表示差異極顯著(P<0.01)。圖4 LUFE對(duì)高脂血癥大鼠AI的影響Fig.4 Effect of LUFE on AI of hyperlipidemia rats

    2.5 LUFE對(duì)高脂血癥大鼠血清氧化應(yīng)激水平的影響

    高脂血癥會(huì)導(dǎo)致機(jī)體氧化- 抗氧化水平失衡[3]。位于線粒體中的錳超氧化物歧化酶(MnSOD)即SOD2,是超氧化物歧化酶的3種存在方式之一,可催化超氧陰離子轉(zhuǎn)化為H2O2和O2,H2O2可被過CAT分解為H2O和O2,從而起到清除ROS的作用[14]。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的主要產(chǎn)物,具有細(xì)胞毒性[15-16],是機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志物之一。

    大鼠血清抗氧化酶活性和MDA水平檢測結(jié)果如表3。由表3可知,飲食誘導(dǎo)4周后,與正常對(duì)照組相比,模型組大鼠血清MDA水平和SOD2、CAT活力無顯著變化,這可能與高脂飲食處理時(shí)間較短有關(guān)。與模型組相比,LUFE組大鼠血清MDA、SOD2、CAT水平無顯著變化。飲食誘導(dǎo)8周后,與正常對(duì)照組相比,模型組大鼠血清MDA水平顯著升高,SOD2、CAT活力顯著降低,說明血脂異??蓪?dǎo)致機(jī)體氧化—抗氧化系統(tǒng)失衡。與模型組相比,LUFE組、陽性對(duì)照組MDA水平顯著下降,SOD2、CAT活力顯著升高。結(jié)果表明阿托伐他汀鈣片或LUFE干預(yù)能夠緩解大鼠的氧化應(yīng)激損傷。

    表3 LUFE對(duì)高脂血癥大鼠血清氧化應(yīng)激的影響Tab.3 Effect of LUFE on oxidative stress in serum of hyperlipidemia rats

    2.6 LUFE對(duì)高脂血癥大鼠血清ET-1和6-keta-PGF1α水平的影響

    正常生理?xiàng)l件下血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌多種血管活性因子來維持內(nèi)皮的生理功能,如ET-1、一氧化氮(NO)、前列環(huán)素(PGI2)、血栓素A2(TXA2)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ),此類物質(zhì)之間的動(dòng)態(tài)平衡可以調(diào)節(jié)血管張力、維持血管正常生理功能[17]。血脂異常通常會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、內(nèi)皮功能障礙、多種血管活性因子分泌失調(diào)[17-19]。大鼠血清ET-1和6-keta-PGF1α水平如表4。由表4可知,與正常對(duì)照組相比,以高脂飲食誘導(dǎo)4、8周的模型組大鼠血清ET-1水平均顯著升高,誘導(dǎo)8周后模型組大鼠6-keta-PGF1α水平極顯著下降(P<0.01);與模型組相比,高脂飲食誘導(dǎo)4、8周的LUFE組大鼠血清ET-1水平均極顯著下降(P<0.01)。誘導(dǎo)8周后LUFE組大鼠血清6-keta-PGF1α水平極顯著升高(P<0.01);與模型組相比,陽性對(duì)照組大鼠血清ET-1水平極顯著降低,血清6-keta-PGF1α水平極顯著升高(P<0.01)。結(jié)果顯示,LUFE和阿托伐他汀鈣片可能通過調(diào)節(jié)血管活性物質(zhì)的水平,以維持血管內(nèi)皮功能。

    表4 LUFE對(duì)高脂血癥大鼠血清中ET-1和6-keta-PGF1α水平的影響Tab.4 Effect of LUFE on levels of ET-1 and 6-keta-PGF1α in serum of hyperlipidemia rats

    2.7 LUFE對(duì)高脂血癥大鼠主動(dòng)脈蛋白表達(dá)水平的影響

    A為正常對(duì)照組,B為模型組,C為陽性對(duì)照組,D為LUFE組。與正常對(duì)照組比較,*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01);與模型組比較,#表示差異顯著(P<0.05),##表示差異極顯著(P<0.01);與陽性對(duì)照組比較,△表示差異顯著(P<0.05),△△表示差異極顯著(P<0.01)。圖5 LUFE對(duì)高脂血癥大鼠主動(dòng)脈蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of LUFE on protein expression in aorta of hyperlipidemia rats

    大鼠主動(dòng)脈蛋白表達(dá)水平檢測結(jié)果如圖5。由圖5可知,高脂飲食誘導(dǎo)4、8周后,與正常對(duì)照組相比,模型組大鼠主動(dòng)脈Nrf2、Sirt3、HO-1及核內(nèi)Nrf2(Nuc-Nrf2)的蛋白表達(dá)極顯著下降(P<0.01),Ac-SOD2(Lys68)蛋白表達(dá)極顯著升高(P<0.01)。與模型組相比,LUFE組和陽性對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈Nrf2、Sirt3、HO-1及Nuc-Nrf2的蛋白表達(dá)顯著升高,Ac-SOD2的相對(duì)蛋白表達(dá)極顯著降低(P<0.01)。與陽性對(duì)照組相比,LUFE組大鼠主動(dòng)脈Nrf2(P<0.01)、Sirt3(P<0.01)、HO-1(P<0.05)蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05,P<0.01)。研究結(jié)果說明LUFE和阿托伐他汀鈣片對(duì)血管內(nèi)皮的保護(hù)作用可能與激活Nrf2及其下游相關(guān)蛋白有關(guān),且LUFE對(duì)Nrf2及其下游相關(guān)蛋白的影響更為顯著。

    3 討 論

    在高脂血癥中,血漿脂質(zhì)水平異常也表現(xiàn)為血漿脂蛋白水平的異常,其中低密度脂蛋白(LDL)水平的升高是誘發(fā)血管內(nèi)皮受損、導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵因素。高脂肪、高熱量飲食導(dǎo)致血脂升高,體內(nèi)游離脂肪酸增多,通過激活煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶及降低內(nèi)皮型一氧化氮合酶的活性,增加血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS的生成[20-21]。ROS的產(chǎn)生誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng),導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血管壁通透性改變,加速低密度脂蛋白(LDL)顆粒向動(dòng)脈內(nèi)膜下遷移,LDL被ROS氧化修飾后形成氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)[22-23]。內(nèi)皮細(xì)胞上的凝集素樣特異性受體1(LOX1)特異性識(shí)別、吞噬ox-LDL,誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞脂質(zhì)蓄積、連接屏障受損[24],進(jìn)一步加速了血管內(nèi)皮的損傷,促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。因此,降低血脂、改善氧化應(yīng)激狀態(tài)對(duì)保護(hù)血管內(nèi)皮和預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生尤為重要。

    本研究通過高脂飲食誘導(dǎo)高脂血癥大鼠模型,以LUFE分別干預(yù)4、8周后,觀察LUFE對(duì)高脂血癥大鼠的血管內(nèi)皮保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,LUFE干預(yù)后減少大鼠動(dòng)脈內(nèi)膜的病理性損傷及脂質(zhì)沉積,降低血清TC、TG、LDL-C水平和AI值,說明LUFE具有降低血脂、抑制脂代謝紊亂、降低動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn);但是對(duì)于LUFE的干預(yù)作用是否具有時(shí)間依賴性,仍需進(jìn)一步探討。

    SOD、MDA、CAT是反映機(jī)體氧化還原水平的指標(biāo)[15]。本研究中模型組大鼠血清MDA水平升高,血清SOD2、CAT活性降低,表明高脂血癥可引起機(jī)體抗氧化能力的降低。LUFE干預(yù)降低大鼠血清MDA水平,升高大鼠血清SOD2、CAT活性,表明可以通過提高抗氧化酶活性,降低脂質(zhì)過氧化水平,從而減少高脂血癥大鼠血管內(nèi)皮的氧化損傷。ET-1是由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的多肽、具有強(qiáng)效縮血管作用[25]。研究發(fā)現(xiàn),ET-1可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞LOX1與ox-LDL的結(jié)合,加速血管內(nèi)皮功能紊亂[26]。前列環(huán)素(PGI2)是由內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的一種生物活性物質(zhì),具有擴(kuò)血管、抗血小板聚集的作用,因PGI2在體內(nèi)極不穩(wěn)定,故多采取測定其產(chǎn)物6-keta-PGF1α的含量來反映體內(nèi)PGI2的水平[27]。本研究中高脂血癥大鼠ET-1水平升高、6-keta-PGF1α水平下降,表明高脂血癥可影響大鼠血管收縮能力,影響內(nèi)皮功能。LUFE干預(yù)降低ET-1水平,升高6-keta-PGF1α水平,表明LUFE具有舒張血管和保護(hù)血管內(nèi)皮作用。有研究報(bào)道,在尼古丁誘導(dǎo)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型中,LUFE干預(yù)降低ET-1水平而升高PGI2水平,這與本研究結(jié)果相一致[28]。

    Nrf2是細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)中重要的轉(zhuǎn)錄因子[29]。正常生理狀態(tài)下,Nrf2在胞漿中以非活性形式存在[29]。當(dāng)Nrf2被激活后,可轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核,進(jìn)而調(diào)控下游抗氧化酶和II相解毒酶,如SOD、CAT、HO-1等靶基因的轉(zhuǎn)錄[30],清除氧自由基,抵御氧化損傷。Sirt3是位于線粒體中的一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性脫乙酰酶[31],可以介導(dǎo)SOD2的去乙?;?,以此達(dá)到清除ROS的作用[32]。據(jù)報(bào)道,Nrf2可調(diào)控Sirt3蛋白的表達(dá)水平[33],這可能與Nrf2亞基和Sirt3的啟動(dòng)子結(jié)合有關(guān)[34]。研究結(jié)果表明:模型組大鼠Nrf2、Sirt3、HO-1、SOD2、CAT水平均明顯低于正常對(duì)照組,Ac-SOD2相對(duì)蛋白表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組;與模型組相比,經(jīng)LUFE干預(yù)后,大鼠主動(dòng)脈Nrf2、Sirt3、HO-1蛋白表達(dá)均上調(diào),Ac-SOD2相對(duì)蛋白表達(dá)明顯降低,血漿SOD2、CAT活性明顯上升,提示LUFE保護(hù)血管內(nèi)皮的機(jī)制可能與激活Nrf2及其下游相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)。

    4 結(jié) 論

    本研究利用LUFE對(duì)高脂血癥大鼠進(jìn)行干預(yù),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,給予LUFE干預(yù)后可以有效地控制大鼠體質(zhì)量的增長,降低血脂,減輕動(dòng)脈內(nèi)膜的病理性損傷及脂質(zhì)沉積。Western blot結(jié)果顯示,LUFE可以通過激活Nrf2信號(hào)通路來減輕氧化應(yīng)激損傷。LUFE對(duì)高脂血癥所致的血管內(nèi)皮損傷具有保護(hù)作用。后續(xù)將對(duì)LUFE抗氧化及調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用展開進(jìn)一步研究,以期為推出食用菌相關(guān)的功能性食品提供更多理論依據(jù)。

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