載美洲大蠊提取物蛛絲蛋白膜的制備、表征及體外釋藥性和細(xì)胞毒性考察 Δ

曾惠娜 ，卿晨 ，薛楠楠 ，楊自忠 ，巫秀美 ，李和偉 ，趙昱 ，李啟艷 ， （1.大理大學(xué)云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗室，云南 大理 671000；2.大理大學(xué)藥用特種昆蟲開發(fā)國家地方聯(lián)合工程研究中心，云南 大理 671000；.大理大學(xué)中國西南藥用昆蟲及蛛形類資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，云南 大理 671000；.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京 21002；.云南省第一人民醫(yī)院牙周科，昆明 6002）

放化療性口腔黏膜炎是放化療常見的并發(fā)癥，其發(fā)病率已高達(dá)80%[1-2]，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和對放化療的耐受性?？谇火つぱ讓?dǎo)致患者主觀上逃避或拖延放化療，客觀上無法保證療效的正常發(fā)揮?？祻?fù)新液是美洲大蠊Periplaneta americana Linn.乙醇提取物的現(xiàn)代制劑，具有養(yǎng)陰生肌、通利血脈的功效，內(nèi)服可治療胃、十二指腸等消化道黏膜潰瘍，外用則可治療各類金瘡潰瘍、褥瘡[3]。有研究表明，康復(fù)新液用于防治、修復(fù)口腔潰瘍的療效確切，為臨床上治療放化療性口腔黏膜炎的經(jīng)驗用藥，一般采用含漱、涂抹、口服等方式給藥，但在潰瘍表面形成的藥物層易伴隨著吞咽動作被唾液逐漸沖刷帶走，難以長時間在潰瘍面停留[4-5]。因此，迫切需要將康復(fù)新液制備成可長期停留在潰瘍部位、對放化療性口腔黏膜炎療效確切且具緩釋性的口腔貼膜劑。

蜘蛛絲是由蜘蛛分泌的多種蛋白質(zhì)水溶液經(jīng)脫水后形成的固體纖維，其主要成分是蛋白質(zhì)。與其他動物所產(chǎn)絲不同，蛛絲蛋白氨基酸序列具有特殊的保守性和同一性。有研究指出，蜘蛛絲具有生物界內(nèi)最佳的人體生物相容性、低免疫原性、可調(diào)節(jié)性等，有望應(yīng)用于藥物傳遞領(lǐng)域[6-7]。基于此，本課題組選用天然蛛絲為原料，以美洲大蠊提取物為模型藥物，嘗試制備載美洲大蠊提取物的蛛絲蛋白膜，并對其進(jìn)行表征和體外釋藥性考察?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（上海儀昕科學(xué)儀器有限公司）、5700型傅里葉紅外光譜儀（美國Thermo Nicolet公司）、SDC-200型水接觸角實(shí)驗儀（東莞市晟鼎精密儀器有限公司）、DX-2700BH型X射線衍射儀（丹東浩元儀器有限公司）、Tescan Mira Lms型掃描電子顯微鏡（捷克TESCAN公司）、1260 Infinity Ⅱ型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）、Spectra Max M2型多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）、CKX41SF型倒置生物顯微鏡（日本Olympus公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

美洲大蠊提取物（批號20190316）由大理大學(xué)昆蟲生物醫(yī)藥研究院提供；肌苷（批號13J12C137495）購自上海源葉生物科技有限公司；敬釗纓毛蛛蛛絲（批號20200312）購自海南蛛王生物科技有限公司；六氟異丙醇（hexafluoroisopropanol，HFIP；批號20210325）購自上海鈺康生物科技有限公司；胎牛血清（批號1618862）購自美國Gibco公司；MEM培養(yǎng)基（批號20200701）購自武漢普諾賽生命科技有限公司；甲醇（批號207899）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；二甲基亞砜（批號D8371）、噻唑藍(lán)（批號715S01）均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 實(shí)驗細(xì)胞

小鼠成纖維L-929細(xì)胞（批號20211109）購自美國菌種保存中心。

2 方法與結(jié)果

2.1 載藥蛛絲蛋白膜的制備

稱取800 mg新鮮潔凈的敬釗纓毛蛛蛛絲，按質(zhì)量體積比1∶1（mg/mL）量取HFIP，倒入圓底燒瓶中，加熱回流使蛛絲充分溶解。將溶解后的蛛絲-HFIP溶液過濾，除去不溶性雜質(zhì)后，加熱濃縮得到25%原體積的蛛絲蛋白濃縮液。稱取160 mg美洲大蠊提取物，以5 mL HFIP溶解后與上述制備得到的蛛絲蛋白濃縮液進(jìn)行混合。將混合好的蛛絲蛋白-美洲大蠊提取物溶液倒入預(yù)先準(zhǔn)備好的成膜模具中，采用溶劑澆鑄法均勻成膜。在通風(fēng)櫥內(nèi)室溫條件下?lián)]干剩余溶劑，回軟揭膜，制備得到載美洲大蠊提取物的蛛絲蛋白膜（后文稱“載藥膜”）。同法制備不含美洲大蠊提取物的載藥材料基質(zhì)蛛絲蛋白膜（后文稱“空白膜”）。

2.2 膜劑的表征

2.2.1 靜態(tài)水接觸角測試 參照標(biāo)準(zhǔn)《GB/T 30693-2014 塑料薄膜與水接觸角的測量》測定樣品的靜態(tài)水接觸角。取載藥膜和空白膜各適量，將其裁剪成大小合適的受試樣品，置于藥品穩(wěn)定實(shí)驗箱（溫度為45.0 ℃，相對濕度為50%）平衡48 h；采用水滴法測試受試樣品的靜態(tài)水接觸角，水滴體積均為3 μL，在60 s內(nèi)觀察并測量受試樣品的水接觸角。每種樣品重復(fù)測量3次。結(jié)果顯示，空白膜與載藥膜的水接觸角均小于90°，且載藥膜小于空白膜，表明受試樣品具有一定的親水性。結(jié)果見圖1。

圖1 空白膜和載藥膜的靜態(tài)水接觸角圖

2.2.2 藥物負(fù)載分析 采用傅里葉紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）法對樣品進(jìn)行分析。將空白膜、載藥膜以及美洲大蠊提取物采用溴化鉀壓片法分別制備空白膜、載藥膜、美洲大蠊提取物樣品，設(shè)置掃描范圍為4 000～400 cm-1、分辨率為4 cm-1，每個受試樣品掃描32次，掃描結(jié)果見圖2。由圖2可知，載藥膜樣品與空白膜樣品在1 237 cm-1處均出現(xiàn)歸屬于β-折疊構(gòu)象的吸收峰[8-10]；美洲大蠊提取物中富含多肽類化合物，在1 500～1 700 cm-1酰胺區(qū)間有吸收；與空白膜相比，載藥膜和美洲大蠊提取物在1 406 cm-1均出現(xiàn)較明顯的多肽特征吸收峰。由此推測，載藥膜中含有美洲大蠊提取物，即藥物已成功負(fù)載于蛛絲蛋白膜中。

圖2 原料藥與膜劑的FTIR圖

2.2.3 膜劑晶型考察 采用X-射線衍射法（X-ray diffraction，XRD）分別對空白膜、載藥膜、美洲大蠊提取物進(jìn)行檢測。將美洲大蠊提取物用載玻片壓平，使其表面平整后置于載物臺上進(jìn)行測試；空白膜和載藥膜則直接放于載物臺上進(jìn)行測試。設(shè)置管電壓為40 kV，管電流為30 mA，掃描速度為4°/min，記錄掃描角度2θ為5°～60°時的衍射強(qiáng)度曲線，并繪制樣品的XRD圖譜（圖3）。由圖3可知，空白膜在10.5°、21.8°處出現(xiàn)明顯衍射峰；美洲大蠊提取物在22.2°、28.2°處出現(xiàn)衍射峰；載藥膜出現(xiàn)的衍射峰位置和個數(shù)與空白膜的衍射峰相同，但載藥膜在21°附近的衍射峰較空白膜強(qiáng)，應(yīng)歸于空白膜與美洲大蠊提取物特征峰疊加的綜合體現(xiàn)。

圖3 原料藥與膜劑的XRD圖

2.2.4 外觀形貌觀察 使用掃描電鏡（scanning electron microscopy，SEM）對空白膜、載藥膜進(jìn)行外觀形貌觀察。將空白膜和載藥膜分別裁剪成0.5 cm×0.5 cm面積大小的試樣，將試樣用導(dǎo)電膠粘在試樣臺上噴金處理，設(shè)置電壓為15 kV，調(diào)整圖像清晰度，觀察膜的微觀表面形貌。通過SEM觀察發(fā)現(xiàn)，空白膜和載藥膜均具有三維多孔結(jié)構(gòu)，各三維膜孔朝向不一。從圖4可看出，載藥膜膜孔表面出現(xiàn)均勻分散的白色物質(zhì)，可能是在振搖干燥成膜時，部分藥物分子隨溶劑揮發(fā)凝結(jié)并富集于膜孔邊緣；載藥膜表面無大量成團(tuán)塊的藥物分子簇沉積或析出，說明以該載藥量制備得到的載藥膜并未過載。

圖4 空白膜和載藥膜的SEM形貌圖

2.3 載藥膜的體外釋藥性考察

肌苷是美洲大蠊提取物中含量最高的指標(biāo)性成分之一[6]，故本文以其為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，采用高效液相色譜外標(biāo)法來確定美洲大蠊提取物高效液相色譜圖中肌苷所對應(yīng)的峰，并以肌苷峰面積對美洲大蠊提取物的含量進(jìn)行定量考察。

2.3.1 色譜條件 以Sepax HP-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱；以0.1%三氟乙酸溶液（A）-甲醇（B）為流動相進(jìn)行梯度洗脫（0～15 min，98%A→80%A；15～30 min，80%A→98%A）；流速為 0.5 mL/min；柱溫為30.0 ℃；檢測波長為254 nm；進(jìn)樣體積為10 μL。

2.3.2 溶液的制備 （1）美洲大蠊提取物溶液：精密稱量美洲大蠊提取物100.0 mg，用人工唾液配制成質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL的美洲大蠊提取物溶液[6，11-12]。（2）肌苷外標(biāo)溶液：精密稱取肌苷2.0 mg，用人工唾液配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的肌苷外標(biāo)溶液。（3）供試溶液：取“2.1”項下載藥膜5 mg，置于2 mL離心管中，加入1 mL人工唾液，超聲（頻率53 kHz，功率500 W，下同）30 min，即得供試溶液。（4）陰性對照溶液：取“2.1”項下空白膜5 mg，按“2.3.2（3）”項下方法制備陰性對照溶液。（5）空白對照溶液：取1 mL人工唾液，即得。

2.3.3 方法學(xué)考察 （1）專屬性考察：分別取“2.3.2”項下制備的美洲大蠊提取物溶液、肌苷外標(biāo)溶液、供試溶液、陰性對照溶液和空白對照溶液各適量，按照“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣檢測。結(jié)果顯示，供試溶液和美洲大蠊提取物溶液在相同保留時間存在相同的色譜峰，且陰性對照溶液、空白對照溶液不干擾美洲大蠊提取物的檢測（圖5）。（2）線性關(guān)系考察：取“2.3.2（1）”項下美洲大蠊提取物溶液，用人工唾液稀釋成質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的美洲大蠊提取物系列溶液，按照“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣檢測。以美洲大蠊提取物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、美洲大蠊提取物中肌苷對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制得標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=67.502x-0.342 9（R2=0.993 5）。該結(jié)果說明，以肌苷為標(biāo)志物繪制的美洲大蠊提取物在質(zhì)量濃度為0.2～1.2 mg/mL的范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。（3）精密度試驗：取“2.3.2（1）”項下的美洲大蠊提取物溶液，按“2.3.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，得峰面積的RSD為0.14%（n=6），說明儀器精密度良好。（4）重復(fù)性試驗：按“2.3.2（3）”項下方法平行制備6份供試溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣檢測，代入回歸方程計算得美洲大蠊提取物含量的RSD為0.37%（n=6），說明方法重復(fù)性良好。（5）穩(wěn)定性試驗：按“2.3.2（3）”項下方法制備供試溶液，分別于室溫下放置0、24、48 h時按“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣檢測，得峰面積的RSD為0.85%（n=3），說明室溫下供試溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。（6）加樣回收率試驗：稱取已知含量的載藥膜2.5 mg，共9份，分別按照處方原料量的150%、100%和50%加入美洲大蠊提取物，混合，各濃度平行制備3份，再按“2.3.2（3）”項下方法制備供試溶液，再按“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣檢測，計算加樣回收率。結(jié)果顯示，平均加樣回收率分別為100.75%、99.53%、100.51%，RSD分別為0.82%、0.81%、0.32%（n=3），說明方法準(zhǔn)確度良好。

圖5 各溶液專屬性考察高效液相色譜圖

2.3.4 膜劑載藥量測定 取載藥膜（1 cm×1 cm）在45 ℃條件下干燥至恒質(zhì)量（M1）；將其剪碎置于離心管中，并向管中添加10 mL的人工唾液，超聲30 min后于4 ℃下以5 000 r/min離心4 min，取上清液，按“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣檢測并代入回歸方程計算載藥膜中美洲大蠊提取物的含量（M2）；根據(jù)載藥量公式計算得該膜劑的載藥量：載藥量（%）=M2/M1×100%。經(jīng)計算，該膜劑載藥量為15%。

2.3.5 載藥膜體外釋藥實(shí)驗 將載藥膜裁剪成6張1 cm×1 cm大小的方形，分別放入6個形制相同的離心管中，各加入新鮮配制的（37.0±0.5）℃人工唾液1 mL，使得受試膜完全被人工唾液沒過，在轉(zhuǎn)速為50 r/min、溫度為（37.0±0.5）℃的條件下進(jìn)行釋藥實(shí)驗。設(shè)置累積釋藥時間為0、1、5、15、30、50、70、100、150、200 min。在每個釋藥時間點(diǎn)進(jìn)行釋藥液樣本取樣：將離心管中的釋藥液取盡后再向離心管內(nèi)添加等溫等體積的新鮮配制的人工唾液，繼續(xù)進(jìn)行釋藥實(shí)驗直至達(dá)到預(yù)設(shè)的累積釋藥時間。每個累積釋藥時間點(diǎn)的取樣操作均相同。按“2.3.1”項下色譜條件檢測釋藥液中的美洲大蠊提取物含量，并以6組釋藥實(shí)驗所得均值繪制釋藥曲線（圖6）。如圖6所示，載藥膜在人工唾液中具有一定的緩釋性能，可持續(xù)釋藥不低于200 min。在0～15 min時，藥物從膜中大量釋放，其釋藥百分率達(dá)到48%。結(jié)合“2.2.4”項下圖4B分析此階段可能是膜劑本身表面孔洞較大，溶劑易進(jìn)入膜孔，加之膜劑表層吸附的藥物大量溶解，藥物順濃度梯度擴(kuò)散，引起藥物大量釋放；在15～70 min時，釋藥速率變緩，推測該階段藥物釋放主要來源于膜劑內(nèi)部；而70～200 min階段的釋藥過程中，藥物的釋藥百分率僅為11.6%，經(jīng)前兩個階段的釋藥，此時膜中藥物較少，濃度差較低是導(dǎo)致該階段藥物釋放速率減緩的首要原因。

圖6 載藥膜在人工唾液中的釋藥曲線

2.4 載藥膜的體外細(xì)胞毒性考察

按照《GB/T 16886.5-2017醫(yī)療器械生物學(xué)評價第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗》的要求以體外細(xì)胞毒性實(shí)驗進(jìn)行膜劑的生物安全性評價。選用小鼠成纖維細(xì)胞L-929細(xì)胞株，以MTT法檢測空白膜和載藥膜的體外細(xì)胞毒性。將1×105個/mL的細(xì)胞懸液以每孔100 μL接種于96孔板中，設(shè)置5個實(shí)驗組，分別為受試組[樣品1（空白膜浸提液）、樣品2（載藥膜浸提液）、陽性對照組（0.1%二乙基二硫代氨基甲酸鋅溶液）、陰性對照組（高密度聚乙烯膜浸提液）]和空白對照組，每組設(shè)6個復(fù)孔。以含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基為溶劑，按6 cm2∶1 mL的浸提比例分別制備空白膜浸提液、載藥膜浸提液、高密度聚乙烯膜浸提液和0.1%二乙基二硫代氨基甲酸鋅溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)（37.0 ℃，5%CO2，相對濕度大于90%）培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)70%。用對應(yīng)組別的藥物分別處理細(xì)胞24 h，培養(yǎng)4 h后觀察各組細(xì)胞形態(tài)；繼續(xù)培養(yǎng)至24 h后，再次觀察細(xì)胞形態(tài)。完成觀察后棄培養(yǎng)液，每孔加20 μL MTT（5 mg/mL），置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后棄上清液，每孔加入100 μL二甲基亞砜，避光振蕩30 min后，在570 nm波長下測定光密度（OD）值并計算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率（%）=受試組OD值/空白對照組OD值×100%。以空白對照組的細(xì)胞活力為參比，若受試組的細(xì)胞活力＜空白對照組細(xì)胞活力的70%，即認(rèn)為受試樣品具有潛在的細(xì)胞毒性。

結(jié)果由圖7可見，L-929細(xì)胞在樣品1、樣品2中共孵育4 h后細(xì)胞密度可達(dá)到50%～60%；共孵育24 h后細(xì)胞密度可達(dá)到80%～90%，且各細(xì)胞生長狀態(tài)良好。除陽性對照組細(xì)胞在共孵育4 h后已呈現(xiàn)皺縮圓形之外，其他受試組細(xì)胞在共孵育4 h和24 h后均呈放射狀生長且輪廓清晰。MTT實(shí)驗結(jié)果顯示，樣品1、樣品2作用后的細(xì)胞增殖率分別為84.6%、79.4%（均大于70%）。可見，空白膜和載藥膜的浸提液均對L-929細(xì)胞無顯著的潛在細(xì)胞毒性，所制備的空白膜及載藥膜均符合標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)要求。

圖7 細(xì)胞在各樣品浸提液中培養(yǎng)4 h、24 h時的顯微圖（×10）

3 討論

市售治療口腔潰瘍的藥物多以地塞米松等激素類藥物為主，而康復(fù)新液是美洲大蠊乙醇提取物的現(xiàn)代化制劑?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，美洲大蠊提取物具有促進(jìn)傷口愈合與組織修復(fù)、增強(qiáng)免疫、改善微循環(huán)等作用；其富含小分子活性肽，對各類表皮或黏膜損傷可起到抗感染及免疫調(diào)節(jié)作用，具有一定的修復(fù)能力，臨床上常用于治療各種原因引起的口腔潰瘍，且療效顯著[13-14]。基于此，將美洲大蠊提取物制備成可以長期貼敷于潰瘍面，并能持續(xù)給藥的口腔膜劑是解決康復(fù)新現(xiàn)有劑型在口腔滯留時間短、藥物流失快的有效方法。蛛絲蛋白鏈具有獨(dú)特力學(xué)性能，不易發(fā)生形變，有良好的降解特性，降解緩慢，生物安全性高，因而蛛絲多孔支架被率先研究用于組織工程如人工心臟支架，以及用于醫(yī)美的線雕用材等[15-16]。

本研究通過溶劑澆鑄法制備載美洲大蠊提取物的蛛絲蛋白膜，并對其進(jìn)行表征，探討了載藥膜的體外釋放行為。結(jié)果表明，本研究所制備的載藥膜具有三維多孔結(jié)構(gòu)；在人工唾液中具有較好的緩釋性，可作為一種具優(yōu)異生物相容性的藥物緩釋載體，有望作為新型口腔膜及黏膜制劑等應(yīng)用于臨床。