PBRM1缺失通過TNF-α/exosome信號(hào)軸促進(jìn)腎癌細(xì)胞PD-L1分泌

謝宏俊，谷孝云，王 軻，簡(jiǎn)琰琳，李 磊，賀大林，徐 珊

(1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科；2.環(huán)境和疾病相關(guān)基因教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室腫瘤研究室；3.陜西省腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710061；4.陜西省衛(wèi)生健康信息中心，陜西西安 710002)

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)，簡(jiǎn)稱腎癌，是起源于泌尿小管上皮的腎實(shí)質(zhì)惡性腫瘤。世界衛(wèi)生組織2020年發(fā)布癌癥數(shù)據(jù)，亞洲新增腎癌患者和死亡病例分別占36.9%和45.2%[1-2]，我國(guó)近年來腎癌發(fā)病率以2%～4%的速度呈逐年上升趨勢(shì)[3-4]。

PBRM1位于3p21染色體上，是腎透明細(xì)胞癌中的第2大突變基因[5]。VARELA等[6]證實(shí)PBRM1蛋白是SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物蛋白之一，參與基因表達(dá)調(diào)控。在腎透明細(xì)胞癌中，PBRM1蛋白丟失與腫瘤的分級(jí)分期及患者生存期相關(guān)[7-8]。HAKIMI等[9]研究結(jié)論認(rèn)為PBRM1突變(PBRM1突變主要導(dǎo)致PBRM1蛋白表達(dá)丟失)并不影響存活率。LIU等[10]臨床研究報(bào)告顯示，700多例PBRM1突變患者免疫治療反應(yīng)不良，但MIAO等[11]結(jié)合100例腎透明細(xì)胞癌患者RNA-seq和臨床免疫治療結(jié)果分析得出，PBRM1突變患者擁有較好的免疫臨床治療效果。PBRM1突變是否與免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療響應(yīng)相關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。

程序性死亡配體-1(programmed death-ligand1,PD-L1)是免疫治療臨床檢測(cè)指標(biāo)，雖然不是精準(zhǔn)的檢測(cè)指標(biāo)，但臨床免疫治療獲益的主要人群還是PD-L1高表達(dá)患者。本研究擬明確PBRM1和PD-L1在腎癌腫瘤組織中的表達(dá)相關(guān)性，探討相關(guān)分子機(jī)制，為腎癌臨床免疫治療提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料HK-2、786-O、Caki-1和769-P細(xì)胞系(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)；腎癌腫瘤組織芯片(上海芯超)；胎牛血清(南美胎牛血清)；RPMI1640培養(yǎng)基(Sigma公司)；胰酶和PBS緩沖液(賽維爾)；PBRM1單克隆抗體(Abcam 生物技術(shù)公司)、PD-L1單克隆抗體(Cell Signaling Technology)、β-actin單克隆抗體(愛必信上海生物科技)、CD9單克隆抗體(Cell Signaling Technology)、CD63多克隆抗體(上海Abcam 生物技術(shù)公司)；exoEasy Maxi Kit，貨號(hào)#76064。

1.2 方 法

1.2.1免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果判定和分析方法

本研究中對(duì)90例腎透明細(xì)胞癌和90例配對(duì)癌旁組織進(jìn)行免疫組化染色，PBRM1細(xì)胞核染色棕黃色為免疫組化染色陽性，細(xì)胞核著色數(shù)目百分比<25%時(shí)獲得1分，25%～<50%之間獲得2分，50%～<75%之間獲得3分，75%～100%之間(包含75%)獲得4分。細(xì)胞核著色強(qiáng)度執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為：0表示無染色，1表示弱陽性，2表示中度染色，3表示強(qiáng)陽性染色。

PD-L1免疫組化染色陽性判定：細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜呈現(xiàn)棕黃色。使用3D掃描儀配套的分析軟件對(duì)陽性深淺和多少進(jìn)行打分。用組織化學(xué)評(píng)分(H-SCORE)處理免疫組化結(jié)果，將每張切片內(nèi)陽性的細(xì)胞數(shù)量及其染色強(qiáng)度轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的數(shù)值，達(dá)到對(duì)組織染色半定量的目的。H-SCORE=弱陽性細(xì)胞百分比×1+中陽性百分比×2+強(qiáng)陽性百分比×3。

1.2.2TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)提取、分析及富集分析

The Cancer Genome Atlas(TCGA，https://www.cancer.gov/tcga)數(shù)據(jù)庫，對(duì)1 744例患者進(jìn)行PBRM1基因突變數(shù)據(jù)分析。下載611例腎透明細(xì)胞癌患者的突變數(shù)據(jù)、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)，患者分為野生型PBRM1(PBRM1WT)和突變型PBRM1(PBRM1MT)兩組。使用生存及survminer軟件包進(jìn)行兩組患者生存分析。使用edgeR和clusterProfiler軟件包進(jìn)行基因集富集分析，明確腎癌患者PBRM1WT和PBRM1MT兩組之間通路的改變。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng) HK-2、786-O、Caki-1和769-P使用體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清于RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.4外泌體提取和鑒定 收集細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)基經(jīng)0.8 μm無菌濾器過濾，按照體積比1∶1添加XBP緩沖液。取16 mL樣品混合物加入到exoEasy內(nèi)置柱，500 g(離心力)離心1 min。丟棄廢液，將內(nèi)置柱重新放回收集管中。加入10 mL XWP緩沖液，5 000 g離心5 min，丟棄廢液和收集管。將內(nèi)置柱轉(zhuǎn)移到新的無菌收集管中。加入400 μL Buffer XE，孵育1 min。500 g離心5 min，收集洗脫液。外泌體稀釋1 000倍之后用Zeta view 儀器對(duì)濃度、大小以及粒徑分布進(jìn)行檢測(cè)，用免疫印跡法檢測(cè)外泌體生物標(biāo)志物CD63和CD9的表達(dá)，并用透射電子顯微鏡對(duì)外泌體形態(tài)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5免疫印跡 RIPA裂解液裂解細(xì)胞獲取總蛋白[12]，30 μg/孔上樣，體積分?jǐn)?shù)為12.5%的SDS-PAGE 90-120V電泳、110 V電壓轉(zhuǎn)膜，20 g/L脫脂牛奶室溫封閉1 h。一抗PBRM1抗體(1∶1 000)、PD-L1抗體(1∶1 000)、β-actin抗體(1∶1 000)、CD9抗體(1∶1 000)、CD63抗體(1∶1 000)孵育，4 ℃過夜。TBST漂洗10 min，共3次。二抗辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔(1∶1 000)或羊抗鼠(1∶1 000)，室溫孵育1 h。TBST漂洗10 min，共3次，配制賽默飛顯色工作液，化學(xué)發(fā)光儀ChemiDoc XRS 顯色系統(tǒng)掃描顯色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)Graph Pad Prism軟件，Student’sttext檢驗(yàn)對(duì)兩組間差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 腎透明細(xì)胞癌組織PBRM1蛋白表達(dá)低于癌旁組織，與患者預(yù)后負(fù)相關(guān)90例(90例患者腎癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織)腎透明細(xì)胞癌組織芯片PBRM1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：PBRM1在細(xì)胞核表達(dá)(圖1A)。與癌旁組織相比，患者腫瘤組織PBRM1蛋白表達(dá)顯著低于癌旁組織(P<0.001)，PBRM1表達(dá)缺失率在腫瘤組織中為76.4%。患者生存分析結(jié)果顯示，PBRM1低表達(dá)患者總生存期短，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)TCGA官網(wǎng)530例腎透明細(xì)胞癌患者(611例患者中剔除了差異性較大的患者數(shù)據(jù))的RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，生存數(shù)據(jù)顯示，PBRM1低表達(dá)腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后差，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖1B)。

A：在腎透明細(xì)胞癌患者腫瘤組織和癌旁組織中PBRM1的表達(dá)代表圖；B：TCGA數(shù)據(jù)庫530例腎透明細(xì)胞癌患者的生存分析。

2.2 PD-L1在腎透明細(xì)胞癌中的病理學(xué)特征腎透明細(xì)胞癌組織芯片PD-L1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：PD-L1表達(dá)在腫瘤組織中顯著升高(圖2A、B，P=0.000 1)，PD-L1在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中均可見著色(圖2A)。在IHC染色過程中10塊組織塊部分(或完全)丟失不能納入進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析之中，以免疫組化平均值為分隔值，分為PD-L1低表達(dá)組(28例)和高表達(dá)組(52例)。患者生存分析顯示，PD-L1高表達(dá)組患者總生存期短，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.003 4，圖2C)。

A：PD-L1在腎透明細(xì)胞癌患者腫瘤組織中的表達(dá)代表圖；B：PD-L1在腎透明細(xì)胞癌患者癌旁組織和腫瘤組織表達(dá)；C：PD-L1表達(dá)高低對(duì)腎透明細(xì)胞癌患者總生存期的影響。

2.3 腎透明細(xì)胞癌PBRM1與PD-L1表達(dá)無相關(guān)性

對(duì)組織芯片中90例腎透明細(xì)胞癌患者PD-L1和PBRM1免疫組化染色評(píng)分相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，PBRM1和PD-L1的蛋白表達(dá)無相關(guān)性。如圖3A、B所示，以組織芯片編號(hào)F01A0200-B30-C1患者為例，PBRM1腫瘤組織染色無著色，PBRM1在癌旁組織著色清晰可見(圖3A)；同時(shí)PD-L1腫瘤組織有著色，而PD-L1在癌旁組織著色細(xì)胞較少(圖3B)。

2.4 腎透明細(xì)胞癌PBRM1突變激活腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎癥信號(hào)通路分析TCGA數(shù)據(jù)庫中1 744例腎透明細(xì)胞癌患者突變數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，用以評(píng)估腎透明細(xì)胞癌患者組織中PBRM1基因的突變率，數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示：PBRM1 突變率高達(dá)33%(圖4A)。GSEA hallmarks分析結(jié)果提示：腎透明細(xì)胞癌患者PBRM1突變后，腫瘤細(xì)胞炎癥通路被激活，如：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信號(hào)通路和TNF-α-NF κB信號(hào)通路(圖4B)。

A：F01A0200-B30-C1腎透明細(xì)胞癌患者腫瘤組織和癌旁組織PBRM1免疫組化染色結(jié)果代表圖；B：F01A0200-B30-C1腎透明細(xì)胞癌患者腫瘤組織和癌旁組織PD-L1免疫組化染色結(jié)果代表圖。

A：腎透明細(xì)胞癌患者PBRM1基因突變分析;B：腎透明細(xì)胞癌PBRM1突變患者激活腫瘤細(xì)胞炎癥相關(guān)信號(hào)通路。

2.5 TNF-α誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞外泌體包被PD-L1提取HK-2、786-O、Caki-1和769-P細(xì)胞培養(yǎng)基中的外泌體，免疫印跡均可檢測(cè)到外泌體生物標(biāo)志物CD63和CD9的表達(dá)(圖5A)。透射電子顯微鏡可檢測(cè)到786-O和769-P細(xì)胞培養(yǎng)基中外泌體的雙層囊膜結(jié)構(gòu)(圖5B)。用納米顆粒跟蹤分析儀ZetaView對(duì)外泌體濃度和大小進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，786-O和769-P細(xì)胞培養(yǎng)基外泌體平均直徑分別為197 nm和210 nm，濃度分別為：1.9×1010個(gè)/mL和1.8×1010個(gè)/mL(圖5C)。ZetaView儀器是單個(gè)粒子跟蹤功能的激光散射視頻顯微鏡，因視頻結(jié)果無法展示，故對(duì)786-O和769-P細(xì)胞培養(yǎng)基外泌體檢測(cè)結(jié)果視頻截圖進(jìn)行展示(圖5C)。免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)和TNF-α均可以誘導(dǎo)PD-L1蛋白表達(dá)升高(圖5D)。在外泌體包載蛋白檢測(cè)中，我們也發(fā)現(xiàn)外泌體PD-L1含量升高，其中TNF-α誘導(dǎo)PD-L1在外泌體中包載最多(圖5D)。圖5E免疫印跡結(jié)果顯示，抑制劑GW4869可以阻斷TNF-α誘導(dǎo)性的PD-L1外泌體分泌。

A：提取HK-2、786-O、Caki-1和769-P外泌體，免疫印跡檢測(cè)CD9和CD63的表達(dá)；B：透射電子顯微鏡觀察外泌體786-O和769-P的形態(tài)特征；C：786-O和769-P細(xì)胞外泌體濃度檢測(cè)；D：786-O和769-P細(xì)胞外泌體和細(xì)胞總蛋白PD-L1檢測(cè)；E：外泌體分泌抑制劑對(duì)PD-L1細(xì)胞外分泌的影響。TNF-α:腫瘤壞死因子；IL-6：白介素-6；IFN-γ:干擾素-γ。

3 討 論

PD-L1表達(dá)是患者免疫治療的必檢項(xiàng)目[13]，回顧PD-1/PD-L1藥物的臨床試驗(yàn)，幾乎所有的PD-1/PD-L1藥物的臨床試驗(yàn)都納入PD-L1表達(dá)檢測(cè)[14]。黑色素瘤、尿路上皮癌和頭頸鱗癌臨床研究結(jié)果顯示PD-L1表達(dá)與客觀緩解率或生存時(shí)間呈正相關(guān)[15-16]。隨著數(shù)據(jù)的不斷積累，臨床數(shù)據(jù)證實(shí)PD-L1并不是一個(gè)完美的標(biāo)志物，主要存在2方面的缺陷：①在某些癌種中，PD-L1的表達(dá)與臨床獲益無關(guān)。腎細(xì)胞癌的二線治療研究中，無論P(yáng)D-L1表達(dá)是否大于1%都能從納武單抗的治療中獲得中位總生存期的有效延長(zhǎng)[17]。②在同一癌種中，PD-L1表達(dá)作為診斷標(biāo)志物的預(yù)測(cè)性能仍然欠佳，主要表現(xiàn)為一部分PD-L1陰性的患者能夠從PD-1/L1藥物中獲益，而另一部分PD-L1陽性患者卻不能獲益[18]。PD-L1表達(dá)與患者免疫治療臨床獲益并不直接相關(guān)，為了明確矛盾產(chǎn)生的原因，我們分析PD-L1免疫檢測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，PD-L1表達(dá)檢測(cè)存在4方面的技術(shù)缺陷：①不同的檢測(cè)抗體，如帕姆單抗選擇22C3，納武單抗選擇28-8；②不同藥物/不同癌種對(duì)PD-L1納入免疫治療的閾值不一致；③染色系統(tǒng)不同，目前選擇的全自動(dòng)免疫組化系統(tǒng)分為Dako/羅氏兩大廠家，使得染色系統(tǒng)難以達(dá)成一致；④除檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的PD-L1表達(dá)，腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的PD-L1表達(dá)也與療效相關(guān)[15,19-20]。以上研究報(bào)道提示：PD-L1表達(dá)雖然不能精準(zhǔn)預(yù)測(cè)患者是否臨床獲益，但考慮其對(duì)免疫治療療效預(yù)測(cè)的重要性，為了達(dá)到療效的精準(zhǔn)預(yù)測(cè)，PD-L1表達(dá)結(jié)果最好與其他指標(biāo)進(jìn)行聯(lián)合，才能提高癌癥患者免疫治療預(yù)測(cè)的精準(zhǔn)性。

MIAO等[4]的研究結(jié)果顯示：PBRM1突變后引起IL-6-JAK-STAT3、TNF-α和IFN-γ途徑被激活，IFN-γ信號(hào)通路的上調(diào)增加了PD-L1表達(dá)，同時(shí)這些炎癥信號(hào)通路激活會(huì)引起炎癥因子表達(dá)，從而提高PBRM1突變腎透明細(xì)胞癌患者對(duì)PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑的臨床響應(yīng)[11]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PBRM1突變腎透明細(xì)胞癌患者生存期短，該結(jié)果也進(jìn)一步在腎透明細(xì)胞癌組織芯片中得到驗(yàn)證。分析公共TCGA腎透明細(xì)胞癌數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，PBRM1突變患者和野生型患者PD-L1 mRNA表達(dá)差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在90例腎透明細(xì)胞癌患者組織陣列樣本中，IHC結(jié)果同樣顯示PBRM1陰性和陽性樣本之間的PD-L1表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這些結(jié)果提示：PBRM1可能并非通過影響腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)而實(shí)現(xiàn)腎透明細(xì)胞癌患者免疫治療臨床響應(yīng)率的改變。

但是，關(guān)于PBRM1突變后引起IL-6-JAK-STAT3、TNF-α和IFN-γ信號(hào)通路被激活，我們和MIAO等[4]的研究結(jié)果一致。我們?cè)隗w外細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)中證實(shí)IL-6、TNF-α和IFN-γ中TNF-α可顯著增強(qiáng)PD-L1的表達(dá)，并且PD-L1被外泌體包載分泌到腫瘤細(xì)胞外。結(jié)果提示：PBRM1突變后導(dǎo)致患者腫瘤組織PBRM1蛋白染色缺失，并且在患者腫瘤組織中PBRM1與PD-L1表達(dá)無相關(guān)性，是因?yàn)镻BRM1突變激活炎癥因子信號(hào)通路，PD-L1表達(dá)上升，但被包載于外泌體中同時(shí)分泌到細(xì)胞外。與2018年《Naure》期刊報(bào)道在黑色素瘤患者外周血外泌體中檢測(cè)到PD-L1的結(jié)果一致[21]。綜上所述，PBRM1基因突變可作為腎癌患者臨床免疫治療的檢測(cè)參考指標(biāo)，但PBRM1影響免疫治療的分子機(jī)制還不明晰，有待進(jìn)一步深入研究。