重離子束輻照誘變選育嗜酸乳桿菌及微膠囊制備和穩(wěn)定性研究

毛 婷 穆永松 魏亞琴 陸 棟 張 梟 王治業(yè)*

(1.甘肅省科學院生物研究所，甘肅省微生物資源開發(fā)利用重點實驗室，蘭州 730000；2.甘肅華瑞農業(yè)股份有限公司，張掖 734500；3.中國科學院近代物理研究所，蘭州 730000，4.蘭州理工大學生命科學與工程學院，蘭州 730000)

嗜酸乳桿菌具有調節(jié)腸道菌群平衡、提高動物生產性能、增強免疫力等功能，是一種理想的微生態(tài)制劑[1]。由于嗜酸乳桿菌耐高溫性能不佳，生產和貯存過程中極易失活，而且受到宿主消化系統(tǒng)胃酸、膽鹽等的影響，其活菌數大幅下降，最終定植于腸道中的活菌數較少，限制了嗜酸乳桿菌在飼料中的應用[2]。提高嗜酸乳桿菌在腸道中的活菌數是目前的研究熱點也是急需解決的問題。

重離子束輻照技術是高效的物理誘變方法之一，是獲得嗜酸乳桿菌突變體的優(yōu)選方法。國內外有關重離子束輻照技術在優(yōu)良微生物篩選、輻照生物學效應及DNA損傷研究方面成果豐碩[3-4]。王雨辰等[5]在輻照劑量300 Gy下采用重離子束12C6+對植物乳酸菌進行輻照，篩選得到突變株產乳酸能力較原始菌株提高了42%。麻和平等[6]在輻照劑量300 Gy下采用重離子束輻照產細菌素植物乳桿菌Lp1，篩選得到的突變株以大腸埃希氏菌為指示菌的抑菌圈直徑比原始菌株擴大了20%。Hu等[7]在輻照劑量80 Gy下采用重離子束輻照嗜熱乳酸菌，經高通量篩選得到了1株L-(+)乳酸積累量顯著增加的突變株。不同菌株對于重離子束輻照敏感度不同，輻照效果也不同，因此需確定菌株的最優(yōu)輻照劑量，在最優(yōu)輻照劑量下篩選出耐高溫、穩(wěn)定性強的嗜酸乳桿菌。

嗜酸乳桿菌作為一種腸道益生菌，盡管在pH 3.0～3.5條件下的酸耐受性較高，但是若不經包埋處理，口服嗜酸乳桿菌后，它們的活力也會受到影響，而嗜酸乳桿菌能否在腸道中定植及在腸道中的活菌數是影響菌株發(fā)揮益生作用的重要指標。微膠囊包埋就是利用天然的或者合成的高分子包囊材料，將固體的、液體的，甚至是氣體的微小囊核物質包覆形成的一種具有半透性或密封囊膜的微型膠囊[8]。微膠囊包埋材料分為蛋白質類、多糖類和纖維素類[9]，不同包埋材料對菌株包埋效果及作用機理都不同。

海藻酸鈉是使用最為廣泛的一種碳水化合物包埋材料，然而由于其包埋形成的微膠囊孔隙過大，所以需要進一步改善包埋材料配方，目前國內外研究主要是通過復配包埋和多層包埋方式進行微膠囊的包埋。復配包埋即采用2種或2種以上的壁材進行復配包埋，一般分為2種，一種是改變壁材的分子化學結構，另一種是不改變壁材的化學分子結構，2種壁材相互穿插纏繞形成更精密的結構。利用微膠囊技術將嗜酸乳桿菌包埋在壁材中，不僅可以增強菌株對不良環(huán)境的抵抗性，還能使微膠囊中的嗜酸乳桿菌在腸道適宜條件下快速釋放出來，提高嗜酸乳桿菌在腸道中的存活率，發(fā)揮嗜酸乳桿菌調節(jié)動物腸道菌群平衡、增強免疫力、提高生產性能的作用[10]。

本研究采用重離子束輻照技術和微膠囊包埋技術制備嗜酸乳桿菌突變株膠囊并研究其穩(wěn)定性，優(yōu)化嗜酸乳桿菌重離子束輻照的最優(yōu)輻照劑量，以及微膠囊包埋的最佳包埋材料，提高嗜酸乳桿菌在腸道中的活菌數，為嗜酸乳桿菌作為微生態(tài)制劑在飼料中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株的來源及培養(yǎng)

原始菌株：嗜酸乳桿菌4017(Lactobacillusacidophilus4017，La4017)分離于傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜中，保藏于工業(yè)微生物菌種保藏中心甘肅分中心，保藏號為CMCC 40526。

發(fā)酵培養(yǎng)基為乳酸細菌培養(yǎng)基(MRS)：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，K2HPO42 g，檸檬酸二胺2 g，乙酸鈉5 g，葡萄糖20 g，吐溫80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，H2O 1 000 mL[11]。

MRS篩選培養(yǎng)基：乳酸細菌培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基)中加入0.3%的膽鹽。

磷酸鹽緩沖液(PBS)：KH2PO40.24 g，Na2HPO41.44 g，NaCl 8 g，KCl 0.2 g，加去離子水充分攪拌溶解，加入濃鹽酸調pH至7.4，定容到1 L[12]。

模擬胃液：胃蛋白酶(1∶10 000)用滅菌后的PBS配制為濃度為1 mg/mL的胃蛋白酶溶液，用1 mol/mL的HCl溶液調節(jié)pH至3.0后，經0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后備用[13]。

模擬腸液：胰蛋白酶(1∶1 500)用滅菌后的PBS配制為濃度為1 mg/mL的胰蛋白酶溶液，用1 mol/mL的NaOH溶液調節(jié)pH至7.0后，經0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后備用[13]。

1.2 重離子束12C6+輻照誘變

將甘油法保藏的出發(fā)菌株La4017接種于MRS培養(yǎng)基，37 ℃恒溫厭氧活化48 h后，在無菌條件下將待輻照菌懸液1.5 mL置于35 mm無菌塑料平皿中，以封口膜密封，放入旋轉架上。利用中國科學院近代物理所重離子加速器(HIRFL)淺層輻照終端提供的80 MeV/u、劑量率20 Gy/min的12C6+重離子束進行輻照處理，輻照劑量分別為0(對照)、25、50、75、100、125、150、175 Gy，每個劑量設置3個平行。按照不同輻照劑量依次對菌株進行輻照，在輻照后的菌液中加入等量50%甘油，置于甘油管中-80 ℃冰箱保存[14]。

不同輻照劑量輻照后的菌懸液進行標準10倍濃度梯度稀釋，分別取稀釋度10-1～10-9倍的菌懸液0.1 mL均勻涂布于MRS培養(yǎng)基平板上，用封口膜封好，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每個梯度重復3次，統(tǒng)計平板菌落數，計算存活率，繪制致死曲線。

存活率(%)=(輻照處理平板上的活菌落數/未輻照的對照平板上的活菌落數)×100[15]。

1.3 突變株的篩選

將不同輻照劑量輻照后的菌懸液進行標準10倍濃度梯度稀釋，分別取稀釋度10-1～10-9倍的菌懸液0.1 mL均勻涂布于MRS篩選培養(yǎng)基平板上，用封口膜封好，置于37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)48 h，挑取平板上的突變株單菌落，將突變株接種于MRS篩選培養(yǎng)基中，40 ℃恒溫靜置培養(yǎng)48 h，檢測傳代前活菌數。菌液按照4%接種量在溫度40 ℃、培養(yǎng)時間48 h條件下連續(xù)傳代5次，檢測連續(xù)傳代5次后菌液菌落數，計算菌株存活率，篩選存活率≥90%的菌株。再將突變株培養(yǎng)溫度提高至44 ℃，連續(xù)傳代5次，篩選存活率≥90%的菌株，最終獲得在44 ℃下可穩(wěn)定生長的突變株[16]。

突變株存活率(%)=(連續(xù)傳代5次活菌落數/傳代前活菌落數)×100。

菌落數的測定采用稀釋涂布平板法，菌懸液進行標準10倍濃度梯度稀釋，分別取稀釋度10-4、10-5、10-6、10-7倍的菌液0.1 mL均勻涂布于MRS篩選培養(yǎng)基平板上，分別置于40和44 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每個梯度重復3次，統(tǒng)計平板菌落數。

1.4 突變株的遺傳穩(wěn)定性試驗

將最終獲得的在44 ℃下可穩(wěn)定生長的突變株接種于MRS篩選培養(yǎng)基中，44 ℃恒溫靜置培養(yǎng)48 h后檢測活菌數。連續(xù)傳代5次，分別檢測連續(xù)傳代1、2、3、4和5次時的活菌數，計算存活率，驗證突變株的遺傳穩(wěn)定性。

1.5 突變株微膠囊壁材的選擇及制備

選取海藻酸鈉、海藻酸鈉+明膠、海藻酸鈉+聚丙烯酰胺、海藻酸鈉+殼聚糖、海藻酸鈉+聚乙烯醇、海藻酸鈉+聚乙烯醇+活性炭6種不同配方的固定化材料對突變株進行包埋。6種固定化材料配制方法[17-18]分別如下。

1)海藻酸鈉：將4 g海藻酸鈉加入到100 mL蒸餾水中，90 ℃水浴加熱溶解，冷卻后備用。

2)海藻酸鈉+明膠：將2 g海藻酸鈉和2 g明膠加入到100 mL蒸餾水中，90 ℃水浴加熱溶解，冷卻后備用。

3)海藻酸鈉+聚丙烯酰胺：將2 g海藻酸鈉和2 g聚丙烯酰胺加入到100 mL蒸餾水中，90 ℃水浴加熱溶解，冷卻后備用。

4)海藻酸鈉+殼聚糖：將2 g殼聚糖溶解于20 mL 1%的CH3COOH溶液中，2 g海藻酸鈉加入80 mL蒸餾水中，90 ℃水浴加熱溶解，冷卻后混合備用。

5)海藻酸鈉+聚乙烯醇：將2 g海藻酸鈉和2 g聚乙烯醇加入到100 mL蒸餾水中，90 ℃水浴加熱溶解，冷卻后備用。

6)海藻酸鈉+聚丙烯酰胺+活性炭：將2 g海藻酸鈉和2 g聚丙烯酰胺加入到100 mL蒸餾水中，90 ℃水浴加熱溶解，冷卻后加入1 g的活性炭粉末備用。

將篩選得到的突變馴化菌株接種到MRS篩選培養(yǎng)基中，44 ℃恒溫靜置培養(yǎng)48 h后收取發(fā)酵液，6 000 r/min 4 ℃離心10 min，收集菌體。用0.9%(質量體積分數)無菌生理鹽水懸浮沉淀，配成0.03 g/mL菌懸液。在90 mm無菌平皿中加入200 mL 4%CaCl2+4%硼酸的固定液，固定化材料與菌懸液按照體積比1∶1混合均勻并裝入50 mL的注射器，用注射器將混合均勻的液體滴在平皿里，形成微膠囊，使其固定化1 h后取出微膠囊并用無菌水沖洗干凈，至于PBS中保存[19]。

檢測包埋前的活菌數，記為A，稱得所制成的微膠囊總質量，記為m1，稱取1 g左右微膠囊，精確稱其質量，記為m2，微膠囊用3.0%的檸檬酸三鈉溶液置于旋渦混合器振動至完全溶解，檢測包埋后微膠囊的活菌數，記為B，并計算微膠囊的包埋率，計算公式如下：

包埋率(%)=100×B/[(A/m1)×m2]=100×(B×m1)/(A×m2)[20]。

1.6 微膠囊穩(wěn)定性研究

稱取6種微膠囊各1 g左右，分別加入9 mL模擬胃液，37 ℃恒溫培養(yǎng)，分別在反應1、2及3 h后取樣在8 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，棄上清后收集微膠囊檢測活菌數，計算微膠囊在模擬胃液中的存活率，計算公式如下：

微膠囊在模擬胃液中的存活率(%)=(反應后微膠囊活菌數/反應前微膠囊活菌數)×100。

將在模擬胃液中3 h后的微膠囊，按照1 g∶9 mL的比例加入人工腸液，在37 ℃、100 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，分別在反應0.5、1.0及1.5 h后取樣檢測活菌數，計算微膠囊在模擬腸液中的釋放率，計算公式如下：

微膠囊在模擬腸液中的釋放率(%)=(反應后微膠囊活菌數/反應前微膠囊活菌數)×100。

1.7 數據統(tǒng)計與分析

試驗結果采用SPSS 17.0軟件進行方差分析和顯著性分析，以P<0.05作為差異顯著性標準。試驗數據采用Origin 8.0作圖。

2 結果與分析

2.1 輻照劑量對存活率的影響

將不同輻照劑量輻照后的菌懸液梯度稀釋后涂布在MRS培養(yǎng)基平板上，計算出各個輻照劑量存活率，以輻照劑量為橫坐標，存活率為縱坐標，繪制存活率曲線，如圖1所示。從圖中可以看出，菌株La4017對重離子束的輻照較為敏感，隨著重離子束輻照劑量的增大，菌株存活率先下降后有所升高之后又下降；不同輻照劑量下菌株的存活率均存在顯著差異(P<0.05)；當輻照劑量大于50 Gy時，菌株存活率均低于22%。

數據點標注不同小寫字母表示表示不同輻照劑量下存活率差異顯著(P<0.05)。Data points with different lowercase letters indicate significant difference in survival rate under different irradiation doses (P<0.05).圖1 不同輻照劑量對La 4017存活率的影響Fig.1 Effects of different irradiation doses on survival rate of La 4017

2.2 突變株的篩選

挑取MRS篩選培養(yǎng)基上的單菌落，在40℃恒溫靜置培養(yǎng)連續(xù)傳代5次后，測定活菌數，計算存活率，選出存活率≥90%的菌株共7株，分別為La4017-b1、La4017-b2、La4017-c1、La4017-c2、La4017-d1、La4017-d2、La4017-d3。將這7株菌再轉移至44 ℃恒溫靜置培養(yǎng)48 h，連續(xù)培養(yǎng)5代，測定活菌數，計算存活率，得到存活率≥90%以上突變株La4017-d1，如表1所示。從表中可以看出，原始菌株在40和44 ℃下的存活率都<90%，且在MRS篩選培養(yǎng)基中無法生長；不同輻照劑量下的菌株，培養(yǎng)溫度越高，菌株的存活率越低，44 ℃時菌株的存活率均低于40 ℃時；突變株La4017-d1在44 ℃的存活率≥90%，可達到92.3%，而其他突變株44 ℃存活率均<90%。

表1 重離子束輻照誘變La 4017篩選突變株Table 1 Screening mutant strains of La 4017 mutated by heavy ion-beam irradiation

2.3 突變株La 4017-d1的遺傳穩(wěn)定性

為驗證篩選得到的突變株La4017-d1的遺傳穩(wěn)定性，將原始菌株接種于MRS培養(yǎng)基中并將突變株接種于MRS篩選培養(yǎng)基中，44 ℃恒溫靜置培養(yǎng)48 h，分別檢測連續(xù)傳代1、2、3、4及5次時的活菌數，計算存活率，如圖2所示。從圖中可以看出，原始菌株連續(xù)傳代1～3次時存活率顯著下降(P<0.05)，傳代3次后存活率﹤40%，而突變株連續(xù)傳代1～5次，菌株存活率均≥90%，且無顯著差異(P>0.05)，說明突變株La4017-d1存活率高且穩(wěn)定性強，可穩(wěn)定遺傳。

2.4 突變株La 4017-d1微膠囊的制備

突變株La4017-d1接種于MRS篩選培養(yǎng)基中，44 ℃恒溫靜置培養(yǎng)48 h，測定活菌數為2.63×108CFU/mL。采用不同壁材包埋突變株La4017-d1形成的微膠囊形態(tài)如圖3所示。從圖中可以看出，6種壁材包埋后的微膠囊均為表面光滑、大小均一的小球。

數據柱標注不同小寫字母表示不同傳代次數下同一菌株存活率差異顯著(P<0.05)。Data columns with different lowercase letters indicate significant difference in survival rate of the same strain under different passage times (P<0.05).圖2 菌株的遺傳穩(wěn)定性Fig.2 Genetic stability of strain

圖3 不同壁材包埋微膠囊形態(tài)Fig.3 Morphology of microcapsules in different wall materials

收集不同壁材包埋后的微膠囊，檢測微膠囊直徑、粒重、活菌數，計算包埋率，如表2所示。從表中可以看出，除海藻酸鈉+聚乙烯醇+活性炭微膠囊外，其余5種微膠囊直徑及總重量無顯著差異(P>0.05)；除海藻酸鈉和海藻酸鈉+聚乙烯醇+活性炭這2種微膠囊活菌數無顯著差異(P>0.05)外，其余4種微膠囊活菌數差異顯著(P<0.05)；海藻酸鈉+聚乙烯醇微膠囊活菌數和包埋率顯著高于其他5種包埋材料(P<0.05)，包埋率達到82.67%。

表2 不同壁材包埋微膠囊特性Table 2 Characteristics of microcapsules in different wall materials

2.5 突變株La 4017-d1微膠囊的穩(wěn)定性

6種微膠囊在模擬胃液中隨時間變化的存活率及在模擬腸液中隨時間變化的釋放率如表3所示。從表中可以看出，不同微膠囊在模擬胃液中的存活率隨時間的延長而降低，在模擬胃液中2 h后存活率下降較為緩慢；海藻酸鈉+聚乙烯醇微膠囊在模擬胃液中2及3 h后的存活率顯著高于其他5種微膠囊(P<0.05)，在模擬胃液中3 h后存活率達到68.02%。不同微膠囊在模擬腸液中隨著時間的延長釋放率升高，海藻酸鈉微膠囊在模擬腸液中釋放速度最快，在0.5 h后釋放率達到85.10%，顯著高于其他5鐘微膠囊(P<0.05)，海藻酸鈉+聚乙烯醇微膠囊次之，海藻酸鈉+聚乙烯醇微膠囊在模擬腸液中1.0及1.5 h后釋放率顯著高于其他5種微膠囊(P<0.05)，在1.5 h后釋放率達到96.04%。

表3 不同壁材包埋微膠囊的穩(wěn)定性Table 3 Stability of microcapsules in different wall materials %

續(xù)表3微膠囊Microcapsules模擬胃液中1h后存活率Survivalrateinsimulatedgastricjuiceafter1h模擬胃液中2h后存活率Survivalrateinsimulatedgastricjuiceafter2h模擬胃液中3h后存活率Survivalrateinsimulatedgastricjuiceafter3h模擬腸液中0.5h后釋放率Releaserateinsimulatedintestinaljuiceafter0.5h模擬腸液中1.0h后釋放率Releaserateinsimulatedintestinaljuiceafter1.0h模擬腸液中1.5h后釋放率Releaserateinsimulatedintestinaljuiceafter1.5h海藻酸鈉+聚乙烯醇Sodiumalginate+polyvinylalcohol78.32±0.01e70.12±0.11f68.02±0.15e82.18±0.05d95.05±0.08e96.04±0.01d海藻酸鈉+聚乙烯醇+活性炭Sodiumalginate+polyvinylalcohol+activecarbon83.25±0.15f69.02±0.16e60.00±0.11d80.52±0.03c85.71±0.01c94.40±0.07c

3 討 論

大量研究表明，重離子束輻照后菌株存活率隨輻照劑量的增加呈現先減小后增加又減小的馬鞍形劑量-效應曲線，這是重離子所特有的質量沉積效應的體現[21]。本研究中，在輻照劑量為0～175 Gy時，隨著輻照劑量的增加，La4017存活率存在先降低后升高而后又下降的馬鞍形曲線，與前人研究結果一致。不同菌株對于輻照劑量的耐受不同，彭軼楠等[22]研究發(fā)現，在150 Gy輻照劑量下誘變效果最佳，在該劑量下篩選得到效降解有機磷的1株枯草芽孢桿菌。李壟清[23]研究發(fā)現，酵母菌株的半致死劑量約為100 Gy，并在此劑量下篩選得到了1株高產β-葡聚糖酵母菌株。嗜酸乳桿菌相比于芽孢桿菌、酵母菌對重離子束較為敏感，在輻照劑量大于50 Gy時，菌株的存活率急速下降，這是因為隨著重離子累積注入量的增加，細胞表面損傷嚴重，能量沉積及動量傳遞繼續(xù)對菌株產生損傷，使其致死率呈上升趨勢。在輻照劑量50、75、100 Gy下雖均能得到在MRS篩選培養(yǎng)基中生長的菌株，但在40、44 ℃下菌株傳代5次的存活率存在差異，在100 Gy輻照劑量下菌株40、44 ℃下存活率高于50 Gy輻照劑量下菌株的存活率。

本研究在以海藻酸鈉為單一包埋材料的基礎上，研究了添加聚乙烯醇、明膠、活性炭、聚丙烯酰胺、殼聚糖包埋材料所形成微膠囊的特性。復配壁材包埋相比于海藻酸鈉單獨包埋，包埋率和模擬胃液存活率都顯著提高。不同的復配材料包埋效果不同，以海藻酸鈉和聚乙烯醇為包埋材料制備得到的微膠囊包埋率達到82.67%，顯著高于其他5種微膠囊；在模擬胃液中2及3 h后的存活率顯著高于其他5種微膠囊，模擬胃液中3 h后存活率達到68.02%。Bajaj等[24]以海藻酸鈉和微晶纖維素為壁材制備發(fā)酵乳桿菌微膠囊，該微膠囊在模擬胃液中存活率達到52.3%。Nazzaro等[25]將嗜酸乳桿菌包埋于海藻酸鈉-菊粉-黃原膠微膠囊中，菌體存活率及對胃酸的耐受性明顯提高，在胃液中存活率達到63.2%。Huq等[26]利用海藻酸鈉和卵磷脂復配包埋鼠李糖乳桿菌得到的微膠囊耐胃酸能力得到提高，在胃液中存活率達72.4%。Khan等[27]以海藻酸鈉和豌豆蛋白包埋雙歧桿菌制備微膠囊，該微膠囊在胃液中存活率達到83.6%。海藻酸鈉和聚乙烯醇為包埋材料制備得到的微膠囊與目前報道的其他復配壁材包埋的微膠囊相比，能夠抵御胃液膽鹽，提高了耐胃酸能力，在胃液中存活率達到較高水平。

微膠囊在模擬腸液中的釋放率是評估微膠囊能否在腸道內定點釋放的重要指標[28]。劉媛等[29]制備聚丙烯酸鈉接枝海藻酸鈉包埋嗜酸乳桿菌制備微膠囊，在模擬腸液中釋放5 h后的釋放率接近100%。李龍等[30]利用內源乳化凝膠法制備植物乳酸桿菌微膠囊，在腸液中3 h后的釋放率為72.91%。本試驗中，以海藻酸鈉和聚乙烯醇為包埋材料制備的突變株La4017-d1微膠囊在模擬腸液中1.5 h后的釋放率達到96.04%，與劉媛等[29]的研究結果相比，縮短了在腸液中的釋放時間；與李龍等[30]的研究結果相比，釋放率達到較高水平。微膠囊能夠快速在腸液中釋放，高的釋放率保證了腸道內嗜酸乳桿菌的活菌數，為發(fā)揮嗜酸乳桿菌的益生作用提供了保障。

4 結 論

通過重離子束12C6+對La4017進行輻照誘變，在輻照劑量為100 Gy時，通過篩選獲得遺傳穩(wěn)定的突變株La4017-d1，該突變株在44 ℃的存活率較原始菌株提高了40%；采用海藻酸鈉+聚乙烯醇包埋突變株La4017-d1制備得到的微膠囊，包埋率為82.67%，在模擬胃液中反應3 h后的存活率達到68.02%，在模擬腸液中反應1.5 h后的釋放率達到96.04%，說明海藻酸鈉+聚乙烯醇包埋突變株La4017-d1獲得的微膠囊能夠抵御胃液強酸環(huán)境，并在腸道中定植釋放。