LncRNA MEG3調(diào)控microRNA-181b-5p/TIMP3對(duì)前列腺癌細(xì)胞侵襲、遷移的影響

梁紫積，陳楚義

[深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院，香港中文大學(xué)(深圳)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院泌尿外科,廣東深圳 518172]

前列腺癌(prostate cancer，PC)是一種威脅全球男性健康的常見惡性腫瘤，晚期患者癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是造成患者死亡的主要原因，目前尚無針對(duì)其治療的有效方法，因此了解其轉(zhuǎn)移及治療機(jī)制，對(duì)患者的生存至關(guān)重要[1-2]。大量研究顯示，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)影響腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移，在包括PC在內(nèi)的多種腫瘤中具有抑癌或促癌作用[3]。母系表達(dá)基因3(maternally expressed gene 3，MEG3)作為多種癌癥的抑癌基因，在PC組織及癌細(xì)胞中表達(dá)異常下調(diào)，其過表達(dá)可顯著抑制PC細(xì)胞(DU 145細(xì)胞)的增殖、侵襲及遷移能力[3-4]。微小RNA(microRNA,miR)可通過與其靶基因3’非翻譯區(qū)結(jié)合來調(diào)控基因表達(dá)，從而參與癌癥轉(zhuǎn)移，研究表明，抑制miR-181b-5p表達(dá)可抑制PC細(xì)胞(PC3細(xì)胞)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及侵襲[1]。組織金屬蛋白酶抑制因子3(tissue Inhibitor of Metalloproteinase 3，TIMP3)是miR-181b-5p的靶基因，抑制miR-181b-5p/TIMP3軸可阻礙PC細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移[5]。目前關(guān)于MEG3在PC細(xì)胞轉(zhuǎn)移機(jī)制中的研究知之甚少，因此，本研究通過探究MEG3調(diào)控miR-181b-5p/TIMP3軸對(duì)PC細(xì)胞侵襲、遷移的影響，為PC轉(zhuǎn)移及治療機(jī)制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器LipofectamineTM2000 Transfection Reagent[11668019，朗智(上海)生物科技有限公司]；RPMI 1640培養(yǎng)基、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒(SP1413、SS0901，北京碩華佰奧生物科技有限公司)；蛋白提取試劑盒(zk7795，深圳子科生物科技有限公司)；雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒[LF004，亞太恒信生物科技(北京)有限公司]；兔抗β-actin、TIMP3、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)、Anti-rabbit IgG，HRP-linked Antibody、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP9)抗體(4970、5673、4022、7074、13667，Cell Signaling Technology)；MTT檢測(cè)試劑盒(BYT0005，上海三抒生物科技有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(R3563，北京康瑞納生物科技有限公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)試劑盒(貨號(hào)：T427S/L，廣州英贊生物科技有限公司)；博日熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)LineGene 9600 Plus(FQD-96A，杭州博日科技股份有限公司)；InvitrogenQuickGel6200凝膠成像系統(tǒng)(DH.WGD00020，上海連橋生物科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1臨床樣本獲取 收集2019年12月—2021年12月本院所收治的20例PC患者的PC組織及其對(duì)應(yīng)的癌旁組織。患者平均(57.30±6.07)歲。經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者全部知情，并簽署同意書。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 將人正常前列腺上皮細(xì)胞系(P69)和PC細(xì)胞系(DU145、LNCaP、PC3、22Rv1)接種到RPMI 1640培養(yǎng)基(體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清)37 ℃培養(yǎng)(體積分?jǐn)?shù)5%CO2)，待細(xì)胞匯合到約80%時(shí)胰酶消化、傳代。

1.2.3分組及轉(zhuǎn)染 于6孔板中接種PC3細(xì)胞(2×105個(gè)/孔)培養(yǎng)24 h后，分為對(duì)照組(未處理)、pcDNA3.1-NC組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NC)、pcDNA3.1-MEG3組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MEG)、pcDNA3.1-MEG3+miR-NC組(pcDNA3.1-MEG3與miR-NC共轉(zhuǎn)染)、pcDNA3.1-MEG3+ miR-181b-5p mimic組(pcDNA3.1-MEG3與miR-181b-5p mimic共轉(zhuǎn)染)，使用LipofectamineTM2 000試劑盒分別將50 ng的pcDNA3.1-NC、pcDNA3.1-MEG3及100 nmol/L的miR-NC、miR-181b-5pmimics轉(zhuǎn)染至各組的PC3細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h，qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。

1.2.4qRT-PCR檢測(cè)MEG3及miR-181b-5p的表達(dá) 按Trizol法提取P69、DU145、LNCaP、PC3、22Rv1細(xì)胞總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再根據(jù)qRT-PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增(GAPDH、U6分別為MEG3及miR-181b-5p內(nèi)參，表1)，2-ΔΔCt分析MEG3及miR-181b-5p表達(dá)水平(n=5)。1.2.5MTT法檢測(cè)PC3細(xì)胞活力 于96孔板中接種轉(zhuǎn)染后的各組PC3細(xì)胞(2×104個(gè)/孔、200 μL/孔)，培養(yǎng)48 h后添加20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，4 h后棄培養(yǎng)液，添加DMSO 150 μL搖晃震蕩至結(jié)晶溶解，在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定吸光度值(A490)，細(xì)胞存活率(%)=[(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(對(duì)照組A值-空白組A值)]×100%，重復(fù)5孔。

表1 qRT-PCR引物

1.2.6Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PC3細(xì)胞侵襲能力 Matrigel膠包被上室，孵育24 h后，于含200 μL無血清培養(yǎng)基的上室接種轉(zhuǎn)染后的PC3細(xì)胞(4×104個(gè)/孔)，下室添加200 μL RPMI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后經(jīng)PBS沖洗，棉簽擦去上室未穿膜細(xì)胞，15 min無水乙醇固定后進(jìn)行結(jié)晶紫染色(30 min)，隨機(jī)選5個(gè)視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)(n=5)。

1.2.7劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PC3細(xì)胞遷移能力 于6孔板中接種轉(zhuǎn)染后的PC3細(xì)胞(2×105個(gè)/孔)，24 h后使用200 μL的槍頭在6孔板底部進(jìn)行劃痕，PBS清洗后觀察0 h與24 h細(xì)胞遷移距離，計(jì)算遷移率=[(0 h寬度-24 h寬度)/0 h寬度] ×100%，重復(fù)5孔。

1.2.8Western blot檢測(cè)PC3細(xì)胞TIMP3、MMP9、MMP2蛋白表達(dá) 蛋白裂解液裂解轉(zhuǎn)染后的PC3細(xì)胞(20 min)，并提取總蛋白，使用BCA法定量，SDS-PAGE電泳分離蛋白，低溫下轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜，在50 g/L的脫脂奶粉封閉液中封閉，4 ℃搖床上孵育兔抗TIMP3、MMP9、MMP2、β-actin抗體(1∶2 000)，過夜后常溫孵育2 h二抗(1∶3 000)，使用ECL發(fā)光液在成像儀中顯影，計(jì)算TIMP3、MMP9、MMP2蛋白表達(dá)(n=5)。

1.2.9雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)MEG3、miR-181b-5p、TIMP3的靶向關(guān)系 使用starBase網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-181b-5p分別與MEG3、TIMP3的結(jié)合位點(diǎn)；擴(kuò)增MEG3、TIMP3分別與miR-181b-5p結(jié)合的3’-UTR片段，與pmirGLO載體連接：構(gòu)建pmirGLO-MEG3-wt、pmirGLO-TIMP3-wt野生型載體；使用定點(diǎn)突變技術(shù)將結(jié)合片段突變，構(gòu)建pmirGLO-MEG3-mut、pmirGLO-TIMP3-mut突變型載體。將PC3細(xì)胞分為pmirGLO-MEG3-wt+miR-181b-5p mimics組、pmirGLO-MEG3-wt+miR-NC組、pmirGLO-MEG3-mut+miR-181b-5p mimics組、pmirGLO-MEG3-mut+miR-NC組、pmirGLO-TIMP3-wt +miR-181b-5p mimics組、pmirGLO-TIMP3-wt+ miR-NC組、pmirGLO-TIMP3-mut+ miR-181b-5p mimics組、pmirGLO-TIMP3-mut+miR-NC組，將miR-NC、miR-181b-5p mimics分別與各重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至PC3細(xì)胞中，24 h后使用雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒檢測(cè)海腎及螢火蟲熒光值(海腎熒光值為內(nèi)參)，計(jì)算PC3細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1 MEG3在PC組織和癌旁組織中表達(dá)水平的比較與癌旁組織相比，MEG3在前列腺癌組織中表達(dá)顯著降低(0.37±0.05vs.1.00±0.04，P<0.05，圖1)。

2.2 MEG3在人正常前列腺上皮細(xì)胞系(P69)和PC細(xì)胞系(DU145、LNCaP、PC3、22Rv1)表達(dá)水平的比較與在P69細(xì)胞中的表達(dá)(1.00±0.01)相比，MEG3在DU145(0.81±0.10)、LNCaP(0.63±0.09)、PC3(0.31±0.06)、22Rv1(0.76±0.12)細(xì)胞中表達(dá)顯著降低，其中在PC3細(xì)胞中降低最為顯著(P<0.05)，故選取PC3細(xì)胞開展后續(xù)研究。

2.3 MEG3過表達(dá)對(duì)MEG3、miR-181b-5p、TIMP3蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組相比，pcDNA3.1-NC組MEG3、miR-181b-5p及TIMP3蛋白表達(dá)差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，pcDNA3.1-MEG3組miR-181b-5p表達(dá)顯著降低，MEG3、TIMP3蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05，表2、圖2)。

*與癌旁組織相比，P<0.05;n=20。

表2 MEG3過表達(dá)對(duì)MEG3、miR-181b-5p、TIMP3表達(dá)的影響

A：對(duì)照組；B：pcDNA3.1-NC組；C：pcDNA3.1-MEG3組。

2.4 各組PC3細(xì)胞存活率比較與對(duì)照組相比，pcDNA3.1-NC組PC3細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，pcDNA3.1-MEG3組細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)；與pcDNA3.1-MEG3組相比，pcDNA3.1-MEG3+miR-NC組細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，pcDNA3.1-MEG3+ miR-181b-5p mimic組細(xì)胞存活率顯著增加(P<0.05，表3)。

2.5 各組PC3細(xì)胞侵襲情況比較與對(duì)照組相比，pcDNA3.1-NC組PC3細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，pcDNA3.1-MEG3組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05)；與pcDNA3.1-MEG3組相比，pcDNA3.1-MEG3+miR-NC組侵襲細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，pcDNA3.1-MEG3+ miR-181b-5p mimic組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.05，表3、圖3)。

表3 各組PC3細(xì)胞存活及侵襲情況比較

A：對(duì)照組；B：pcDNA3.1-NC組；C：pcDNA3.1-MEG3組；D：pcDNA3.1-MEG3+miR-NC組；E：pcDNA3.1-MEG3+ miR-181b-5p mimic組。

2.6 各組PC3細(xì)胞遷移情況比較與對(duì)照組相比，pcDNA3.1-NC組PC3細(xì)胞遷移率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，pcDNA3.1-MEG3組遷移率顯著降低(P<0.05)；與pcDNA3.1-MEG3組相比，pcDNA3.1-MEG3+miR-NC組遷移率無顯著差異(P>0.05)，pcDNA3.1-MEG3+ miR-181b-5p mimic組遷移率顯著增加(P<0.05，表3、圖4)。

A：對(duì)照組；B：pcDNA3.1-NC組；C：pcDNA3.1-MEG3組；D：pcDNA3.1-MEG3+miR-NC組；E：pcDNA3.1-MEG3+ miR-181b-5p mimic組。

2.7 各組PC3細(xì)胞MMP9、MMP2蛋白表達(dá)情況比較與對(duì)照組相比，pcDNA3.1-NC組PC3細(xì)胞MMP9、MMP2表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，pcDNA3.1-MEG3組MMP9、MMP2表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與pcDNA3.1-MEG3組相比，pcDNA3.1-MEG3+miR-NC組MMP9、MMP2表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，pcDNA3.1-MEG3+miR-181b-5p mimic組MMP9、MMP2表達(dá)顯著增加(P<0.05，表4、圖5)。

2.8 MEG3、miR-181b-5p、TIMP3靶向關(guān)系驗(yàn)證starBase網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-181b-5p與MEG3、TIMP3間均存在靶向關(guān)系(圖6A、B)。雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示：與pmirGLO-MEG3-wt+miR-NC組相比，pmirGLO-MEG3-wt+miR-181b-5p mimics組PC3細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，而pmirGLO-MEG3-mut+miR-181b-5p mimics組、pmirGLO-MEG3-mut+miR-NC組無顯著差異(P>0.05,圖7A)；與pmirGLO-TIMP3-wt+miR-NC組相比，pmirGLO-TIMP3-wt +miR-181b-5p mimics組PC3細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，而pmirGLO-TIMP3-mut+miR-181b-5p mimics組、pmirGLO-TIMP3-mut+miR-NC組無顯著差異(P>0.05,圖7B)。與對(duì)照組相比，miR-NC組TIMP3表達(dá)(0.52±0.10vs.0.53±0.08)無明顯變化(P>0.05)，而miR-181b-5p mimics組TIMP3表達(dá)(0.21±0.05vs.0.53±0.08 )顯著降低(P<0.05,圖8)。

表4 各組PC3細(xì)胞MMP9、MMP2的蛋白表達(dá)

A：對(duì)照組；B：pcDNA3.1-NC組；C：pcDNA3.1-MEG3組；D：pcDNA3.1-MEG3+miR-NC組；E：pcDNA3.1-MEG3+ miR-181b-5p mimic組。

A：miR-181b-5p與TIMP3的結(jié)合位點(diǎn)；B：miR-181b-5p與MEG3的結(jié)合位點(diǎn)。

A：MEG3與miR-181b-5p靶向關(guān)系驗(yàn)證(* 與pmirGLO-MEG3-wt+miR-NC組相比，P<0.05)；B：miR-181b-5p與TIMP3靶向關(guān)系驗(yàn)證(#與pmirGLO-TIMP3-wt+miR-NC組相比，P<0.05)。

A：對(duì)照組；B：miR-NC組；C：miR-181b-5p mimics組。

3 討 論

PC是男性最常見的一種惡性腫瘤疾病，也是全球癌癥相關(guān)的男性死亡的第二大主要原因[6-7]。由于PC發(fā)病的隱匿性，多數(shù)患者自初次確診時(shí)已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，而腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致PC患者死亡最主要的原因，因此，有效抑制PC細(xì)胞轉(zhuǎn)移是患者治愈的關(guān)鍵[8-9]。轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜過程，受多種因子及通路的調(diào)控，而目前關(guān)于PC轉(zhuǎn)移及治療機(jī)制的研究不甚清晰，因此還有待進(jìn)一步研究[10]。

大量數(shù)據(jù)證實(shí)，lncRNA在調(diào)節(jié)癌癥進(jìn)展過程中具有重要作用，MEG3已被報(bào)道在胃癌、PC等多種癌癥中具有抑癌作用[11-13]。MEG3在PC中異常下調(diào)，其過表達(dá)可通過抑制miR-9-5p/RNA結(jié)合蛋白QKI-5軸來抑制PC進(jìn)展[3]。MEG3可通過與zeste基因增強(qiáng)子同源物2(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)相結(jié)合來促進(jìn)同源異型盒基因EN2甲基化，從而抑制PC3細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及腫瘤發(fā)生，起到抑癌作用[14]。但MEG3在PC中的作用機(jī)制研究還不夠充分。本研究發(fā)現(xiàn)，MEG3在PC組織及癌細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào)，其過表達(dá)可顯著降低細(xì)胞存活率、侵襲細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞遷移率、MMP9和MMP2表達(dá)，該結(jié)果表明MEG3高表達(dá)可有效抑制PC細(xì)胞增殖、侵襲及遷移，與前人研究結(jié)果相一致，提示MEG3有作為PC轉(zhuǎn)移有效抑制靶點(diǎn)的潛能[3]。

miRNA已被證明可作為癌基因或抑癌因子來促進(jìn)或抑制侵襲性腫瘤表型，最近有研究發(fā)現(xiàn)，PC組織中多種miRNA存在差異表達(dá)[15]。研究證實(shí)，miR-181b-5p在PC細(xì)胞中表達(dá)異常升高，遷移和侵襲抑制蛋白MIIP可通過抑制miR-181a/b-5p表達(dá)來抑制PC3細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及侵襲[1]。本研究發(fā)現(xiàn)，MEG3過表達(dá)可顯著抑制miR-181b-5p表達(dá)，miR-181b-5p與MEG3間存在靶向關(guān)系，miR-181b-5p高表達(dá)則可逆轉(zhuǎn)MEG3過表達(dá)對(duì)PC-3細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的抑制作用，該結(jié)果表明，miR-181b-5p過表達(dá)具有促癌作用，與前人研究結(jié)果相一致[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，circSMARCA5可通過抑制miR-181b-5p-TIMP3軸來抑制PC細(xì)胞增殖及侵襲[5]。TIMP3作為一種金屬蛋白酶組織抑制劑，可抑制腫瘤遷移、侵襲[16]。TIMP3表達(dá)下調(diào)可加速PC腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移[5,17]，本研究發(fā)現(xiàn)，MEG3過表達(dá)可促進(jìn)PC-3細(xì)胞TIMP3表達(dá)，而miR-181b-5p過表達(dá)則可抑制TIMP3的表達(dá)，上述結(jié)果表明，MEG3過表達(dá)可能通過抑制miR-181b-5p來促進(jìn)TIMP3表達(dá)，從而抑制PC3細(xì)胞侵襲、遷移。

綜上所述，LncRNA MEG3在PC中低表達(dá)，lncRNA MEG3過表達(dá)可通過抑制miR-181b-5p/TIMP3軸來抑制PC細(xì)胞侵襲、遷移。本研究不僅對(duì)PC轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究具有一定參考價(jià)值，還對(duì)其治療機(jī)制的研究具有重要意義，但本研究目前的研究?jī)?nèi)容尚不深入，有待后期深入驗(yàn)證。